Remisiunea completă susținută de leucemie limfocitară cronică CLL asociată cu utilizarea unui extract din plante chinezești: raport de caz

 

Raportăm cazul unui bărbat cu leucemie limfocitară cronică (CLL) care, în absența chimioterapiei citotoxice, a început să ia un extract din plante chinezești.

La scurt timp după aceea, a suferit o scădere constantă a limfocitelor și adenopatiei sale și rămâne în remisiune acum peste 10 ani.

Extractul din plante a inhibat supraviețuirea celulelor leucemie limfocitară cronică CLL primare în condiții de cultură in vitro. Cu toate acestea, nu a inhibat activarea kinazei Akt sau MAP, nici nu a inhibat fosforilarea serinică a STAT1. Astfel, printr-un mecanism încă necunoscut, acest extract pare să exercite efecte pro-apoptotice în leucemie limfocitară cronică CLL.

Abrevieri: ALC, numărul limfocitelor absolute; CLL, limfocite cronice
leucemie; FBS, ser fetal bovin; STAT, traductor de semnal și
activator de transcripție; WBC, globule albe

Introducere
Pacientul, un bărbat în vârstă de 57 de ani, și-a prezentat la medic în decembrie 1990 cu simptome asemănătoare gripei și oboseală, și s-a constatat că are numarul de celule sanguină albe  (WBC) de 39.400, cu mai mult de 90% limfocite hemoglobina 13.1 și numărul de trombocite de 280.000. un frotiu de sânge a arătat o preponderență de apariție matură limfocite. Biopsia măduvei osoase a scos la iveală o infiltrație de limfocite reprezentând 64% din celularitate. cu blândețe ganglionii limfatici extinsi cervicale, axilare și inghinale au fost detectati la examinare și scanarea CT a pieptului și a abdomenul a arătat o creștere ușoară și axilară și paraorală pt ganglionii limfatici. Imunofenotipul a relevat o populație de Celule CD19 + care au fost monoclonale pentru lanțul ușor kappa, și CD5 slab exprimat. Analiza PCR a demonstrat o rearanjarea lanțului greu de imunoglobulină clonală.
În iulie 1991, pacientul a avut un număr de WBC de 60.000.
În acel moment, el a consultat cu un practicant medicina chineza , care a început să-i ofere un amestec de plante pe care pacientul l-a descris ca si crengi, rădăcini și coajă. pacientului i s-a spus să fiarbă în apă, lăsați amestecul să se răcească și se concentrează prin evaporare, apoi tulpina și bea zilnic.
Ulterior, numărul de pacienți la WBC și limfocitele absolute numărul (ALC) a scăzut constant (figura 1), și limfadenopatia rezolvată. Până în martie 1992, numărul WBC
a fost de 10.000 cu limfocite 13%. În martie 1993, Numărul WBC a fost de 5300 cu 25% limfocite. Atunci, biopsia măduvei osoase a arătat 16% limfocite. Citometrie în flux
în acest moment nu mai a fost descoperită o populație clonală de limfocite compatibile cu leucemia limfocitară cronică (LLC). Pacientul a călătorit extensiv pentru slujba sa. O notație într-un dosar medical a indicat că atunci când nu a reușit
pentru a avea acces la extractul din plante timp de 2 luni, WBC-ul a crescut, deși documentarea valorilor nu a fost disponibila.
Pacientul a părăsit ulterior țara timp de 4 ani.
Când sa întors în martie 1997, lua extrasul doar săptămânal. Conținutul său în WBC în martie 1997 a fost de 6300 cu 24% limfocite. A menținut valorile hematologice normale
prin ultima sa vizită din septembrie 2000, fără ca niciodata sa fi primit chimioterapie citotoxică standard. La care timp, el nu a avut nici o adenopatie periferică, și nu a existat nici o dovada ale unei populații clonale de limfocite în periferic sânge fie prin citometrie în flux, fie prin analiză PCR pentru modificări ale genei imunoglobulinice.

a plecat din nou din tara si a intrerupt extractul de plante. El a rămas într-o completa hematologică remisie pentru o perioadă suplimentară de 1 an și jumătate.

Figura 1. (A) Numărul total de celule albe din sânge (WBC) și (B) limfocite absolute
numărul (ALC) pacientului înainte și după inițierea terapiei cu extracte plante . Pauzele în curbe reprezintă timpul în care pacientul era în străinătate și fără extras, în care a fost raportat că a experimentat o crește în WBC și ALC.

 

vezi PDF pentr figuri battle2003

 

2. Materiale și metode
2.1. Prepararea extractelor
Pacientul a pregătit extractul din plante așa cum este descris în
Secțiunea 1. În septembrie 2000, el a oferit aproximativ 10 ml din acest material pentru evaluare. Era groasă, întunecat maro, lichid tulbure, cu miros mic. Materialul a fost sterilizat prin trecerea printr – un filtru de 0,22 μM, alicotat și înghețat la -20 ◦ C până la utilizare. Ceaiul negru și ceaiul verde (Lipton) au fost preparate în conformitate cu instrucțiunile producătorului, răcit, filtrat sterilizat și utilizat în modul descris.
2.2. Testul de supraviețuire in vitro a celulelor CLL
Celulele CLL au fost obținute din sângele periferic netratat după obținerea consimțământului informat. mononucleare celulele au fost separate prin centrifugare cu densitate și înghețate înainte de utilizare. Pentru testele de supraviețuire, celulele au fost dezghețate, și numărul de celule viabile a fost determinat. Celulele au fost cultivate
în RPMI / 1640 conținând 10% ser fetal de bovină (FBS).
Doar celulele cu viabilitate mai mare de 97% au fost utilizate pentru supraviețuire
testele. Celulele au fost resuspendate la o densitate de 10 × 106 celule / ml și cultivate în prezența extractului din plante, ceai negru  sau ceai verde la diluțiile indicate. Densitatea celulelor a fost determinată prin numărarea celulelor utilizând un hemocitometru la
timpul de inițiere a culturii și la fiecare 24 de ore după aceea. Viabilitate
a fost determinată prin excluderea de albastru de tip trypan.
2.3. Analiza activării celulelor
căi de semnalizare
Celulele CLL au fost cultivate în RPMI / 1640 conținând 10% ser fetal bovin. Celulele hemangiosarcomului SVR [1] au fost cultivate în DMEM cu conținut scăzut de glucoză conținând 10% FBS. celulele au fost incubate cu extractul din plante timp de 3 ore (CLL) sau 1 h (SVR) la 37 ° C și apoi recoltate pentru analiza Western blot.
Celulele s-au lizat în tampon conținând 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 250 mM NaCI, 0,5% NP40, 2 mM ortovanadat de sodiu, 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil și
2 mg / ml de pepstatină. Cantități egale de proteine ​​au fost rezolvate pe geluri SDS-poliacrilamidă 7% și transferate la membrana de nitroceluloză. Bloturile au fost incubate cu un anticorp care recunoaște forma fosforilată serică din STAT1 (Ser 727) [2], forma fosforilată a Akt (Ser 473) sau forma fosforilată a MAP p44 / 42 kinază (Thr202 / Tyr204) (Cell Signaling Laboratories, Beverly, MA) folosind 1: 10.000 (Ser-P-STAT1) sau 1: 5000 (P-Akt și P-MAPK) a anticorpului în Tris-tamponat soluție salină / 0,05% Tween 20 (TBST). Bloturile au fost dezbrăcate și re-probate cu anticorpi care recunosc fosforilarea
și formele nefosforilate ale STAT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SC-346), Akt sau p44 / 42
MAP kinaza (Cell Signaling Laboratories, Beverly, MA) utilizând o diluție 1: 20,000 (STAT1) sau 1: 5000 (Akt și MAPK) din anticorpi. Bloturile au fost incubate cu capra
contra-iepure de hrean peroxidază-secundare conjugate anticorpii (Calbiochem, La Jolla, CA) și detectarea a fost realizată cu ECL chemiluminiscentă renascentistă kit (NEN Dupont, Boston, MA).

2.4. Amplificarea PCR a transcriptelor V (D) J
ARN a fost extras din celulele 2 × 106 B folosind Kit RNA total RNA (Qiagen, Valencia, CA). ARNm a fost invers transcrierea folosind Preamplificarea Super-Script Sistem pentru sinteza primului catenar cADN (Life Technologies, Carlsbad, CA). Regiunile VH-DJH-CH s-au amplificat utilizând sens primeri specifici pentru secvențele diferitelor Familii VH împreună cu primeri antisens specifici pentru secvența CH1 și polimeraza ADN Pfu Turbo (Stratagene, La Jolla, CA). Fiecare reacție a constat din 30 cicluri (denaturare 1 min la 94 ° C, recoacere la min 58 ° C, prelungire de 1 min la 72 ° C și prelungire de 10 min la
72 ◦C). Produsele ADNc PCR s-au purificat, s-au ligat în vector pCR-Blunt II-TOPO (kit de clonare Zero Blunt TOPO; Invitrogen, Carlsbad, CA) și transfectate în TOP10 One
Sisteme de celule competente (Invitrogen). Au fost colonii bacteriene selectate pentru secvențiere și au fost secvențiate 30 de clone. Nu au fost două colonii au aceeași secvență IgH, indicând absența unui produs clonal.

3. Rezultate
Având în vedere corelația temporală puternică dintre initierea de catre pacient a acestui ceai pe baza de plante, remisia moleculară pe care a experimentat-o ​​din CLL, am examinat dacă acest extract a afectat supraviețuirea celulelor CLL în timpul culturii in vitro. Celule CLL de la două loturi diferite netratate pacienții au fost cultivați în mediu conținând ser în prezența sau absența extractului din plante. Avand in vedere
cantitatea mică de extract disponibil, a fost necesară pentru a testa materialul nefracționat, mai degrabă decât pentru a încerca a separarea parțială a componentelor. Astfel, pentru a controla efectul concentrației dizolvate, ceaiul negru și verde, fiecare
din care se presupune că prezintă activitate anticanceroasă [3,4], au fost de asemenea utilizate ca martori. Primele celule CLL au o fracție de creștere foarte scăzută și nu arată nici o proliferare în vitro. Cu toate acestea, atunci când cultivate timp de până la 48 de ore, viabilitatea din celule rămâne intactă. Prin contrast, celulele au fost cultivate
în prezența extractului din plante au arătat o viabilitate scăzută la 24 și 48 de ore de cultură (figura 2). Viabilitatea celulelor CLL a fost afectată minim în prezența de negru sau verde ceai.
Pentru a determina mecanismul prin care extractul din plante inhibicultivate în DMEM cu conținut scăzut de glucoză conținând 10% FBS.

în viabilitatea celulelor CLL, ne-am concentrat pe trei căi care pot juca un rol în biologia CLL. STAT factorii de transcripție sunt fosforilați în serină în CLL dar nu și în celulele B normale [2] și pot fi implicate în promovarea supraviețuirii acestor celule [5-7].

Figura 2. Viabilitatea CLL în prezența extractului din plante, a ceaiului negru sau a ceaiului verde. Celulele CLL de la doi pacienți separați au fost cultivate timp de 48 ore în prezență din extractul din plante, ceaiul negru sau ceaiul verde la diluțiile indicate. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin excluderea albastră de trypan la fiecare 24 de ore.  numărul Celule relativ a fost determinat prin compararea numărului de celule din proba tratată cu cel al celulelor netratate (Untx). Rezultatele sunt exprimate ca medie
± eroare standard de medie.
In orice caz, tratamentul celulelor CLL primare cu extractul pe bază de plante
nici un efect asupra nici expresiei STAT1, nici asupra fosforilării sale pe serina 727 (figura 3A). Două alte cascade de semnalizare cunoscute pentru a promova supraviețuirea celulară sunt fosfoinozitida 3-kinază (PI3K) / calea Akt [8] și kinaza Mek / MAP-calea [9]. Deși ambele căi pot juca a rol în supraviețuirea celulelor CLL, nivelul lor de activare în celulele CLL primare sunt relativ scăzute, limitând capacitatea de a
detecta inhibarea lor. Pentru a evalua capacitatea extractului din plante
pentru a inhiba aceste căi, celulă derivată din endoteliu linie SVR, care afișează activarea proeminentă a ambelor Akt și kinaza MAP [1]. Nici PI3K / Akt nici calea Mek / MAP kinazei nu au fost inhibate de extractul de ceai din plante la concentrațiile examinate
(Figura 3B).
4. Discutie
Deși produsele naturale au fost sursa multor medicamente importante din punct de vedere medical, și remediile pe bază de plante câștigă creșterea acceptabilității populației, identificarea clinica a  compușilor utili din surse de plante este o întreprindere dificilă.
Remisia clinică și moleculară completă a  CLL în absența terapiei este extrem de neobișnuit eveniment și se întâmplă probabil la mai puțin de 1% din cazuri [10].
Asocierea sa cu utilizarea unui extract din plante ridică întrebarea dacă o substanță din acest material poate mediaze un efect antitumoral. Dacă da, mai multe mecanisme potențiale ar putea fi luate în considerare. O posibilitate este că o substanță în
extractul din plante a ajutat la generarea unui imun răspuns la CLL pacient. Mai multe observații ar contesta această posibilitate

Figura 3. Analiza Western blot a efectului extractului de plante pe celular
căi de semnalizare. (A) celulele CLL și (B) celulele SVR au fost incubate
cu sau fără extract de plante (Untx) la diluțiile indicate anterior
recoltare pentru analiza Western blot. Bloturile au fost analizate cu anticorpi
specific pentru forma seron fosforilată a STAT1, fosforilată forma de Akt sau forma fosforilată a MAPK. Bloturile au fost dezbrăcate și re-probate cu anticorpi care recunosc atât nefosforilați și forme fosforilate ale fiecărei proteine. STAT1 are două izoforme de
91 kDa (STAT1p) și 84 kDa (STAT1p); numai STAT1? conține site-ul
de fosforilare a serinei. MAPK are două izoforme de 44 kDa (Erk1) și
42 kDa (Erk2), ambele putând deveni fosforilate.
. În primul rând, se crede că celulele CLL a fi vaccin relativ ne-imunogene și sofisticate strategiile sunt necesare pentru a genera recunoașterea imunității pt Celulele CLL [11]. În al doilea rând, o scădere a numărului total de leucocite și numărul total de limfocite a apărut aproape concomitent cu inițierea extractului de plante. Majoritatea celor strategii bazate pe imunitate , cum ar fi perfuzia sau vaccinarea limfocitelor donatoare,
la om sunt asociate cu o întârziere de câteva luni înainte de detectarea efectului terapeutic [12]. În cele din urmă, observarea ca raspunsul tumorii s-a oprit temporar
întreruperea tratamentului ar fi, de asemenea, împotriva unui imunitar efect.Mai probabil, extractul din plante a acționat direct ca inhibitor al supraviețuirii CLL, fapt susținut de experimente in vitro.
Având în vedere absența aparentă a efectelor secundare cu experiență de către acest pacient, iar hematopoieza normală a fost menținută în timp ce luați acest medicament pe bază de plante pentru o perioadă de 9 ani, un astfel de agent activ trebuie să fie destul de puternic și să aibă un nivel ridicat indice terapeutic. Polifenoli prezenți în ceaiuri și pe bază de plante extractele au fost descrise ca având acțiuni pro-apoptotice
[4]. Cantitatea mică de material furnizată pentru laborator evaluarea exclude o analiză a componentelor active sau a evaluarea mecanică detaliată a efectului inhibitor asupra
Supraviețuirea celulelor CLL. Cu toate acestea, trei potențiali intracelulari mediatorii, STAT1, PI3K / Akt și Mek / MAP kinaza nu sunt modulate de extractul din plante. Dacă devine mai mult material disponibil, ar merita să ne concentrăm pe proteine care reglementează supraviețuirea și apoptoza în celulele CLL, cum ar fi membrii familiilor bax și bcl-2. Direcționarea unor astfel de molecule ar putea explica scăderea supraviețuirii CLL în absența toxicității clinice aparente. În plus,există o prioritate pentru r modularea membrilor familiei bcl-2, de exemplu prin fosforilare, prin anticancer derivat din plante agenți cum ar fi taxotere [13,14].
În rezumat, acest pacient a prezentat o susținere completă remisia clinică și moleculară a CLL, în absența oricarei chimioterapii citotoxice. Această remisie a fost asociată
cu utilizarea pe termen lung a unui extract din plante care a fost găsit
pentru a scădea supraviețuirea celulelor CLL primare in vitro.

In timp ce mecanismul de acțiune nu este în prezent înțeles, acest lucru
observarea poate reprezenta un prim pas important spre dezvoltarea unei noi clase de agenți pentru a fi folosită în acest caz boala incurabila.
Recunoasteri
Autorii multumesc Dr. Agnes Pasquier-Castro pentru esentiale
contribuții clinice. Această lucrare a fost susținută de NIH
acordă CA93053, CA79547 și CA 81534, precum și familia
și prietenii lui Amanda Hendricks.
Contribuțiile. T.E. Bătălia a contribuit la acest concept
și proiectarea, analiza și interpretarea datelor, redactarea
articolul, cu condiția revizuirilor critice, a dat aprobarea finală
și a ajutat la colectarea și montarea datelor. H.
Castro-Malaspina a oferit revizuiri critice ale articolului,
a dat aprobarea finală și a furnizat materiale de studiu. J.G.
Gribben a contribuit la analiza și interpretarea datelor, cu condiția
revizuiri critice, a dat aprobarea finală și a ajutat la colectare
și asamblarea datelor. D.A. Frank a contribuit la acest concept
și proiectarea, analiza și interpretarea datelor, redactarea
hârtia, a oferit revizii critice și a dat aprobarea finală.
Referințe
[1] Arbiser JL, Moses MA, Fernandez CA, Ghiso N, Cao Y, Klauber N,
și colab. H-ras oncogene stimulează angiogeneza tumorală prin două distincte
cai. Proc Natl Acad Sci 1997; 94: 861-6.
T.E. Battle și colab. / Leukemia Research 27 (2003) 859-863 863
[2] Limfocitele lui Frank DA, Mahajan S, Ritz J. B de la pacienți
cu leucemie limfocitară cronică conțin STAT1 și STAT3
constitutiv fosforilate pe resturile serinice. J Clin Invest
1997; 100: 3140-8.
[3] Chung JY, Huang C, Meng X, Dong Z, Yang CS. Inhibarea
activarea proteinei 1 activă și creșterea celulelor prin ceaiul verde purificat și
polifenoli ai ceaiului negru în celule transformate H-ras: structura-activitate
relația și mecanismele implicate. Cancer Res 1999; 59:
4610-7.
[4] Yang GY, Chen L, Lee MJ, Landau JM. Inhibarea creșterii și
inducerea apoptozei în celulele canceroase umane prin polifenoli de ceai.
Carcinogeneza 1998; 19: 611-6.
[5] Lin TS, Mahajan S, Frank DA. STAT semnalizare în patogeneză
și tratamentul leucemiilor. Oncogene 2000; 19: 2496-504.
[6] Battle TE, Frank DA. Rolul STAT în apoptoza. Curr Mol
Med 2002; 2: 381-92.
[7] Frank DA, Mahajan S, Ritz J. Imunosupresia indusă de fludarabină
este asociat cu inhibarea semnalizării STAT1. Natură
Med 1999; 5: 444-7.
[8] Sun M, Wang G, Paciga JE, Feldman RI, Yuan Z-Q, Ma X-L, et
Al. AKT1 / PKBa kinaza este frecvent crescută la cancerele umane și
activarea sa constitutivă este necesară pentru transformarea oncogenică în
Celulele NIH3T3. Am J Pathol 2001; 159: 431-7.
[9] Ballif BA, Blenis J. Mecanisme moleculare de mediere a mamiferelor
mitogen-kinaza activată (MAPK) kinază (MEK) -MAPK
semnale de supravietuire. Cell Growth Diff 2001; 12: 397-408.
[10] Ribera JM, Vinolas N, Urbano-Ipizua A, Gallart T, Montserrat
E, Rozman C. Remisiuni complete „spontane” în cronice
leucemie limfocitară: raportul a trei cazuri și revizuirea
literatură. Cell Cells 1987; 12: 471-9.
[11] Wierda WG, Cantwell MJ, Woods SJ, Rassenti LZ, Prusak
CE, Kipps TJ. Terapia genică a ligandului CD40 (CD154) pentru cronică
leucemie limfocitară. Blood 2000; 96: 2917-24.
[12] Collins RHJ, Shpilberg O, Drobyski WR, Porter DL, Giralt S,
Champlin R, și colab. Donatorii de infuzii de leucocite la 140 pacienți cu
malignitate recidivantă după transplantul de măduvă osoasă alogenă. J
Clin Oncol 1997; 15: 433-44.
[13] Berchem GJ, Bosseler M, Mina N, Avalosse B. Gama Nanomolar
docetaxelul sensibilizează celulele MCF-7 la chimioterapia indusă
apoptoza, induce oprirea G2M și fosforilază bcl-2. anticancer
Res 1999; 19: 535-40.
[14] Kolfschoten GM, Hulscher TM, Duyndam MC, Pinedo HM,
Boven E. Variație în cinetica activării caspazei-3, Bcl-2
fosforilarea și morfologia apoptotică la omul neselectat
linii celulare de cancer ovarian ca răspuns la docetaxel. Biochem
Pharmacol 2002; 63: 733-43.

 

Leuk Res. 2003 Sep; 27 (9): 859-63.
Remisiunea completă susținută a CLL asociată cu utilizarea unui extract din plante chinezești: raport de caz și analiză mecanică. , Bătălia TE1, Castro-Malaspina H, Gribben JG, Frank DA.
Departamentul de Oncologie Medicală, Institutul de Cancer Dana-Farber, 44 Binney St., Boston, MA 02115, SUA.

PMID: 12804645

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12804645

3 gânduri despre „Remisiunea completă susținută de leucemie limfocitară cronică CLL asociată cu utilizarea unui extract din plante chinezești: raport de caz

  1. Pingback: Despre dieta cancer functie de metabolismul fiecaruia, conform cu dr Wiliam Donald Kelley si Dr Nicola Gonzales | TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.