Efectele anticasectice ale plantei naturale Coptidis rhizoma și berberină asupra șoarecilor care suferă de colon 26 / adenocarcinomul

Am arătat anterior că planta naturală Coptidis rhizoma are un efect anticasectic la șoarecii nudi care poartă celule canceroase esofagiene umane. Am investigat în continuare acest fenomen prin examinarea efectului anticasetic al C. rhizoma la șoareci sângerini care purtau celule de carcinom de colon 26 / clona 20, care cauzează cașexia cu IL-6 după injectarea celulelor. Am evaluat parametrii nutritivi cum ar fi nivelul de glucoză din ser și pierderea țesutului adipos și a mușchilor la șoarecii purtători de tumori și non-tumorali tratați cu supliment de Coptidis  rhizoma (CR) sau cu o dietă normală. Nivelurile IL-6 la acei șoareci au fost cuantificate prin ELISA și RT-PCR în timp real. Suplimentarea cu Coptidis  rhizoma CR a atenuat în mod semnificativ scăderea în greutate la șoarecii purtători de tumori, fără a schimba aportul alimentar sau creșterea tumorală. Mai mult, acesti șoareci au menținut un nivel nutrițional bun. Nivelurile mRNA ale IL-6 în tumorile și splinele și nivelele de proteină IL-6 în tumori și seruri au fost semnificativ mai mici la șoarecii purtători de tumori tratați cu supliment Coptidis  rhizoma CR decât la cei tratați cu o dietă normală. Suplimentarea cu Coptidis  rhizoma CR nu a afectat aportul alimentar, greutatea corporală, parametrii nutriționali și nivelele IL-6 la șoarecii care nu poartă tumori.

Un studiu in vitro a arătat că C. rhizoma și componenta sa principală, berberină, au inhibat exprimarea ARNm IL-6 indusă de IL-1 într-o manieră dependentă de doză în celulele de colon 26 / clona 20. Rezultatele noastre au arătat că C. rhizoma exercită un efect anticasectic asupra șoarecilor transplantate de colonul 26 / clona 20 și că efectul său este asociat cu producerea de IL-6 tumorală. De asemenea, sugerăm că efectul său s-ar putea datora berberinei. 

plantele medicinale traditionale chinezesti TCM / CHM si koreene si formulele derivate cu si din acestea le cautati dupa nume pe

http://www.activeherb.com/

http://www.activeherb.com/chineseherbs

http://www.activeherb.com/extract/huanglian.shtml

 

Cancer casexia este un sindrom paraneoplastic caracterizat prin pierdere în greutate, anorexie și slăbiciune profundă care apare la cele mai multe malignități. IL-6, un mediator produs de tumori sau gazdă ca rezultat al interacțiunii tumori-gazdă, se consideră că joacă un rol important în casexia indusă de cancer, sugerând că reducerea nivelului de IL-6 poate îmbunătăți cașexia sau malnutriția la pacienții cu cancer. 3 – 6 Într-adevăr, un anticorp anti-IL-6 receptor a fost demonstrat că împiedică cașexia indusă de cancer într-un model de rozătoare. De asemenea, acetatul de medroxiprogesteron (MPA), un derivat sintetic al progesteronului, are activitate anticachetică, probabil datorată în parte suprimării secreției de IL-6 din celulele tumorale. Astfel, blocarea funcției IL-6 poate fi o intervenție utilă pentru tratamentul pacienților cu sarcină cachectică. Deoarece acești pacienți au, de obicei, o calitate slabă a vieții, este esențial să le tratați cu efecte adverse minime. Aceste constatări și considerații ne-au determinat să căutăm un agent nou capabil să inhibe IL-6 cu toxicitate redusă.

Din punctul de vedere al furnizării unei terapii ușoare, ne-am concentrat pe utilizarea ierburilor în tratamentul cancerului. Într-un studiu anterior, am identificat Coptidis rizom ca agent care posedă o activitate antitumorală puternică. 8 , 9 De asemenea, am arătat că C. rhizoma a atenuat semnificativ scăderea în greutate la șoarecii nudi care poartă celulele canceroase esofagiene producătoare de IL-6 la o doză care nu modifică creșterea tumorală.Cu toate acestea, nu am reușit să clarificăm relația dintre IL-6 și efectul anticachetic al C. rhizoma în acest model. Un alt studiu a arătat că inocularea sc a colonului 26 / clona 20 de celule de carcinom de colon murin în șoareci syngeneic determină pierderea progresivă în greutate, țesutul adipos și pierderea mușchilor și alte tulburări de homeostazie asociate cu cașexia. Deoarece este probabil ca IL-6 să fie unul dintre mediatorii critici la acești șoareci care poartă carcinomul colon 26 / clona 20, am folosit acest model pentru a examina legătura dintre efectul anticachetic al C. rhizoma și IL-6. Probele au fost analizate prin RT-PCR și ELISA în timp real. Am măsurat mRNA de IL-6 și nivele de proteine ​​în țesuturile de șoareci tratați cu supliment de C. rhizoma (CR) sau cu dieta normală.

MATERIAL SI METODE

agenţi

Pulberea de Coptis rhizoma a fost făcută din Coptis japonica Makino prin fierbere în apă și uscare prin pulverizare la Tsumura (Tokyo, Japonia). 9 , 10 , 12 Berberina, o componentă majoră a C. rhizoma, a fost achiziționată de la Wako (Osaka, Japonia). Deoarece remediile pe bază de plante la om sunt administrate, în general, la cererea liberă a pacienților, am proiectat o dietă cu șoareci care conține planta sau berberina care a permis consumul zilnic gratuit. C. rhizoma a fost încorporată în dieta de creștere F1 la o concentrație finală de 1% (10 mg / g) sau 2% (20 mg / g), în timp ce berberina a fost adăugată la o concentrație finală de 0,1% (1 mg / g) 0,4% (4 mg / g) la Fermele Funabashi (Funabashi, Japonia). Pentru studiul in vitro , C. rhizoma a fost dizolvat în apă distilată la o concentrație de 30 mg / ml și berberina a fost resuspendată în DMSO la o concentrație de 6 mg / ml. Aceste soluții au fost preparate înainte de studiul in vitro și apoi amestecate în mediu de cultură. Concentrația finală de DMSO a fost menținută la <0,1% pentru a evita efectele sale inhibitoare asupra proliferării celulelor de colon 26 / clona 20. IL-1a de la șoarece a fost achiziționat de la PreproTech (Londra, UK).

Proiectarea studiilor pe animale

Șoareci BALB / c masculi de șase săptămâni au fost achiziționați de la Japan SLC (Hamamatsu, Japonia). Celulele Colon 26 / clona 20 (Centrul de Cercetare Nippon Roche, Kamakura, Japonia) au fost injectate sc (1 x 106 celule tumorale / animal) cu un ac de calibru 27 în cvadrantul abdominal inferior drept așa cum a fost descris anterior. 11 Volumele tumorilor au fost măsurate cu un șubler alunecător și calculate prin următoarea formulă: ( a× b 2 ) / 2, unde a este mai mare și b este cea mai mică dintre cele două dimensiuni. 13 Dieta standard F1 de reproducere care conține berberină sau C. rhizoma a fost furnizată de la 4 zile înainte de injectarea celulelor de colon 26 / clona 20 până când animalele au fost ucise.Dieta de reproducere singură a fost administrată pentru controlul șoarecilor. Volumul tumorii și greutatea corporală au fost măsurate o dată la 2 zile după injectarea celulelor (fig.1a , b ). Alimentarea cu alimente a fost măsurată o dată la fiecare 2 zile pe tot parcursul experimentului și calculată ca medie a 3 șoareci per cuvă (Figura 1c ). Toți șoarecii au suferit dislocări cervicale la 14 zile după injectarea celulelor și probele de tumoare, ficat, splină și ser au fost colectate și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Pentru a investiga efectele C. rhizoma asupra șoarecilor care nu poartă tumori, am stabilit două seturi de control bazate pe metoda descrisă de Bing și colab . 14 în grupul hrănit cu perechi, fiecare animal a fost hrănit cu perechi pentru a se potrivi cu aportul de hrană al unui șoarece cu colon 32 / clonă 20. În grupul hrănit în mod liber, toate animalele au fost hrănite în mod liber pe tot parcursul experimentului. Acești șoareci au fost tratați cu supliment CR sau cu o dietă normală. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea de Medicină Yamaguchi.

Efectul C. rhizoma asupra (a) greutății corporale, (b) creșterii tumorale și (c)consumului de alimente la șoareci purtând celulele de colon 26 / clona 20.Valorile reprezintă greutatea corporală medie, volumul tumoral și consumul de alimente pentru 9 șoareci din fiecare grup (cercuri solide, șoareci purtători de tumori cu dietă normală, pătrate deschise, șoareci purtători de tumori tratați cu dietă suplimentată cu CR). Barele indică SE. Celulele Colon 26 / clona 20 au indus cașexia atunci când au fost injectate în șoareci syngeneic. (a) Suplimentarea cu CR a atenuat semnificativ scăderea în greutate la șoarecii purtători de tumori comparativ cu cei hrăniți cu dieta normală ( p = 0,018 prin ANOVA cu 1 sens). (b, c)Nu s-au înregistrat diferențe statistice în ceea ce privește creșterea tumorală sau aportul alimentar între cele două grupuri experimentale.

Analiza parametrilor nutritivi

Au fost evaluați mai mulți parametri nutriționali, după cum sa descris anterior. 11 Greutatea carcasei, diferența de greutate între întregul corp și țesutul tumoral, a fost calculată. Pentru a determina întinderea țesutului adipos și a pierderii musculare, am cântărit țesutul adipos stâng epididimal stâng și, respectiv, mușchiul gastrocnemius stâng. Nivelurile de glucoză din sânge au fost determinate prin metoda enzimă-electrod cu glucozoxidază (GT-1640; Hoechst Marion Roussel, Tokyo, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza cantitativă a nivelelor IL-6 mRNA

Plasmida folosită pentru a genera curba standard conține regiunea de codificare a IL-6 de șoarece inserată în vectorul pUC119 (Takara, Kyoto, Japonia). Secvențele nucleotidice au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului (datele nu sunt prezentate). Plasmidul a fost utilizat ca ADN-ul template în intervalul de 10 3 -108 copii. ARN-ul total de la celulele de colon 26 / clona 20 a fost extras cu Trizol (GIBCO, Bethesda, MD). Patru microlitri de ARN total (1 pg) s-au transcripționat invers în 16 pl de amestec RT 15 care conține 200 unități de transcriptază revers transcriptază virusului leucemiei murine Maloney (GIBCO) la 42 ° C timp de 1 oră. S-au utilizat două microlitri de soluție cADN (echivalent cu cADN de la 100 ng de ARN inițial) pentru amplificarea PCR în timp real (LightCycler System Version 3, Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Primerii utilizați pentru a detecta ARNm IL-6 de șoarece au fost 5′-tccagttgccttcttgggac-3 ‘(sens) și 5′-gtgtaattaagcctccactact tg-3’ (antisens), care dau un produs de 140 bp. Amestecul PCR conține 2 μl amestec master (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I; Roche Diagnostics), 2,4 pl (4 mM) MgCl2, 1 pl (10 pmol) din fiecare primer, 11,6 pl apă distilată și 2 pl soluție de ADNc. Înainte de amplificare, amestecul de reacție a fost incubat timp de 10 minute la 95 ° C. Amplificarea a fost efectuată într-o procedură în ciclu în 3 etape constând din 40 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 15 sec, recoacere la 55 ° C timp de 10 sec și prelungire la 72 ° C timp de 6 secunde. După protocolul de ciclism, temperatura a crescut gradual la o viteză de tranziție de 0,1 ° C / sec. Fluorescența tuturor reacțiilor a fost monitorizată pe toată schimbarea temperaturii pentru a detecta disocierea produselor PCR și pentru a genera o curbă de topire. Produsele PCR au fost cuantificate cu un Lumi-Imager F1 (Roche Diagnostics) și ulterior au fost analizate cu software-ul LightCycler (Roche Diagnostics). Am folosit gena β-actin de șoarece ca un control intern. Am construit o plasmidă care conține o regiune de codificare a β-actinei de 426 bp (pozițiile 321-746) inserată în vectorul pUC119 (Takara). Metoda noastră RT-PCR a fost confirmată a fi cantitativă la numerele de molecule care variază între 10-3108 copii pentru gena IL-6 (Fig.2a , b ) și pentru gena μ-actină (datele nu sunt prezentate). Produsele PCR pentru IL-6 au prezentat o temperatură de topire cu un singur vârf la 86,19 ° C (figura 2c ). Produsele PCR s-au separat pe un gel de agaroză 1,5% și s-a confirmat că acestea sunt de 140 bp (datele nu sunt prezentate). În final, nivelele IL-6 mRNA au fost calculate ca numere de copii relative la 10 4 copii ale β-actinei.

Analiza cantitativă a ARNm IL-6 . (a) Curbele standard de diluții de la 10 3 -108 copii ale plasmidei conținând ADNc de IL-6 de șoarece de lungime întreagă și grafice de amplificare ale probelor reprezentative. (b) Curba de calibrare obținută din datele curbei standard pe baza numărului de copii de plasmidă. Aceste date indică faptul că tehnica PCR este cantitativă în intervalul 10-3108 copii ale ARNm IL-6 . (c) Temperatura de topire calculată de software-ul LightCycler în standarde și eșantioane. Toate produsele PCR prezintă o temperatură de topire cu un singur vârf la 86,19 ° C.

Analiza nivelurilor de proteine ​​IL-6

Probele de tumoare, ficat și splină au fost dezghețate, cântărite rapid, plasate în 1 ml PBS și omogenizate timp de 30 de secunde. Homogenatele au fost centrifugate de două ori la 4 ° C și 10 000 g și alicote ale supernatanților preparați pentru testul IL-6 așa cum s-a descris anterior. 5 De asemenea, probele de ser au fost dezghețate și supuse analizei IL-6. Nivelurile IL-6 s-au măsurat prin ELISA utilizând kitul ELISA pentru IL-6 ELISA de șoarece Endogen (Boston, MA).

Studii in vitro

Celulele de carcinom Colon 26 / clona 20 (Centrul de Cercetare Nippon Roche) au fost menținute în mediu RPMI-1640 suplimentat cu FCS 10% inactivat termic, 100 unități / ml penicilină G și 100 pg / ml streptomicină. Celulele au fost placate la 1 x 106 / ml în plăci cu 6 godeuri în mediu RPMI conținând 10% FCS inactivat termic și lăsate să se atașeze peste noapte. Mediul a fost apoi schimbat în RPMI conținând 10% FCS cu sau fără 10 ng / ml IL-1a, urmată de administrarea de 0-6 pg / ml berberină sau 0-30 pg / ml C. rhizoma. Celulele au fost colectate după o incubare de 2 h. Extracția ARN și RT-PCR cantitative în timp real au fost realizate așa cum s-a descris mai sus.

analize statistice

Pentru studiul in vivo , datele privind fiecare parametru nutrițional și nivelele IL-6 au fost analizate prin testul t- Student sau ANOVA cu testul Fisher PLSD. Greutatea corporală, volumul tumorii și statisticile privind consumul de alimente au fost calculate cu un ANOVA cu 1 sens pentru măsuri repetate. Pentru studiul in vitro , nivelele mRNA ale IL-6 au fost analizate prin ANOVA cu testul Fisher PLSD. p <0,05 a fost acceptată ca fiind semnificativă din punct de vedere statistic.

REZULTATE

Efectele berberinei asupra cașexiei

Pentru a determina doza optimă de C. rhizoma pentru acest model, am evaluat preliminar efectele anticachectice ale mai multor doze de berberină, componenta majoră a acestei plante medicinale. Suplimentarea cu berberină la concentrații finale de 0,2% și 0,4% din dietă a împiedicat în mod semnificativ pierderea în greutate a carcasei și risipirea țesuturilor adipoase epididimale și a mușchilor gastrocnemius în șoarecii purtători de tumori, fără a afecta creșterea tumorii (Tabelul I ).

Tabelul I. Parametrii nutriționali și tratamentul cu berberină 1
Controlul ( n = 5) Tratamentul cu berberină
0,1% ( n = 6) 0,2% ( n = 6) 0,4% ( n = 5)
Tumora de greutate (g) 0,22 ± 0,05 0,25 ± 0,04 0,25 ± 0,05 0,24 ± 0,06
Greutatea carcasei (g) 18,2 ± 0,5 18,4 ± 0,6 22,2 ± 0,5 2 20,9 ± 1,4 2
Gastrocnemius muscular (mg) 95,0 ± 9,0 113,5 ± 9,8 140,8 ± 15,5 2 133,0 ± 10,4 2
Țesut adipos epididimal (mg) 24,0 ± 7,1 26,8 ± 3,8 55,3 ± 6,3 2 50,2 ± 11,2 2
Nivelul glucozei serice (mg / dl) 70,4 ± 15,5 75,7 ± 8,2 120,7 ± 18,7 3 120,0 ± 25,0 3
  • 1 Datele sunt mijloace ± SE.
  • 2 p <0,05 comparativ cu martorul.
  • 3 p <0,10 în comparație cu martorul. Analiza statistică a fost efectuată de ANOVA cu testul Fisher PLSD.

Efectele C. rhizoma asupra cașexiei

Berberina aparține clasei protoberberine de alcaloizi de izochinolină găsite într-o varietate de țesuturi vegetale. Este prezentă în pulberea de extract de C. rhizoma la o concentrație de aproximativ 20%. 12 , 16 Așadar, am ales să folosim pulberea de extract de rhizom C. în concentrații finale de 1% și 2% din dietă (supliment CR). Din păcate, suplimentarea cu 2% CR a redus semnificativ aportul de alimente la șoareci, ducând la pierderea greutății corporale chiar și în starea fără tumori (datele nu sunt prezentate). În cele din urmă, am efectuat studiul nostru in vivo utilizând doar 1% din dieta suplimente de CR.

Efectele suplimentării cu CR 1% asupra greutății corporale, a mărimii tumorii și a consumului de alimente la șoarecii BALB / c care poartă celulele de colon 26 / clona 20 sunt prezentate în Figura 1 . Suplimentarea cu CR a împiedicat în mod semnificativ pierderea în greutate la șoarecii purtători de tumori fără a schimba creșterea tumorală sau aportul alimentar ( p = 0,018). Tabelul II rezumă starea nutrițională a celor 6 grupe în ziua 14 (vezi Material și metode ). Consumul total de alimente între zilele 1 și 14 a fost semnificativ mai mic la șoarecii care purtau tumori și la șoarecii hrăniți cu perechi decât la șoarecii hrăniți liber ( p<0,05 pentru toți). Greutățile și greutățile corporale finale ale țesuturilor adipoase epididimale și ale mușchilor gastrocnemius au fost semnificativ mai scăzute la șoarecii purtători de tumori și la șoarecii hrăniți cu perechi decât la martorii cu hrănire liberă ( p<0,05 pentru toți). În plus, șoarecii purtători de tumori cărora li sa administrat o dietă normală aveau o stare nutrițională mai slabă decât șoarecii hrăniți cu perechi. În contrast, șoarecii purtători de tumori cărora li sa administrat suplimentul CR au menținut un nivel nutrițional bun, iar starea nutrițională a acestora a fost similară cu cea a șoarecilor hrăniți cu perechi. Astfel, în comparație cu dieta normală, suplimentarea CR a împiedicat în mod semnificativ pierderea greutății corporale, pierderea țesuturilor adipoase epididimale și a musculaturii și a hipoglicemiei gastrocnemius la șoarecii purtători ai colonului 26 / clonă 20 ( p <0,05 pentru toți).

Tabelul II. Parametrii nutriționali și tratamentul CR 1
Purtător de tumoare Non-purtători de tumori
Pereche de șoareci hrăniți Hrănite cu șoareci în mod liber
Dieta normală CR Dieta normală CR Dieta normală CR
n = 9) n = 9) n = 9) n = 9) n = 6) n = 6)
Cantitatea totală de alimente (g) 36,8 ± 1,6 2 36,4 ± 0,8 2 36,5 ± 0,6 2 36,5 ± 0,6 2 52,2 ± 0,5 52,0 ± 1,0
Greutatea corporală (g)
Iniţială 23,4 ± 0,3 23,2 ± 0,3 23,4 ± 0,4 23,3 ± 0,7 23,3 ± 0,4 23,7 ± 0,3
Final 18,7 ± 0,5 23 4 21,8 ± 0,6 2 21,9 ± 0,5 2 22,5 ± 0,4 2 25,8 ± 0,4 26,1 ± 0,4
Gastrocnemius muscular (mg) 104,8 ± 7,0 23 4 135,6 ± 10,3 2 137,6 ± 9,3 2 140,0 ± 9,0 2 169,5 ± 6,3 168,8 ± 8,8
Țesut adipos epididimal (mg) 21,2 ± 2,0 23 4 45,9 ± 3,7 2 50,3 ± 6,9 2 47,6 ± 3,4 2 270,5 ± 7,0 258,2 ± 7,2
Nivelul glucozei serice (mg / dl) 70,2 ± 5,5 23 4 110,4 ± 10,7 2 96,3 ± 7,3 2 101,8 ± 6,0 2 199,8 ± 12,1 188,7 ± 13,8
  • 1 Datele sunt mijloace ± SE. Analiza statistică a fost efectuată de ANOVA cu testul Fisher PLSD.
  • 2 p <0,05 față de ambii șoareci hrăniți liber.
  • 3 p <0,05 față de ambii șoareci hrăniți cu perechi.
  • 4 p <0,05 față de șoarecii purtători de tumori tratați cu CR.

Efectele suplimentării cu CR asupra nivelurilor IL-6 in vivo

Tabelul III prezintă nivele de ARNm IL-6 și proteine ​​în mai multe țesuturi din cele 4 grupe, șoareci purtători de tumori și nesupuși de tumori tratați cu supliment CR sau cu o dietă normală. IL-6 mRNA a fost exprimată mai abundent în tumori decât în ​​ficat sau splină.Nivelurile mRNA ale IL-6 în țesuturile tumorale și splenice au fost semnificativ mai mici la șoarecii cărora li s-a administrat tumoare, în comparație cu cei cărora li sa administrat o dietă normală ( p <0,05 pentru ambele). Suplimentarea cu CR nu a afectat nivelele de ARNm al IL-6 în țesutul splenic al șoarecilor care nu suferă de tumori. Nu a existat o diferență statistică între nivelele ARNm ale IL-6 în țesuturile hepatice din cele 4 grupe.

Tabelul III. IL-6 mRNA și nivelurile de proteine ​​IL-6 la șoareci tratați cu supliment CR sau o dietă normală 1
Purtător de tumoare Non-tumorale 2
Dieta normală ( n = 6) CR ( n = 6) Dieta normală ( n = 6) CR ( n = 6)
Nivelul mRNA al IL-6 (copii / 10 4 copii de beta-actină )
tumoare 2,108 ± 159 687 ± 125 3
Ficat 55 ± 8 47 ± 11 60 ± 12 61 ± 16
Splină 102 ± 12 50 ± 10 4 69 ± 7 4 60 ± 10 4
Nivelul proteinei IL-6
Ser (pg / ml) 1,113 ± 94 598 ± 167 3 <51 <51
Tumora (ng / g țesut) 235 ± 43 106 ± 28 3
Ficat (ng / g țesut) 0,38 ± 0,15 0,46 ± 0,17 0,40 ± 0,13 0,51 ± 0,17
Splină (ng / g țesut) 0,80 ± 0,22 0,70 ± 0,20 0,61 ± 0,20 0,57 ± 0,15
  • 1 Datele sunt mijloace ± SE.
  • 2 Șoareci fără tumori care au fost hrăniți în mod liber.
  • 3 p <0,05 față de șoarecii purtători de tumori cărora li sa administrat o dietă normală prin t- testul Student.
  • 4 p <0,05 față de șoarecii purtători de tumori cărora li sa administrat o dietă normală de ANOVA cu testul Fisher PLSD.

Valorile proteinei IL-6 în probele tumorale și serurile au fost semnificativ mai mici la șoarecii cărora li sa administrat tumori, având un supliment CR, decât la cei cărora li sa administrat o dietă normală ( p <0,05 pentru ambele). Nivelurile serice ale IL-6 la toți șoarecii care nu poartă tumori au fost sub limita de detecție (51 pg / ml). Nu a existat nici o diferență în nivelul de proteine ​​IL-6 din ficat sau splină de șoareci printre cele 4 grupe.

Efectele berberinei și CR asupra inducției IL-6 mRNA prin IL-1α

Studiul nostru in vitro a arătat că nivelele IL-6 mRNA în celulele de colon 26 / clona 20 au crescut de aproximativ 20 de ori după incubarea timp de 2 h cu 10 ng / ml IL-1a, așa cum s-a descris anterior. 17 În schimb, coincubarea celulelor cu berberină sau C. rhizoma a inhibat semnificativ numărul de copii ARN mRNA IL-6 într-o manieră dependentă de doză ( p <0,05, Figura 3 ).

Efectul C. rhizoma și berberinei asupra nivelelor mRNA ale IL-6 în celulele de colon 26 / clona 20 de 2 ore după administrarea IL-1a. Celulele Colon 26 / clona 20 au fost incubate în mediu de cultură cu sau fără 10 ng / ml IL-1a, urmată de administrarea de 0-6 pg / ml de berberină sau de 0-30 pg / ml de C. rhizoma.Celulele au fost recoltate după 2 ore. ARN a fost extras pentru RT-PCR cantitativ în timp real. Nivelurile mRNA ale IL-6 au crescut semnificativ după o incubare de 2 h cu 10 ng / ml IL-1a, în timp ce C. rhizoma și berberină au inhibat inducerea IL-6mRNA într-o manieră dependentă de doză. p <0,05 în comparație cu IL-1a singur prin ANOVA.

DISCUŢIE

Acțiunile farmacologice și moleculare ale multor plante sunt elucidate treptat. Este de așteptat ca această înțelegere științifică sporită să ducă la o nouă eră de remedii pe bază de plante. Studiile efectuate de laboratorul nostru și altele au arătat că C. rhizoma, o plantă bogată în berberină obținută din rădăcina diferitelor plante Coptis , are proprietăți antitumorale și preventive împotriva cancerului. 9 , 12 , 18 Anterior, am constatat că administrarea orală a C. rhizoma a împiedicat în mod semnificativ pierderea în greutate la șoarecii nudi care poartă celule canceroase esofagiene umane. IL-6 este probabil o moleculă cheie în casexia indusă de cancer, deși orice legătură IL-6 cu funcția anticachetică a acestei plante a fost neclară la acel moment. 10 În studiul nostru actual, am folosit un model de cașexie legat de IL-6 și am descoperit o relație semnificativă între efectele anticachetice ale nivelelor C. rhizoma și IL-6. Am observat scăderea nivelurilor de proteină IL-6 în serurile și țesuturile tumorale și scăderea nivelelor ARNm ale IL-6 în țesuturile tumorale ale șoarecilor cărora li sa administrat C. rhizoma. În același model, într-un studiu diferit, administrarea unei doze mari de IL-12 a determinat inducerea cașexiei suprimate și a inhibat creșterea tumorii.19 În plus, IFN-γ a prevenit inducerea cașexiei în acest model fără a altera nivelele IL-6. 19Constatarea noastră că C. rhizoma nu a afectat creșterea tumorală sugerează un mecanism de bază diferit pentru prevenirea cașexiei de această plantă. S-a raportat că celulele de colon 26 produc IL-6 in vivo numai ca răspuns la citokinele proinflamatorii secretate de monocitele infiltrate, în special de IL-1. 3 , 20 Mai mult decât atât, Fujiki et al . 17 a observat că celulele de colon 26 / clona 20 produc IL-6 ca răspuns la IL-1α, sugerând expresia modificată a IL-1 și IL-6 datorită interacțiunii dintre celulele tumorale și celulele gazdă. Prin urmare, am investigat dacă celulele de colon 26 / clona 20 produc IL-6 ca răspuns la IL-1α in vitro. Datele noastre au arătat că coincubarea celulelor cu berberină sau C. rhizoma a inhibat expresia mRNA a IL-6 indusă de IL-1a într-o manieră dependentă de doză. Prin urmare, activitatea anticachectică poate fi atribuită inhibării transcripționale a IL-6 în celulele tumorale după administrarea acestei plante medicinale. Datele noastre sugerează de asemenea că berberina, componenta majoră, contribuie semnificativ la activitatea anticachectică totală a C. rhizoma. Acest rezultat confirmă concluzia anterioară că berberina inhibă direct activitatea proteinei activatoare-1, un transactivator al IL-6. 21 Cahlin și colab . 6 a arătat că omisiunea IL-6 gazdă, dar nu TNF-a, IL-12 sau IFN-y, a îmbunătățit pierderea în greutate a carcasei la șoarecii knock-out care poartă tumori MCG 101. Astfel, C. rhizoma poate scădea nivelele IL-6 derivate atât din celulele tumorale, cât și din celulele gazdă.

S-a arătat că anticorpul receptorului anti-IL-6 previne atrofia musculară la șoarecii cu adenocarcinom de colon 26. 4 În concordanță cu această constatare, am observat că administrarea de C. rhizoma a împiedicat pierderea mușchiului gastrocnemius la șoarecii cu colon 26 / clona 20 și a scăzut nivelul de IL-6. Tisdale 1 a sugerat că IL-6 poate fi un marker mai degrabă decât un mediator actual al cașexiei cancerului, deoarece administrarea directă a acestei citokine la animalele experimentale nu a reușit să inducă cașexia și Hussey și colab. 22 a observat o relație între factorul inductor de proteoliză (PIF) și cașexia la șoarecii transplantat cu colonul 26 / clona 20. Interesant, pierderea musculară indusă de PIF poate fi asociată cu creșterea nivelului de prostaglandină E2 (PGE2), 23 și se știe că C. rhizoma inhibă activitatea ciclooxigenazei-2. 12 Această plantă ar putea exercita o acțiune anticachectică prin interacțiune directă cu căi de generare a PIF și PGE2. De asemenea, am constatat că suplimentarea cu CR a împiedicat în mod semnificativ hipoglicemia la șoarecii purtători de tumori comparativ cu dieta normală. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă prevenirea sa se datorează unei acțiuni directe a C. rhizoma sau nu. Sunt necesare studii suplimentare pentru a clarifica dacă funcția anticachectică a C. rhizoma este legată de alte molecule, inclusiv PIF, și de a examina mecanismul prin care suplimentarea cu CR atenuează hipoglicemia cauzată de inocularea tumorii.

Nivelurile mRNA ale IL-6 din splină au fost semnificativ mai mici la șoarecii purtători de tumori cărora li s-a administrat CR supliment decât la cei cărora li s-a administrat o dietă normală. Totuși, nivelele de proteină IL-6 din splină nu au fost modificate. Motivul acestei discrepanțe rămâne neclar. Totuși, deoarece s  au detectat semnificativ mai puține copii ale ARNm al IL-6 în splină decât în ​​tumoare, diferența dintre nivelele mRNA de IL-6 din splină între șoarecii tratați cu CR și CR netratată cu șoareci poate să nu fie critic biologic. În sprijinul acestei posibilități, Fujiki et al . 17 au raportat absența acestei transcrieri în splină în același model. O explicație alternativă este aceea că administrarea de C. rhizoma modifică anumite subpopulații ale celulelor prezente în splină, afectând astfel numărul copiilor ARN și această discrepanță ar putea fi atribuită parțial unei diferențe în sensibilitatea celor două metode analitice utilizate. Extractul de C. rhizoma inhibă apoptoza indusă de glucocorticoizi în timocite. De asemenea, extractul de C. rhizoma a mărit expresia genei IL-2 în celulele Jurkat, o linie de celule T umane. 25 Analizele ulterioare ale efectelor C. rhizoma asupra activității celulelor imunitare gazdă și a subpopulațiilor celulelor splenice pot oferi o perspectivă asupra mecanismelor prin care această plante acționează ca agent anticachectic.

Datele noastre au arătat că întreaga plantă C. rhizoma și componenta ei purificată berberină posedă activitate anticachectică. Este ușor să credem că medicamentele purificate ucid celulele tumorale mai eficient decât materialele vegetale naturale din cauza faptului că mulți agenți anticancer folosiți pe scară largă provin din produse naturale, inclusiv ierburi.Stermitz și colab . 26 a demonstrat că Berberis fremontii, o plantă bogată în berberină, sintetizează un inhibitor puternic al pompei rezistente la multidrug, 5′-metoxihidnocarpină (5′-MHC): efluxul de berberină din Staphylococcus aureus patogen care exprimă pompa rezistență multidrogală NorA care conferă rezistență la chinolone și antiseptice a fost inhibată complet prin coexistența 5′-MHC în B. fremontii. Acesta este un exemplu clar de sinergie între componentele unei plante medicinale, sugerând că o plantă brută nu este neapărat un medicament mai puțin puternic decât unul dintre componentele purificate.

În concluzie, studiul nostru a arătat că C. rhizoma exercită un efect anticachectic asupra șoarecilor transplantate cu colonul 26 / clona 20 și că efectul este asociat cu producția IL-6 tumorală. De asemenea, sugerăm că berberina, componenta sa majoră, ar putea juca un rol în prevenirea CASEXIEI 

Acum, dovezi din studiile clinice la scară largă vor fi necesare pentru a încorpora această plante medicinale în tratamentele cancerului de masă.

Diagnosticul și tratamentul cancerului

 

Acces Liber

Prima publicare: 11 aprilie 2002
 Citată de: 32

Recunoasteri

Recunoaștem sprijinul acordat de Tsumura și Institutul de Animale de Laborator, Universitatea de Medicină din Yamaguchi. De asemenea, le mulțumim Centrului de Cercetare Nippon Roche pentru furnizarea celulelor colonului 26 / clona 20 și Dr. K. Mori pentru sfaturi utile.

REFERINȚE

  • 1 Tisdale MJ. Biologia cașexiei . J Natl Cancer Inst 1997 ; 89 : 1763-73.
  • 2 Inui A. Sindromul de anorexie- cachexie a cancerului: neuropeptidele sunt cheia? Cancer Res1999 ; 59 : 4493-501.
  • 3 Strassmann G, Jacob CO, Evans R, Beall D, Fong M. Mecanismele cașexiei cancerului experimental. Interacțiunea dintre fagocitele mononucleare și carcinomul colon-26 și relevanța acesteia pentru cașexia de cancer mediată de IL-6 . J Immunol 1992 ; 148 : 3674-8.
  • 4 Fujita J, Tsujinaka T, Yano M, și colab. Anticorpul receptorilor anti-interleukină-6 previne atrofia musculară la șoarecii cu adenocarcinoame de colon-26 cu modularea căilor proteolitice lizozomale și ATP-ubiquitin-dependent . Int J Cancer 1996 ; 68 : 637-43.
  • 5 Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, și colab. Relația dintre nivelele serice ale interleukinei 6, diferiți parametrii bolii și malnutriția la pacienții cu carcinom esofagian cu celule scuamoase .Cancer Res 1996 ; 56 : 2776-80.
  • 6 Cahlin C, Korner A, Axelsson H, Wang W, Lundholm K, Svanberg E. Cachexia cancerului experimental: rolul citokinelor derivate din gazdă interleukina (IL) -6, IL-12, interferonul-gamma și factorul necrozei tumorale evaluate în gene knockout, șoareci purtători de tumori pe fondul C57 Bl și cașexia dependentă de eicosanoid . Cancer Res 2000 ; 60 : 5488-93.
  • 7 Kurebayashi J, Yamamoto S, Otsuki T, Sonoo H. Acetat de medroxiprogesteron inhibă secreția de interleukină 6 din celulele cancerului de sân uman KPL-4 atât in vitro cât și in vivo: un posibil mecanism al efectului anticachectic . Br J Cancer 1999 ; 79 : 631-6.
  • 8 Iizuka N, Miyamoto K, Kayano K, Hayashi H, Tangoku A, Oka M. Îmbunătățirea activității antitumorale induse de cisplatină de către medicamentele Kampo în cancerul esofagian uman [în japoneză cu rezumatul în limba engleză]. J Trad Med 1998 ; 15 : 340-1.
  • 9 Iizuka N, Miyamoto K, Okita K, și colab. Efectul inhibitor al Coptidis rhizoma și berberină asupra proliferării liniilor celulare de cancer esofagian uman . Cancer Lett 2000 ; 148 : 19-25.
  • 10 Iizuka N, Miyamoto K, Hazama S, și colab. Efectele anticachetice ale Coptidis rhizoma, o plantă antiinflamatoare, asupra celulelor canceroase esofagiene care produc interleukină 6 . Cancer Lett2000 ; 158 : 35-1.
  • 11 Fujimoto-Ouchi K, Tamura S, Mori K, Tanaka Y, Ishitsuka H. Stabilirea și caracterizarea clonelor inducerea și inducerea cașexiei a carcinomului de colon murin 26 . Int J Cancer 1995 ; 61 : 522-8.
  • 12 Fukutake M, Yokota S, Kawamura H, și colab. Efectul inhibitor al Coptidis rhizoma și Scutellariae radix asupra formării foci aberante induse de azoximetan în colonul de șobolan . Biol Pharm Bull1998 ; 21 : 814-7.
  • 13 Yoshimura K, Hazama S, Iizuka N, și colab. Terapia cu imunogene de succes utilizând celulele cancerului de colon (colonul 26) transfectate cu vectorul plasmidic care conține cADN-ul interleukin-18 matur și secvența lider Igkappa . Cancer Gene Ther 2001 ; 8 : 9-16.
  • 14 Bing C, Brown M, King P, Collins P, Tisdale MJ, Williams G. Creșterea exprimării genei a proteinelor de decuplare a grăsimilor brune (UCP) 1 și a mușchilor scheletici UCP2 și UCP3 în cazexia de cancer indusă de MAC16 . Cancer Res 2000 ; 60 : 2405-10.
  • 15 Iizuka N, Oka M, Noma T, Nakazawa A, Hirose K, Suzuki T. NM23-H1 și abundența ARN mesager NM23-H2 în carcinomul hepatocelular uman . Cancer Res 1995 ; 55 : 652-7.
  • 16 Ozaki M, Suzuki H, Satake M. Studii comparative privind concentrația de berberină în plasmă după administrarea orală a extractului de Coptidis rhizoma , extractul de celule cultivate și utilizarea combinată a acestor extracte și a extractului glicirizică radix la șobolani [în japoneză cu rezumatul în limba engleză]. Yakugaku Zasshi 1993 ; 113 : 63-9.
  • 17 Fujiki F, Mukaida N, Hirose K, și colab. Prevenirea cașexiei induse de adenocarcinomul colon 26 prin transferul de gene de interleukină 10 . Cancer Res 1997 ; 57 : 94-9.
  • 18 Li XK, Motwani M, Tong W, Bornmann W, Schwartz GK. Huanglian, un extract din plante chinezești, inhibă creșterea celulară prin suprimarea expresiei ciclinului B1 și inhibarea activității kinazei CDC2 în celulele canceroase umane . Mol Pharmacol 2000 ; 58 : 1287-93.
  • 19 Mori K, Fujimoto-Ouchi K, Ishikawa T, Sekiguchi F, Ishitsuka H, ​​Tanaka Y. Interleukina -12 murină previne dezvoltarea cașexiei cancerului într-un model murin . Int J Cancer 1996 ; 67 : 849-55.
  • 20 Strassmann G, Masui Y, Chizzonite R, Fong M. Mecanismele cașexiei cancerului experimental.Implicarea locală a IL-1 în tumoră de colon-26 . J Immunol 1993 ; 150 : 2341-5.
  • 21 Fukuda K, Hibiya Y, Mutoh M, Koshiji M, Akao S, Fujiwara H. Inhibarea activității proteinei activator 1 de berberină în celulele hepatomului uman . Planta Med 1999 ; 65 : 381-3.
  • 22 Hussey HJ, Todorov PT, Field WN, și colab. Efectul unei pirimidine fluorurate asupra cașexiei și a creșterii tumorale în modelele de cașexie murină: relația cu un factor de inducere a proteolizei .Br J Cancer 2000 ; 83 : 56-62.
  • 23 Lorite MJ, Cariuk P, Tisdale MJ. Inducerea degradării proteinelor musculare de către un factor tumoral . Br J Cancer 1997 ; 76 : 1035-40.
  • 24 Miura N, Yamamoto M, Ueki T, Kitani T, Fukuda K, Komatsu Y. Inhibarea apoptozei timocitelor de berberină . Biochem Pharmacol 1997 ; 53 : 1315-22.
  • 25 Hakamatsuka T, Tanaka N. Screening pentru compușii bioactivi care vizează calea de transducție a semnalului celular utilizând un sistem de bioteste bazat pe RT-PCR . Biol Pharm Bull1997 ; 20 : 464-6.
  • 26 Stermitz FR, Lorenz P, Tawara JN, Zenewicz LA, Lewis K. Sinergia într-o plantă medicinală: acțiune antimicrobiană a berberinei potențată de 5′-metoxihidnocarpină, un inhibitor al pompei multidrucipe . Proc Natl Acad Sci SUA 2000 ; 97 : 1433-7.

Citând literatura

Câteodată citate: 32

  •  , căi de semnalizare, boli și funcții asociate clusterului miR-19a / 92a și utilizarea berberinei pentru a modula expresia acest grup în celulele mielomului multiplu , Journal of Biochemical and Molecular Toxicology , 32 , 6 , (2018) .
  •  , activități anticanceroase și mecanisme de curățare termică și detoxifiere a medicamentelor tradiționale chinezești pe bază de plante medicinalechinezești , 10.1186 / s13020-017-0140-2 , 12 , 1 , (2017) .
  •  , Coptidis Rhizoma induce apoptoza intrinsecă prin activarea BAX și BAK în melanomul uman , Oncology Reports , 10.3892 / sau 2017.5672 , 38 , 1 , (538-544) , (2017) .
  •  , compoziția dietei ca o sursă de variație în modelele experimentale de animale ale cașexiei de cancer , „Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle” , 7 , 2 , (110-125) 2015) .
  •  , Apocynin a redus leziunea hepatică acută indusă de doxiciclină la șoareci ovariectomizați , Toxicology Reports , 10.1016 / j.toxrep.2016.02. 003 , 3 ,(357-363) , (2016) .
  •  . -1 / Akt și semnalul autofagiei încazexia cancerului , Suporting Care in Cancer , 10.1007 / s00520-015-2892-5 , 24 , 3 , (1189-1198) ,(2015) .
  •  , Tonglian Decoction blochează ciclul celular în fază S prin vizarea semnalului B în carcinomul esofagian, celulele Eca109 , Jurnalul chinezesc al medicinei integrative , 10.1007 / s11655-016-2096-3 , 22 , 5 ,(384-389) , (2016) .
  •  , extract de Citrus unshiu de coajă ameliorează pierderea de greutate indusă de cancer la șoareci purtând adenocarcinom CT-26 , Scientific Reports , 10.1038 / srep24214 , 6 , 1 , (2016) .
  •  , Ligazele ubiquitin E3 specifice mușchilor sunt implicate în atrofia musculară a cașexiei de cancer: vivo , Rapoarte oncologice , 10.3892 / sau 2015.3845 , 33 , 5 ,(2261-2268) , (2015) .
  •  , modelul de șoarece cachectic , „Jurnalul de Cachexie, Sarcopenia și Musculatura” , 5 , 2 , (159-169) , (2013) .
  •  , Efectele berberinei în tractul gastrointestinal – o revizuire a acțiunilor și implicațiilor terapeutice , Jurnalul American de Medicină Chineză , 10.1142 / S0192415X14500669 , 42 , 05 , (1053-1070 ) , (2014) .
  •  , Berberine atenuează puternic creșterea polipilor intestinali la șoarecii ApcMin și la pacienții familiali adenomatoase de polipoză prin inhibarea semnalizării Wnt, Journal of Cellular and Molecular Medicine , 17 , 11 , (1484-1493) , (2013) .
  •  , Prevenirea și tratamentul cancerului colorectal de către agenții naturali de la mama natură , Rapoartele actuale ale cancerului colorectal , 10.1007 / s11888-012-0154-1 , 9 , 1 , 56) , (2013) .
  •  , Set9, NF-κB și microRNA- – apoptoza indusă de celule de mielom multiplu uman , Acta Pharmacologica Sinica , 10.1038 / aps.2012.161 , 34 , 1 , (157-166) , (2012) .
  •  , Inhibiția in vitro a Huanglian [Rhizoma coptidis (L. )] și cei șase alcaloizi activi pe șase izoforme ale citocromului P450 în microzomi ai ficatului uman , Fitoterapia de cercetare , 25 , 11 , (1660-1665) , (2011) .
  •  , O revizuire sistematică a proprietăților anticanceroase ale berberinei, un produs natural din plante chinezești , Anti-Cancer Drugs ,10.1097 / CAD.0b013e328330d95b , 20 , 9 , (757-769) (2009) .
  •  , deficiența de interleukină-6 accelerează insuficiența renală acută indusă de cisplatină, dar nu leziuni sistemice , Toxicology , 10.1016 / j.tox.2009.10.005 , 265 , 3 , (115-121) , (2009) .
  •  , Medicina veterinară pe bază de plante: o abordare bazată pe sisteme , medicina veterinară pe bază de plante , 10.1016 / B978-0-323-02998-8.50024-X , (291-409) , (2007) .
  • , Materia Medica , medicina veterinară pe bază de plante , 10.1016 / B978-0-323-02998-8.50028-7 ,(459-672) , (2007) .
  •  , Îmbunătățirea trioxidului de arsenic (As2O3) – Apoptoza mediată folosind berberină în celulele SH-SY5Y de la Neuroblastomul Uman , Journal of Society Neurochirurgicale coreene , 10.3340 / jkns.2007.42.5.392 , 42 , 5 , (392) , (2007) .
  •  , Extras din Coptidis rhizoma induce apoptoza dependentă de citocrom-c în imortalizat și keratinocite orale maligne pe cale orală , Phytotherapy Research , 20 , 9 , (773-779) ,(2006) .
  •  , Efectele anticanceroase ale medicamentelor din China pe bază de plante, știință sau mit? , Jurnalul de la Universitatea Zhejiang SCIENCE B , 10.1631 / jzus.2006.B1006 , 7 , 12 , (1006-1014) , (2006) .
  •  , Investigarea proteinelor exprimate diferențiat datorită efectelor inhibitorii ale berberinei în linia celulară de cancer de ficat uman HepG2 , Molecular BioSystems , 10.1039 / b517116d , 2 , 5 , (250) , (2006) .
  •  , Modularea Nutriției Cachexiei / Proteolizei , Nutriția în Practica Clinică , 21 , 2 , (155-167) , (2006) .
  •  , recurența carcinomului hepatocelular , Journal of Cancer , 115 , 2 , (231-240) , (2005) .
  •  , Formula chineză pe bază de plante, Bing De Ling, ameliorează efectele antitumorale și ameliorează pierderea în greutate indusă de 5-fluorouracil în CT26 Model , ADN și Biologie celulară, 10.1089 / dna.2005.24.470 , 24 , 7 , (470-475) , (2005) .
  •  , Disecția moleculară a unei plante medicinale cu activitate antitumorală prin microarray oligonucleotidic , Life Sciences ,10.1016 / j.lfs.2005.01.018 , 77 , 9 , (991-1002) , (2005) .
  •  pe apoptoza și necroza indusă de S-nitrozo-N-acetilpenicilamina (SNAP) în celulele pancreatice RINm5F , Life Sciences , 10.1016 / j.lfs.2004.10.008, 76 , 8 , (917-929) , (2005) .
  •  , extractul de huanglian, o plantă medicinală, induce stoparea creșterii celulare și apoptoza prin creșterea reglementării interferonului-β și TNF-a în celulele cancerului de sân uman , Carcinogeneza , 10.1093 / carcin / bgi154 , 26 , 11 , (1934-1939) , (2005) .
  •  , identificarea genelor comune sau distincte legate de activitățile antitumorale ale unei plante medicinale și componenta sa majoră prin microarray oligonucleotidic Journal of Cancer , 107 , 4 , (666-672) , (2003) .
  •  , Canadine de la Corydalis turtschaninovii Stimulează diferențierea și protecția microbienei împotriva atrofiei miotubice ,Journal of Molecular Sciences , 10.3390 / ijms18122748 , 18 , (2748) , (2017) .
  •  , Coptisine de la Rhizoma Coptidis suprimă creșterea celulelor tumorale HCT-116 vitro și in vivo , Rapoarte științifice , 10.1038 / srep38524 , 7 , (38524) , (2017) .

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.