Ghrelin previne pierderea musculară indusă de tumori și cisplatină: caracterizarea mecanismelor multiple implicate

fundal

Casexia și atrofia musculară sunt consecințe comune ale cancerului și chimioterapiei. Noul hormon ghrelin a fost propus ca tratament pentru această afecțiune. Creșterea aportului alimentar și efectele directe asupra proteolizei musculare și a sintezei proteinelor pot media aceste efecte, dar căile care duc la aceste evenimente nu sunt bine înțelese.

metode

Am caracterizat căile moleculare implicate în atrofia musculară indusă de implantul tumoral al Lewis carcinom pulmonar (LLC) la șoarecii masculi adulți c57 / bl6 și prin administrarea agentului chimioterapeutic cisplatină la șoareci și în miotuburile C2C12. Efectele administrării exogene a ghrelinului și mecanismele sale de acțiune au fost examinate în aceste situații.

Rezultate

Implantarea tumorii și atrofia musculară indusă de cisplatină prin activarea citokinelor pro-inflamatorii, p38-C / EBP-β și myostatin și prin reglarea în jos a Akt, myoD și myogenin, conducând la activarea proteolizei mediate de ubiquitin-proteazom și slăbiciune musculară . Implantarea tumorii a crescut de asemenea mortalitatea. In vitro , miostatica și atroginul-1 cu cisplatină reglată prin activarea C / EBP-β și FoxO1 / 3. Ghrelin a împiedicat aceste modificări in vivo și in vitro , sporind semnificativ masa musculară ( P <0,05 pentru LLC și P <0,01 pentru modelele cu cisplatină) și rezistența la strângere ( P = 0,038 pentru LLC și P = 0,001 pentru modelele cu cisplatină) = 0,021 pentru modelul LLC).

Concluzie

Ghrelin previne atrofia musculară prin reglarea în jos a inflamației, p38 / C / EBP-β / myostatin și activarea Akt, myogenin și myoD. Aceste modificări apar, cel puțin parțial, pentru a direcționa direct celulele musculare. Administrarea ghrelinului în acest context este asociată cu o îmbunătățire a rezistenței musculare și a supraviețuirii.

Introducere

Casexia (pierderea involuntară a mușchilor și a masei grasei) este o complicație obișnuită a multor afecțiuni cronice, incluzând cancerul, insuficiența cardiacă cronică, boala pulmonară și boala renală. 1 La stabilirea cancerului, aceasta este asociată cu toleranță slabă la terapie, scăderea calității vieții și creșterea mortalității. 2 În ciuda semnificației sale, în prezent nu există tratamente pentru această condiție.

Suplimentele nutritive singure nu inversează cașexia, 1 antrenament de rezistență poate îmbunătăți puterea musculară și masa fizică slabă, dar nu este prescrisă în mod obișnuit pacienților în această situație, 3 și se folosesc adesea medicamente, cum ar fi agenți progestativi, masa și poate provoca tromboză venoasă profundă, insuficiență suprarenală și hipogonadism. 4 O creștere a proteolizei musculare și o scădere a sintezei proteinelor determinate de activarea proteazomului ubiquitin-proteazom, 5 kinazelor proteinei mitogen activate (MAP), 6 și a căilor de miostatină 3 printre altele au fost identificate ca procese centrale în casexia indusă de tumori, dar căile care duc la acestea nu au fost pe deplin caracterizate. 7

Cisplatina este un agent chimioterapeutic care face parte din standardul de îngrijire pentru tratamentul mai multor tipuri de cancer, incluzând cancerul pulmonar, capului și gâtului, ovarul, testiculul și vezica urinară și, paradoxal, este cunoscută că determină pierderi de greutate și mase musculare. 8 Am raportat recent mecanismele prin care cisplatina modifică metabolismul lipidic, provocând astfel atrofie de grăsime, incluzând o creștere a lipolizei și oxidării lipidelor și o scădere a lipogenezei. Cu toate acestea, măsura în care sinteza și degradarea proteinelor musculare sunt afectate în acest context și mecanismele care mediază aceste efecte nu au fost caracterizate. Având în vedere că cachexia este adesea un efect secundar limitativ al dozei de cisplatină și alți agenți chimioterapeutici, tratarea sau prevenirea cașexiei ar permite utilizarea unor doze mai mari și mai eficiente de cisplatină.

Ghrelin, ligandul endogen pentru receptorul secretagogon al hormonului de creștere (GHSR) -1a, a fost propus ca potențial țintă terapeutic pentru cașexia, având potențialul de a crește pofta de mâncare, grăsime și masa musculară. 9 , 10 Desi mecanismele sale de actiune nu au fost elucidate complet, o crestere a consumului de alimente si o scadere a consumului de energie prin efecte hipotalamice, 11 , 12 o scadere a inflamatiei, 13 o crestere a GH, 14 si efecte directe in tesutul adipos 15 și mușchiul scheletic 16 se consideră că pot media aceste efecte.

În acest studiu, am stabilit efectele ghrelinului în stabilirea pierderilor musculare induse de chimioterapie și tumori și caracterizarea căilor implicate. Am studiat aceste două modele pentru a determina măsura în care aceste mecanisme au fost modulate diferențiat, analizând expresia genei și a proteinei, precum și impactul lor funcțional și efectul asupra supraviețuirii. Deoarece căile multiple sunt susceptibile de a juca un rol în medierea efectelor ghrelinului, am presupus că mai multe ținte vor fi modulate de ghrelin în aceste setări.

materiale si metode

animale

Adulți (vârsta de 90 ± 10 zile) șoareci masculi c57bl / 6J au fost utilizați pentru toate experimentele.Animalele au fost adăpostite individual, au fost aclimatizate în cuștile lor și au fost manevrate la om timp de o săptămână înainte de experimente și au fost menținute pe un ciclu 12/12 de lumină / întuneric (luminile au fost aprinse la ora 6 dimineața). Toate experimentele au fost realizate cu aprobarea Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale și au fost în conformitate cu Ghidul instituțiilor naționale de sănătate pentru utilizarea și îngrijirea animalelor de laborator. Pentru toate experimentele au fost utilizate mărimi de probe de 8-10 animale / grup.

Ghrelinul acilat a fost utilizat pentru toate studiile in vivo și toate studiile in vitro . Pentru modelul de cașexie indus de cisplatină, animalele au primit vehicul (soluție salină), cisplatină, ghrelin acilat + cisplatină sau ghrelin acilat. Cisplatina a fost achiziționată de la APP Pharmaceuticals (Schaumburg, IL) și ghrelinul acilat de rozătoare a fost sintetizat de Anaspec (Fremont, CA). Doza de cisplatină a fost de 2,5 mg / kg administrată zilnic timp de 10 zile la 8:30 am intraperitoneal (IP), iar doza pentru ghrelin a fost de 0,8 mg / kg de două ori pe zi IP la 8 am și 5 pm timp de 21 zile. Doza de ghrelin acilat a fost administrată la 30 minute înainte de cisplatină. Această doză specială de cisplatină și ghrelin acilat a fost selectată pe baza activității noastre anterioare care a evidențiat pierderea în greutate indusă de cisplatină și anorexia fără toxicitate și prevenirea anorexiei, atrofiei grase și scăderii în greutate a ghrelinului. 8

Pentru modelul de cachexie a cancerului Lewis (LLC), celule de LLC de 100 mcl (1 x 106 celule) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) sau un volum egal și un număr de celule LLC ucise cu căldură ) a fost injectat subcutanat în flancul drept. Gellin (vehicul tumoral + ghrelin, grupul TG) sau vehicul (sare, tumoare + vehicul, grup TV) a fost injectat subcutanat în flancul stâng al șoarecilor din ziua 7 după implantarea LLC, când tumoarea a devenit palpabilă (aproximativ 1 cm în diametru). Doza pentru ghrelin a fost de 0,8 mg / kg de două ori pe zi la 8 am și 5 pm. Șoarecii au fost sacrificați în ziua 28 a implantării LLC, aproximativ 21 de zile după ce tumoarea a devenit palpabilă.

Greutatea corporală și aportul alimentar au fost evaluate zilnic prin cântărirea alimentelor și a animalelor înainte de injectarea. Modificările greutății corporale au fost exprimate ca schimbare față de valoarea inițială, iar consumul de alimente a fost exprimat în grame / zi. Masa corpului macră și masa de grăsime au fost măsurate prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) cu un spectrometru RMN Minispec mq (Bruker optics, The Woodlands, TX). Rezistența la strângere a fost măsurată cu un contor de forță de aderență cu manometru digital (Columbus Instruments, Columbus, OH).

S-au colectat pentru analize mușchii picioarelor [quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterioris (TA) și extensor digitalis longus]. Comparațiile dintre grupuri (de exemplu, zona secțiunii musculare și expresia genei sau a proteinei) au fost întotdeauna efectuate de la aceleași mușchi. Greutățile musculare au fost normalizate prin masa corporală slabă la momentul inițial. Pentru modelul de cașexie indus de LLC, greutatea corporală și masa corporală slabă au fost exprimate ca greutate după ce greutatea tumorii a fost scăzută și exprimată ca schimbare față de valoarea inițială.

Cultură de celule

C2o12 (ATCC, Manassas, VA) s-au menținut în mediu Dagbecco modificat Eagle (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) cu 10% ser de bovine fetale (HyClone, Logan, UT), penicilină (200 unități / și streptomicină (50 pg / ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA). La confluență de 90%, mediul a fost schimbat la DMEM plus 2% ser de cal (Life Technologies, Grand Island, NY) pentru a induce formarea miotuburilor. Celulele au fost tratate cu cisplatină (50 uM), ghrelin acilat (1 uM) sau ambele în ziua 3 când s-a format myotube și s-au recoltat 24 de ore după.

În timp real, reacția în lanț polimerazică cantitativă

A fost izolat ARN din gastrocnemii sau myotuburi C2C12 cultivate (reactiv Trizol, Life Technologies, Grand Island, NY). Nivelurile de transcriere au fost măsurate prin PCR în timp real (7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems). ARN-ul total a fost transcris invers (kitul de transcriere cu referință QuantiTect, Qiagen, Valencia, CA) la cADN. Primerii pentru amplificarea PCR în timp real utilizați sunt de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, vezi informația de susținere, tabelul S1 ). Semnalele sunt exprimate în raport cu gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază utilizând metoda standard 2- ^ΔCT .

Western blot

Proteina din gastrocnemii sau miotuburi a fost izolată folosind reactiv de lizare / reacție de extracție a țesutului sau reactiv de liză celulară (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) cu inhibitori de protează și cocktailuri de inhibitor de protează de fosforilare (Roche, Nutley, NJ). Concentrația de proteină a fost măsurată utilizând testul de proteină BCA Pierce (Thermo Scientific, Logan, UT). Proteina nucleară a fost izolată utilizând kitul de extracție nucleară EpiQuik (Epigentek Farmingdale, NY). După spălarea cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), celulele au fost răzuite și centrifugate. Peletele de celule s-au resuspendat în 100 pl de soluție diluată NE1 [1X, 1: 1000 raport de ditiotreitol (DTT) și Cocktail inhibitor de protează (PIC)] și s-au incubat pe gheață timp de 10 minute, apoi s-au turbionat și centrifugat timp de 1 minut la 24000 g . Extractul citoplasmatic a fost îndepărtat din peleta nucleară și două volume de DTT și PIC conținând NE2 (raport 1: 1000) au fost adăugate la peleta nucleară. Extractul a fost incubat pe gheață timp de 15 minute, probele se agită timp de 5 s la fiecare 3 minute. Factorii de transcripție C / EBP-p și FOXO1 au fost evaluați în extracte nucleare dat fiind că se leagă la secvențe ADN specifice care controlează transcripția la mRNA în nuclee. Am separat extractele de proteine ​​pe geluri NuPAGE de 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) și le-am blotat pe fluorură de poliviniliden de tip Immobilon (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). Membranele au fost blocate la temperatura camerei (RT) timp de 1 oră în 5% albumină serică bovină (BSA) și incubate în anticorpi lary peste noapte la 4 ° C. Au fost utilizați anticorpi IgG 2ry anti-iepure / șoarece / capră DyLight 680/800 (Thermo Scientific, Waltham, MA) timp de 1 oră la RT. După trei spălări în TBST, bloturile au fost scanate cu LI-COR Odyssey (LI-COR, Lincoln, NE) și cuantificate cu Image-Pro plus.

Următorii anticorpi au fost utilizați pentru a evalua prin nivele de proteine ​​cu blocaje vestică etapele cheie din căile de interes: p- Akt (Ser 473, cat # 4060), p- p38 (T180, cat # 9212) , FOX03a (cat # 9464), C / EBP-p (cat # 3084) și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (pisică # 2118) de la Cell Signaling (Beverly MA); myoD (cat # 12344), myosin (cat # M4276), myostatin (GDF8, cat # 1403860) și laminat A / C (cat # L9393) de la Sigma-Aldrich; și Akt (cat # 8312) și atrogin-1 / MAFbx (cat # 33782) de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Sinteza și degradarea proteinelor

Sinteza de proteine ​​s-a măsurat pornind de la încorporarea l- [3,5-3H] tirozinei (5 uCi / ml; PerkinElmer, Waltham, MA) în proteine ​​celulare în timpul unei incubări de 24 h așa cum este descris în altă parte. 7 , 8Myotuburile au fost apoi spălate de trei ori cu PBS răcit cu gheață înainte de adăugarea a 10% acid tricloracetic (TCA) pentru a precipita proteinele. După trei spălări suplimentare de PBS, precipitatul a fost clătit de două ori cu TCA și solubilizat prin sonicare în soluție de liză (1% Triton X-100 și 1 N NaOH).Încorporarea radioactivității tirozinului radiomarcat a fost măsurată utilizând scintilația lichidă (Beckman Coulter, Brea, CA) și concentrația proteinei a fost măsurată folosind testul proteinei BCA de proteină.

s -a adăugat ll [3,5-3H] tirozină (5 uCi / ml; PerkinElmer, USA) la myotuburile C2C12 și s-a incubat 24 ore. După spălare cu DMEM ser proaspăt de 2%, miotuburile au fost tratate cu vehicul (PBS), cisplatină (50 pM) și cisplatină (50 pM) + ghrelin (1 pM). Alicoturi (200 pl) de mediu de cultură s-au luat la momente specificate pentru cuantizarea eliberării de l- [3,5-3H] tirozină. Proteinele au fost precipitate la 4 ° C cu 10% TCA și centrifugate la 37000 g timp de 5 min. Precipitatul a fost clătit de două ori cu TCA și solubilizat prin sonicare în soluție de liză (1% Triton X-100 și 1 N NaOH). Radioactivitatea în supernatantul solubil în TCA și proteinele (fracțiunea insolubilă în TCA) au fost măsurate utilizând numărarea cu scintilație lichidă. La sfârșitul perioadei de urmărire, celulele au fost clătite de două ori în PBS și precipitate la 4 ° C în 10% TCA și radioactivitatea în proteina celulară a fost măsurată așa cum s-a descris mai sus. Toată radioactivitatea este suma radioactivității reziduale din proteinele celulare și a radioactivității solubile în TCA la momente diferite de timp. Degradarea proteinei a fost exprimată ca l-[3,5-3H] tirozină eliberată ca procent din totalul de l- [3,5-3H] tirozină incorporat.

Imunofluorescența colorată

Secțiunile mușchilor TA fuzionați sau miotuburile C2C12 au fost fixate cu 4% paraformaldehidă. După trei spălări saline Tween-20 (TBST) cu tampon Tris, diapozitivele au fost blocate timp de o oră (Dako North America, Inc., Carpentaria, CA). Anticorpul primar (1: 100) a fost incubat peste noapte la 4 ° C. S-au folosit anticorpi secundari Alexa Fluor 488 sau 546 (Tehnologii Life, Grand Island, NY) cu diluții 1: 1000 și incubate 1 h la temperatura camerei. A fost utilizată 4’6-diamidino-2-fenilindol (semnalizare celulară) pentru a colora nucleele.

Pentru a evalua diferențele în zonele secțiunii transversale ale miofiberilor, s-au colorat secțiuni de 8 pm de mușchi TA cu un anticorp anti-laminin (Sigma-Aldrich). S-au măsurat zonele cu cel puțin 500 de miofibre (mărire x100) pe mușchi TA. În studiile cu miotuburi C2C12, după ce au fost colorate cu lanț greu anti-miozin / miozin (Skeletal, Fast, Sigma-Aldrich), s-au măsurat zonele de 200 de miotuburi în cel puțin 10 câmpuri (mărire × 100).

Analiza proteazomilor

Așa cum s-a descris anterior, 17 gastrocnemius a fost omogenizat în tampon de liză (20 mM Tris-HCI [pH 7,2], 0,1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM DTT, 5 mM ATP, 20% glicerol, v) Triton X-100).Lizatul a fost centrifugat și supernatantul a fost colectat. Concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând kitul de testare a proteinei BCA Pierce. Activitatea proteasomei asemănătoare cu chymotripsina a fost determinată fluorometric prin incubarea a 40 ug proteină cu 0,167 pg / pl de N-succinil-Leu-Leu-Val-Try-7-amido-4-metilcumarină (N-Suc-LLVY-AMC, Sigma-Aldrich ) în tampon de incubare (100 mM Tris-HCI [pH 7,4], 50 mM HEPES [pH 8,0] și 5 mM acid etilenglicoltetraacetic) timp de 1 oră la 37 ° C.

Testul luciferazei

Plasmida recombinantă a genei reporterului luciferazei cu miocentină a fost furnizată de Dr. Allen.Reactivul lipidic Tranfectin (Bio-Rad, Hercules, CA) a fost utilizat pentru transfecția plasmidei recombinante la myoblastele C2C12. Când celulele sunt confluente în proporție de 80%, în celule s-au adăugat complexe de ADN (plasmidă recombinantă și referință internă Renilla, phRLTK-luc, Promega, Madison, WI) și soluții de transfecție. După o incubare de 6 ore, mioblastele au fost tratate cu vehicul (PBS), ghrelin (1 pM), cisplatină (50 pM) și cisplatină (50 pM) + ghrelin (1 pM). Pentru exprimarea tranzitorie, s-a măsurat activitatea pentru activitatea genei reporter 24 ore după transfecție. Sistemul de testare a reporterului dual-luciferază (Promega) a fost utilizat pentru detectarea activității luciferazei.

analize statistice

Programul SPSS 18.00 pentru Windows (SPSS Inc., Chicago, IL) a fost folosit pentru toate analizele statistice. Parametrii sunt exprimați ca medie ± eroare standard a mediei. S-au realizat comparații statistice utilizând ANOVA cu o singură cale, urmată de ajustările testelor Tukey pentru comparații multiple.Valorile P de 0,05 sau mai mici au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic. Autorii certifică faptul că respectă liniile directoare etice privind autorizarea și publicarea Jurnalului Cachexiei, Sarcopeniei și Muschi. 19

Rezultate

Efectul ghrelinului asupra greutății corporale, masei musculare și modificărilor dimensiunii miofiberului cauzate de tumora LLC sau cisplatină

Atât LLC cât și cisplatina au indus o scădere semnificativă a greutății corporale în comparație cu animalele de control, în timp ce administrarea de ghrelin a împiedicat aceste modificări ( Figura A A și B). B ).Cisplatina și ghrelinul au împiedicat, de asemenea, aceste schimbări (pentru modelul LLC, schimbarea de la valoarea inițială a vehiculelor ucise cu căldură + HK + V 95,70 ± 4,30%, tumoare + vehicul [T + V] 83,41 ± 0,78%, iar pentru tumora + ghrelin [T + G] 96,47 ± 2,04%, P <0,05; pentru modelul de cisplatină, modificarea față de valoarea inițială pentru vehicul [V] 100,39 ± 0,41% cisplatină + ghrelin [C + G] 93,39 ± 0,61%, iar ghrelin [G] 110,20 ± 0,92%, P <0,01). Toti mușchii din piciorul posterior au prezentat o atrofie semnificativă și prevenită de ghrelin șid). D ). Paralel cu modificările masei musculare, puterea de prindere a fost semnificativ redusă prin implantarea tumorii și cisplatină, iar aceste modificări au fost împiedicate de ghrelin, subliniind impactul funcțional al acestor intervenții ( Figura 1E 1E și F). F ). Casexia în aceste două modele a fost asociată cu o scădere a consumului zilnic de alimente care a fost împiedicată și de ghrelin (pentru modelul LLC, HK + V 3,55 ± 0,13 g / zi, T + V 2,74 ± 0,16 g / zi și T + G 3,23 ± 0,08 g / zi, P <0,05; pentru modelul de cisplatină, V 3,67 ± 0,05 g / zi, C 2,55 ± 0,09 g / zi, C + G 3,12 ± 0,05 g / zi și G 4,05 ± 0,06 g / zi , P <0,01), sugerând că unul dintre mecanismele care influențează efectele ghrelinului este prin scăderea anorexiei. Implantarea LLC și administrarea cisplatinei au determinat o scădere semnificativă în zona secțiunii transversale a miocitului în mușchii TA, iar acest lucru a fost împiedicat de ghrelin (vezi Suporting Information, Figura S1 A-D, pentru modelul LLC, P <0,05; pentru modelul de cisplatină, P <0,05). Implantarea LLC și cisplatina au diminuat semnificativ masa de grăsime, măsurată prin RMN. Aceste modificări au fost împiedicate de ghrelin (pentru modificarea modelului LLC față de valoarea inițială pentru HK + V 85,25 ± 0,75%, T + V 32,80 ± 5,13% și T + G 57,53 ± 5,01%, P<0,01, pentru modificarea modelului de cisplatină de la valoarea inițială pentru V 101,70 ± 1,34%, C 60,92 ± 2,51%, C + G 85,75 ± 0,93% și G 116,66 ± 1,45%, P <0,01).

figura 1

Ghrelin îmbunătățește tumora și cachexia indusă de cisplatină. (A) Modificări ale greutății corporale în modelul de cașexie indus de carcinomul pulmonar Lewis (LLC). HK-V reprezintă grupul injectat cu LLC ucis de căldură (HK) LLC și vehicul. TV (grupuri tumorale + vehicul) și TG (grupuri tumorale + ghrelin) reprezintă animale inoculate cu LLC (106 celule) care primesc vehicul (salină) sau ghrelin (0,8 mg / kg de două ori pe zi).Modificarea este exprimată ca% din valoarea inițială. Greutatea carcasei reprezintă greutatea după scăderea masei tumorale. (B) Modificări ale greutății corporale în cazexia indusă de cisplatină. V, grupul tratat cu vehicul; C, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin; G, grupul tratat cu ghrelin.Modificarea exprimată ca% din valoarea inițială. (C) Quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterioris (TA) și masa musculară extensor digitalis longus (EDL) normalizată la greutatea corpului în stare brută (LBM) prin rezonanța magnetică nucleară în modelul de cașexie indusă de LLC. (D) Masa musculară în cazexia indusă de cisplatină. (E) Schimbarea procentului de aderență% față de valoarea inițială în comparație cu grupul HK-V în cazexia indusă de LLC. (F) Schimbarea rezistenței la aderență în cazexia indusă de cisplatină.Modificările neajustate ale greutății musculare în ambele modele (nereprezentate) urmăresc același model ca și modificările modificate ale greutății musculare prezentate în Figura 1C 1C și și DD .

Proteoliza și activitatea proteazomilor

Implantarea tumorii și administrarea de cisplatină au fost asociate cu o creștere a expresiei liganzilor ubiquitin MAFbx / Atrogin-1 și a inelului muscular deget-1 (MuRF-1) ( Figura 2A-D); 2A- D); în timp ce markerii diferențierii musculare MyoD și myogenin au scăzut prin LLC și cisplatina. Aceste modificări au fost prevenite de ghrelin, sugerând că proteoliza scăzută de ghrelin și masele musculare crescute sunt mediate cel puțin parțial prin aceste căi. De asemenea, pentru a confirma relevanța modificărilor la atrogin-1 / MuRF-1 observate în aceste modele, am măsurat activitatea proteazomului direct. Așa cum se arată în figura 2E 2E și F,F , cisplatina și LLC implantarea tumorii a crescut activarea proteazomului, iar acest lucru a fost împiedicat și de ghrelin. Transcripția Atrogin-1 și MuRF-1 este crescută parțial prin defosforilarea factorului transcripțional Fox-O1-3, care este la rândul său reglat de mediatorul central Akt. Inocularea LLC și cisplatina au scăzut fosforilarea Akt ( Figura 2C 2C și și D),D ), sugerând că această cale este implicată în LLC și atrofia musculară indusă de cisplatină.

Figura 2

Ghrelin crește markerii de sinteză a proteinelor și scade markerii proteolitici și activitatea proteazomului indusă de administrarea de tumori sau de cisplatină. nivelele mRNA de MyoD, myogenin, atrogin-1 / MAFbx, MuRF-1 și myostatin în cașexia indusă de carcinomul pulmonar Lewis (LLC) (A) și în cachexia indusă de cisplatină (B). nivelele ARNm au fost normalizate la gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și exprimate ca schimbare ori de la martori. Nivelurile de proteine ​​măsurate prin Western blot (I) în cașexia indusă de LLC (C) și în cachexia indusă de cisplatină (D). Cuantificarea atrogin-1 / MAFbx (II) și a miostatinei (III) a fost normalizată la GAPDH, p-Akt (IV) până la Akt total și p-p38 (V) la p38 total.Activitatea proteazomilor în cazexia indusă de LLC (E) și în cachexia indusă de cisplatină (F) exprimată ca unități de fluorescență arbitrare / pg proteină. HK-V, vehicul omorât cu căldură (HK) LLC +. TV (grupuri tumorale + vehicul) și TG (grupuri tumorale + ghrelin) reprezintă animale inoculate cu LLC (106 celule) care primesc vehicul (salină) sau ghrelin (0,8 mg / kg de două ori pe zi). V, grupul tratat cu vehicul; C, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin; G, grupul tratat cu ghrelin.

Myostatinul a fost reglat în sus prin inoculare cu LLC sau cisplatină, iar aceste modificări au fost, de asemenea, eliminate de ghrelin. De asemenea, se consideră că kinaza MAP p38 mediază degradarea proteinelor în cazexia de cancer prin activarea directă a atrogin-1 și prin reglarea în sus a miostatinei.Nivelurile p38 fosforilate au fost crescute prin inocularea LLC sau administrarea de cisplatină, iar acest lucru a fost prevenit de ghrelin.

Pro-inflamatorii citokine

Inflamația joacă un rol în pierderea musculară prin activarea p38 și reglarea în jos a Akt printre alte mecanisme, 20 , 21 și ghrelinul a fost propus să aibă efecte antiinflamatorii în non-cancer. Nivelurile serice ale citokinelor proinflamatorii interleukina (IL) -6, factorul de necroză tumorală (TNF) -α și IL-1β au fost semnificativ crescuți la animalele tratate cu tumori și cisplatină și acest lucru a fost prevenit prin administrarea concomitentă ghrelin  (a se vedea Informații de susținere, Figura S2 ).

Efectul ghrelinului asupra defalcării miotubelor, sintezei proteinelor și modificărilor de proteoliză induse de cisplatină in vitro

Pentru a caracteriza în continuare mecanismele care mediază efectele cisplatinei și ghrelinului în cașexie, miotuburile C2C12 au fost tratate cu vehicul, cisplatină, ghrelin sau ghrelin + cisplatină. Cisplatina a indus o scădere semnificativă a dimensiunii micotubului și a conținutului de lanț greu al miozinei, iar aceste modificări au fost împiedicate de ghrelin ( Figura 3A-D). 3A- D). Cisplatina a mărit expresia atrogin-1, MuRF-1, p38 și miostatina și a scăzut expresia Akt, myoD și myogenin, iar aceste modificări au fost împiedicate de ghrelin ( Figura 4). 4 ). Măsurătorile directe ale sintezei proteinelor și degradării în miotuburile tratate cu cisplatină sau cisplatină + ghrelin au urmat același model care confirmă relevanța acestor modificări (sinteza proteinelor după 24 de ore măsurată prin încorporarea l – [3,5-3H] tirozinei în comparație cu probele martor: cisplatină 53,00 ± 2,00%, C + G 75,50 ± 3,50%, ghrelin 114,00 ± 2,00%, P <0,01, degradare proteică după 24 ore măsurată prin eliberarea de l- [3,5-3H] tirozină comparativ cu martor: cisplatina 127,98 ± 2,14 %, C + G 102,57 ± 2,86%, ghrelin 76,57 ± 4,52%, P <0,01).

Figura 3

Ghrelin îmbunătățește distrugerea miotuburilor induse de cisplatină. (A) Colorarea cu imunofluorescență pentru anticorpi anti-miozină / lanț greu de miozină (MHC) în miotuburi C2C12. Pătrunderea MHC conturează miotuburile (roșu). 4’6-Diamidino-2-fenilindol a fost utilizat pentru a pata nucleul (albastru). (B) Dimensiunea myotuburilor exprimată ca% din vehicul. (C-D) Western blot de MHC și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) în miotuburi C2C12. V, grupul tratat cu vehicul; C, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin.

Figura 4

Ghrelin previne schimbările induse de cisplatină în sinteza și degradarea proteinelor in vitro . (A) mRNA pentru mioD, myogenin, atrogin-1 / MAFbx, MuRF-1 și myostatin normalizat la gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și exprimat ca vehicul. (B) Western blot de miotuburi C2C12 tratate cu cisplatină și ghrelin (I). Atrogin-1 / MAFbx (II), Myostatin (III) și MyoD (IV) sunt normalizați la GAPDH, p-Akt (V) până la Akt total și p-p38 V, grupul tratat cu vehicul; C, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin.

Nuclear C / EBP-β și FoxOl / 3 au fost semnificativ crescute de cisplatină și prevenite de ghrelin în miotubele C2C12 ( Figura 5A). 5A ). Apoi am confirmat importanța acestor căi pe exprimarea miostatinei utilizând un construct care exprimă luciferază alături de situsurile de legare FoxO1 / 3, SMAD 2/3 și C / EBP-p în promotorul de miostatină. Așa cum este arătat în figura 5B ,5B , activarea indusă de cisplatină a promotorului miostatinei, și aceasta a fost împiedicată de ghrelin. De asemenea, am folosit un construct diferit cu situsuri de legare FoxO1 / 3 și C / EBP-β intacte sau mutante în promotorul atrogin-1 pentru a testa contribuția relativă a acestor doi factori transcripționali la activitatea atrogin-1. Așa cum este prezentat în Figura 5C ,5C , Fox01 / 3 și C / EBP-β, ambele contribuie în mod semnificativ la activarea promotorului atrogin-1 în mod similar.

Figura 5

Mecanismul de acțiune al ghrelinului în miotuburile C2C12. (A) Western blot de factor transcripțional în extracte nucleare. (I) Blot și cuantificarea C / EBP-β (II) și FoxO1 (III) în proteine ​​nucleare, Lamin A a fost utilizat ca referință. (B) Testul de luciferază al promotorului de miostatină. Harta promotorului de miostatină (partea superioară), care include mamele FoxO, drosophila împotriva proteinei decapentaplegice (SMAD) și situsurile de legare a ADN-ului C / EBP-β și sunt legate de un vector care conține luciferază. Activitatea relativă a luciferazei (partea de jos) este exprimată ca schimbare ori de la vehicul. (C) Testul de luciferază al promotorului atrogin-1 / MAFbx. Sus este harta promotorului atrogin-1 / MAFbx, pA include situsurile de legare a ADN-ului C / EBP-β și FoxO. pA-C / EBP-β-M include un situs mutant C / EBP-p și un situs normal FoxO. pA-FOXO-M include un situs mutant FoxO și un situs normal C / EBP-p. Activitatea relativă a luciferazei exprimată ca schimbare plată față de vehicul (fund). V, grupul tratat cu vehicul; C, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin; G, grupul tratat cu ghrelin.

Supravieţuire

Masa tumorală nu a fost diferită între animalele tratate cu vehicul și ghrelin (masa tumorală pentru T + V 5,87 ± 1,08 g, iar pentru T + G 6,54 ± 1,89 g, P = 0,756). Supraviețuirea a fost redusă la animalele purtătoare de tumori și aceasta a fost îmbunătățită semnificativ prin administrarea de ghrelin ( Figura 6). 6 ).

Regimul de cisplatină folosit nu a fost letal.:)) – POTI MURI DE LA CISPLATINA!!!

Figura 6

Ghrelinul crește supraviețuirea în carachemul indus de carcinomul pulmonar Lewis (LLC) (curba Kaplan-Meyer). Zilele au supraviețuit din momentul în care au fost observate tumori și au început ghrelinul și injecțiile cu vehicule (aproximativ 7 zile după inocularea celulelor LLC). T + V, tumoră + vehicul; T + G, tumoare + ghrelină.

Mergi la:

Discuţie

Cachexia este o complicație devastatoare a cancerului care contribuie la scăderea calității vieții și la decesul precoce la persoanele cu această afecțiune. 2 Paradoxal, este exacerbată de administrarea de medicamente chimioterapeutice, cum ar fi cisplatina, și cașexia este adesea un efect secundar limitativ al dozei acestor agenți. Atrofia musculară contribuie cel mai mult la scăderea funcționalității la pacienții cu cancer și este asociată cu un risc crescut de toxicitate indusă de chimioterapie 23 și de un rezultat slab. În ciuda semnificației sale, mecanismele care stau la baza atrofiei musculare induse de cancer sau chimioterapie sunt înțelese incomplet.

Ghrelinul hormonal gastric determină creșterea în greutate prin creșterea consumului de alimente și prin mecanismele independente de admisie alimentară 8 , 24-26 , iar agoniștii receptorilor de ghrelin sau ghrelin au fost propuși ca terapii potențiale pentru cașexia cancerului, deoarece pot îmbunătăți anorexia, masa musculară și rezistența, și pierderea în greutate la pacienții cu cancer, în special cei cărora li se administrează chimioterapie pe bază de cisplatină. 27 , 11 Cu toate acestea, mecanismele lor de acțiune în mușchi rămân să fie complet elucidate.

În acest studiu, animalele tratate cu tumori și cisplatină au dezvoltat atrofie și slăbiciune musculară marcate care au fost asociate cu activarea căii ubiquitin-proteazomale. Akt fosforilat, despre care se știe că reglementează această cale prin fosforilarea factorului transcripțional FoxO 1-3, a fost scăzut de către tumoare sau cisplatină. Aceste modificări au fost prevenite prin administrarea de ghrelin în ambele modele, sugerând că efectele ghrelinului sunt mediate prin calea ubiquitin-proteazom în aceste regiuni. Este demn de remarcat faptul că celulele LLC de la diferiți furnizori se comportă oarecum diferit în ceea ce privește capacitatea lor de a induce catabolismul muscular și de a activa căi de semnalizare conexe. De exemplu, în acest studiu, am utilizat celulele LLC din ATCC, care durează 28 de zile pentru a dezvolta complet cașexia și pentru a induce reglarea în sus a MuRF1 prin activarea FoxO mediată de Akt. Cu toate acestea, celulele LLC de la National Cancer Institute (NCI) necesită doar jumătate din perioada de timp pentru a dezvolta cașexia, totuși, fără activarea FoxOs și upregulând MuRF1. Este, de asemenea, important de remarcat faptul că contribuția relativă a acestei căi la cachexia de cancer la om nu este bine înțeleasă cu aproximativ 30 dar nu toate studiile 31 care arată o creștere a degradării proteinelor prin această cale.

Citokinina inflamatorie IL-6 este crescută la stabilirea cancerului și poate scădea fosforilarea Akt prin activarea supresorului de semnalizare-3 a citokinelor. Alte citokine inflamatorii cum ar fi IL-1 β și TNF-α pot juca un rol important în inducerea cașexiei prin activarea factorilor nucleari kappa-B și MAP kinazelor, incluzând p38. 32 Grigelina a demonstrat că reduce inflamația în stabilirea sepsisului indus de LPS și a bolii renale cronice. 13 Nu se cunoaște dacă acest lucru este valabil și în ceea ce privește stabilirea cancerului. Aici, demonstrăm că implantarea tumorii și administrarea cisplatinei au crescut nivelurile citokinelor circulante, iar aceste modificări au fost prevenite prin administrarea concomitentă de ghrelin.Aceste rezultate sugerează că efectele ghrelinului în acest mediu pot fi mediate prin efectele sale antiinflamatorii, cel puțin parțial.

Sa demonstrat că kinaza MAP p38 joacă un rol în dezvoltarea cașexiei și trebuie activată prin inflamație.Cu toate acestea, rolul său specific este controversat cu rapoartele privind p38 crescând în stabilirea casexiei de cancer 29 sau scăzând în contextul pierderii musculare induse de dexametazonă. Mai mult, s-a arătat că ghrelinul descrește activarea p38 în celulele C2C12. Am constatat că nivelele fosforilate ale p38 cresc odată cu administrarea de tumori sau cisplatină și că ghrelinul a împiedicat aceste modificări.Creșterea activării p38 este descrisă în concordanță cu modelele tumorale anterioare, iar reglarea descendentă a acestei căi cu ghrelin sugerează că efectele sale în stabilirea pierderii musculare pot depinde parțial de modelul utilizat, determinându-l în jos în modele în care inflamația joacă un rol (de exemplu, cazexia indusă de cancer), dar nu și în alte modele non-inflamatorii de pierdere (de exemplu, atrofie musculară indusă de dexametazonă).

Mușchiul care se pierde în casexia de cancer a fost, de asemenea, asociat recent cu o reglare în sus a miostatinei. Myostatinul, un membru al familiei beta-factorului de creștere transformant (TGF-β) realizat în mușchi, este cunoscut că activează receptorul activin IIB și reduce semnalul Akt. De asemenea, s-a arătat că direcționarea acestei căi duce la ameliorarea cașexiei. În studiul nostru, miostatina a fost semnificativ reglată prin implantarea tumorii și prin cisplatină, iar acest lucru a fost prevenit prin administrarea de ghrelin.Acest lucru este în contrast cu un raport recent al ghrelinului care nu împiedică creșterea miostatinei induse de dexametazonă. 16 Având în vedere că p38 mediază efectele sale prin C / EBP-p și că activarea C / EBP-p, la rândul său, induce expresia miostatinei, 40am testat apoi relevanța acestei căi utilizând diferite construcții. Cisplatina a indus o creștere a C / EBP-β nucleară și a miostatinei în celulele C2C12 confirmând activarea căii p38 / C / EBP-p / myostatin în acest context. Mai mult, ghrelinul a împiedicat aceste schimbări. Luate impreuna, aceste date sugereaza ca ghrelin poate preveni activarea myostatinei prin inactivarea p38 si C / EBP-β. Acest lucru ar putea explica de ce ghrelin nu a reușit să scadă expresia miostatinei indusă de dexametazonă, un model în care stimularea p38 nu a fost observată.

Factorii de reglare miogeni MyoD și myogenin au demonstrat că joacă un rol important în cazexia indusă de tumori prin reglarea regenerării musculare și sunt reglați prin fosforilarea Akt, p38, myostatin și TNF-a. 41 , 42 Nivelurile de exprimare au scăzut în ambele modele, sugerând că proliferarea celulară prin satelit și diferențierea și regenerarea celulelor musculare pot fi afectate. Aceste modificări au fost, de asemenea, prevenite prin administrarea de ghrelin in vivo în ambele modele. Acest lucru evidențiază un potențial nou mecanism pentru ghrelin de ameliorare a cașexiei. 43

De asemenea, am dezvoltat un model de toxicitate cisplatinei în celulele C2C12 pentru a determina dacă efectele cisplatinei s-au datorat unui efect direct asupra celulelor musculare. Administrarea cisplatinei la celulele C2C12 a provocat atrofie miotubă și aceasta a fost asociată cu activarea pg38, miostatinei și liganzilor ubiquitin atrogin-1 și MuRF-1 împreună cu reglarea în jos a Akt și calea regenerativă (MyoD și myogenin) a demonstrat in vivo . Acest lucru sugerează că cisplatina exercită cel puțin o parte din efectele sale direct asupra mușchiului și este în acord cu un raport anterior al cisplatinei care induce atrofie la miotub prin intermediul reglementării Akt în jos. 44Efectele tratamentului cu cisplatină asupra celulelor C2C12 pot, de asemenea, să reprezinte perturbarea procesului de diferențiere și sa sugerat înainte ca ghrelinul să poată restabili acest proces. 37 Ghrelin a crescut aportul de alimente și se crede că aceasta mediază unele, dar nu toate, efectele sale în acest cadru, așa cum am arătat recent 8 și alții 45 . Aceste studii in vitro sugerează că ghrelinul își exercită efectele cel puțin parțial direct asupra celulelor musculare, independent de efectele sale orexigene, după cum sugerează aceste studii anterioare.

Singurul receptor identificat pentru ghrelin până la această dată este GHSR-1a, iar acest receptor nu este exprimat în țesut muscular sau celule C2C12. 46 , 16 Cu toate acestea, rapoartele recente sugerează că unele dintre efectele ghrelinului nu sunt mediate prin acest receptor. 47 , 16 noastre in vitro studiile arata ca ghrelin poate preveni atrofia indusă de cisplatină în absența GHSR-1a. Foarte recent, receptorul factorului 2 de eliberare a corticotrofinei a fost postulat pentru a media o parte din efectul ghrelinului asupra metabolismului glucozei. 48 Studiile viitoare ar trebui să se concentreze pe aceasta sau despre alte căi alternative care ar putea explica efectele ghrelin lui în absența GHSR-1a.

În cele din urmă, administrarea de ghrelin conduce la creșterea supraviețuirii la animalele care poartă tumori, indicând faptul că beneficiile îmbunătățirii masei musculare depășesc pur și simplu o creștere a funcționalității. Acest lucru este, de asemenea, relevant având în vedere potențialele preocupări pentru un agent anabolic cum ar fi ghrelinul în inducerea creșterii tumorale și agravarea rezultatelor. Desi in vitrostudiile au dat rezultate contradictorii cu unele prezentând o creștere și unele care arată o scădere a proliferării celulare cu administrarea ghrelin, 49 , 50 toate in vivo modele și studii umane în care au fost utilizate ghrelin sau ghrelin mimeticele nu au demonstrat o creștere a proliferării tumorale , deși niciunul dintre aceste studii nu a raportat anterior supraviețuirea. 51 , 52

În rezumat, prezentăm aici modul în care căile multiple interacționează și sunt implicate în dezvoltarea cașexiei induse de o tumoră sau paradoxal de agentul chimioterapeutic cisplatină. Activarea p38 / C / EBP-β, a miostatinei și a citokinelor inflamatorii și o scădere a Akt și Myogenin / myoD conduc în cele din urmă la proteoliză sporită, la scăderea masei musculare și la rezistență. Noul hormon ghrelin previne atrofia musculară prin scăderea inflamației, prin reglarea în jos a căii p38 / C / EBP-β / myostatin și prin creșterea fosforației Akt și prin activarea miogeninei și mioD. Creșterea forței musculare și a supraviețuirii induse de ghrelin în animalele purtătoare de tumori evidențiază relevanța clinică a acestor rezultate.

Recunoasteri

Îi mulțumim doctorului David Allen (Univ. Din Colorado, Boulder) că ne-a oferit promotorul de miostatină și dr. Pradip Saha pentru ajutorul său în măsurarea sintezei și degradării proteinelor.

Confirmare

Autorii certifică faptul că respectă liniile directoare etice privind autorizarea și publicarea Jurnalului Cachexiei, Sarcopeniei și Muscle (von Haehling S, Morley JE, Coats AJS, Anker SD.) Ghidul etic pentru autor și publicare în Journal of Cachexia, Sarcopenia și Muscle, J. Cachexia Sarcopenia Muscle, 2010, 1: 7-8).

Finanțarea

Departamentul Afacerilor Veteranilor din SUA (Granturile de merit I01-BX000507 și I01 CX000174, Programul de evaluare a meritelor de intrare și un premiu de dezvoltare a carierei de dezvoltare a rețelei de asistență medicală din Europa Centrală); Caroline Wiess Legea Fondului de Medicină Moleculară; Institutele naționale de sănătate (AG040583 la JMG și AR063786 la YPL); Institutul Național de îmbătrânire (T32AG000183) în BG; Fundația Națională de Științe Naturale din China (81072262 și 81372944) către JAC; Vanderbilt MMPC (susținut în parte de U24 DK59637); Centrul Medical Vanderbilt Medical Center pentru analiza hormonului și servicii analitice Core (susținut de granturile naționale DK059637 și DK020593); Universitatea din Virginia (DK076037); și Centrul de Cercetare pentru Diabet și Endocrinologie Baylor (P30 DK079638).

Conflictele de interese

Jose M Garcia primește sprijin pentru cercetare și este consultant pentru Aeterna Zentaris, Inc și Helsinn Therapeutics, Inc.

informatii justificative

Informațiile de susținere sunt disponibile la Jurnalul de Casexia, Sarcopenie și Muschi online.

Figura S1. Ghrelin previne scăderea dimensiunii miofiberului cauzată de tumoare sau cisplatină. ( A ) Colorarea cu imunofluorescență pentru anticorpul anti-laminin al mușchilor TA în cașexia indusă de LLC. Lamininul colorat (verde) conturează miofiurile. Dapi a fost folosit pentru a pata nucleele (albastru). ( B ) Colorarea cu imunofluorescență pentru anticorpul anti-laminin al mușchiului TA în cachexia indusă de cisplatină. ( C ) aria medie a secțiunii transversale a miofiberilor în cazexia indusă de LLC. ( D ) Aria medie a secțiunii transversale a miofiberilor în cazexia indusă de cisplatină. HK-V reprezintă grupul injectat cu LLC ucis de căldură (HK) LLC și vehicul. TV și grupul TG reprezintă animale inoculate cu LLC (10 ⁶celulele care primesc vehicul (salin) sau ghrelin (0,8 mg / kg de două ori pe zi). V, grupul tratat cu vehicul, grupul tratat cu cisplatină; CG, grupul tratat cu cisplatină + ghrelin; G, grupul tratat cu ghrelin. * P <0,05, ** P <0,01, comparativ cu grupul HK-V sau vehicul; § P <0,05, §§ P <0,01 comparativ cu grupul TV sau C.

Figura S2. Nivelurile serice ale IL-6, TNF-a și IL-1p în cașexia indusă de LLC ( A ) și cașexia indusă de cisplatină ( B ). Ghrelin previne creșterea acestor citokine proinflamatorii induse de cașexia indusă de tumori și cisplatină. * P <0,05 comparativ cu grupul HK-V sau vehicul; § P <0,05 comparativ cu grupul TV sau C.

Sprijinirea elementului info

Faceți clic aici pentru a vedea. ^{(1,8 M, tif)}

Sprijinirea elementului info

Faceți clic aici pentru a vedea. ^{(402 K, tif)}

Sprijinirea elementului info

Faceți clic aici pentru a vedea. ^{(14K, docx)}

J Cachexia Sarcopenie Muscle . 2015 iunie; 6 (2): 132-143.

Publicat online 2015 Apr 22 doi: 10.1002 / jcsm.12023

PMCID: PMC4458079

PMID: 26136189

( ²⁾ , Jiaohua Luo ( ^2), Meenal Mendiratta ( ²⁾ , Blaga Belinova ( ²⁾ , Tripti Halder ( ²⁾ , Guohua Zhang ( ⁴⁾ și Jose M Garcia ( ^2) 5, *

Informații despre autori ► Note de articol ► Drepturi de autor și informații privind licența ► Disclaimer

Acest articol a fost citat de alte articole din PMC.

Referințe

• Fearon K, Strasser F, Anker SD, Bosaeus I, Bruera E, Fainsinger RL, și colab. Definirea și clasificarea cașexiei cancerului: un consens internațional. Lancet Oncol. 2011; 12 : 489-495.[ PubMed ]
• Utech AE, Tadros EM, Hayes TG, Garcia JM. Prezicerea supraviețuirii la pacienții cu cancer: rolul cașexiei și markerilor hormonali, nutriționali și inflamatori. J Cachexia Sarcopenie Muscle. 2012; 3 : 245-251. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Micul JP, Phillips SM. Exerciții de rezistență și nutriție pentru a contracara pierderea musculară. Appl Physiol Nutr Metab. 2009; 34 : 817-828. [ PubMed ]
• Loprinzi CL, Kugler JW, Sloan JA, Mailliard JA, Krook JE, Wilwerding MB, și colab. Compararea aleatorie a acetatului de megestrol față de dexametazonă față de fluoximeteron pentru tratamentul anorexiei / cașexiei cancerului. J Clin Oncol. 1999; 17 : 3299-3306. [ PubMed ]
• Lecker SH, Solomon V, Mitch WE, Goldberg AL. Distrugerea proteinei musculare și rolul critic al căii ubiquitin-proteazom în stările normale și de boală. J Nutr. 1999; 129 : 227S-237S. [ PubMed ]
• Cai D, Frantz JD, Tawa NE, Jr, Melendez PA, Oh BC, Lidov HG și colab. Activarea IKKbeta / NF-kappaB cauzează pierdere musculară severă la șoareci. Cell. 2004; 119 : 285-298. [ PubMed ]
• Fearon KC, Glass DJ, Guttridge DC. Canceria cailor: mediatori, semnalizare și căi metabolice. Cell Metab. 2012; 16 : 153-166. [ PubMed ]
• Garcia JM, Scherer T, Chen JA, Guillory B, Nassif A, Papusha V și colab. Inhibarea catabolismului lipidic indus de cisplatină și pierderea în greutate de către ghrelin la șoarecii masculi. Endocrinologie. 2013; 154 : 3118-3129. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Wisse BE, Frayo RS, Schwartz MW, Cummings DE. Inversarea anorexiei de cancer prin blocarea receptorilor centrali de melanocortină la șobolani. Endocrinologie. 2001; 142 : 3292-3301.[ PubMed ]
• Garcia JM, Garcia-Touza M, Hijazi RA, Taffet G, Epner D, Mann D, și colab. Nivelurile active de ghrelin și raportul total de ghrelin activ în cazexia indusă de cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90 : 2920-2926. [ PubMed ]
• Garcia JM, Friend J, Allen S. Potențialul terapeutic al anamorelinului, un roman mimetic ghrelinic, la pacienții cu cașexie asociată cancerului: un studiu pilot multicentric, randomizat, dublu-orb, crossover. Asistență pentru îngrijirea cancerului. 2013; 21 : 129-137. [ PubMed ]
• Murphy MG, Plunkett LM, Gertz BJ, He W, Wittreich J, Polvino WM și colab. MK-677, un secretagog al hormonului de creștere pe cale orală, inversează catabolismul indus de dietă. J Clin Endocrinol Metab. 1998; 83 : 320-325. [ PubMed ]
• Dixit VD, Schaffer EM, Pyle RS, Collins GD, Sakthivel SK, Palaniappan R, și colab. Ghrelinul inhibă exprimarea citokinelor proinflamatorii induse de leptină și activare de către monocitele umane și celulele T. J Clin Invest. 2004; 114 : 57-66. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Garcia JM, Polvino WJ. Efecte hormonale farmacodinamice ale anamorelinului, un nou mimetic de ghrelin oral și secretagogon de hormon de creștere la voluntari sănătoși. Hormul de creștere IGF Res.2009; 19 : 267-273. [ PubMed ]
• Kos K, Harte AL, O’Hare PJ, Kumar S, McTernan PG. Ghrelin și reglarea diferențială a des-acilului (DSG) și ghrelinului oct-anoil (OTG) în țesutul adipos uman (AT) Vol. 70. Clin Endocrinol (Oxf); 2009. pp. 383-389. [ PubMed ]
• Porporato PE, Filigheddu N, Reano S, Ferrara M, Angelino E, Gnocchi VF și colab. Ghrelinul acilat și neacilat afectează atrofia mușchilor scheletici la șoareci. J Clin Invest. 2013; 123 : 611-622.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Zhou X, Wang JL, Lu J, Song Y, Kwak KS, Jiao Q, și colab. Inversarea canhexiei și a pierderii musculare de către antagoniștii ActRIIB duce la supraviețuirea prelungită. Cell. 2010; 142 : 531-543.[ PubMed ]
• Allen DL, Unterman TG. Reglarea expresiei miostatinei și diferențierii mioblastelor de către factorii de transcripție FoxO și SMAD. Am J Physiol Cell Physiol. 2007; 292 : C188-C199. [ PubMed ]
• von Haehling S, Morley JE, Coats AJ, Anker SD. Instrucțiuni etice pentru autor și publicare în Jurnalul Cachexiei, Sarcopeniei și Musculaturii. J Cachexia Sarcopenie Muscle. 2010; 1 : 7-8.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Paul PK, Gupta SK, Bhatnagar S, Panguluri SK, Darnay BG, Choi Y și colab. Ablația țintită a TRAF6 inhibă risipirea mușchilor scheletici la șoareci. J Cell Biol. 2010; 191 : 1395-1411.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Zhang L, Du J, Hu Z, Han G, Delafontaine P, Garcia G, și colab. IL-6 și sinergia serică a amiloidului A mediază pierderea musculară indusă de angiotensina II. J Am Soc Nephrol. 2009; 20 : 604-612.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Deboer MD, Zhu X, Levasseur PR, Inui A, Hu Z, Han G și colab. Tratamentul cu ghrelin al bolii renale cronice: îmbunătățiri ale masei corporale slabe și a profilului citokinelor. Endocrinologie.2008; 149 : 827-835. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Prado CM, Baracos VE, McCargar LJ, Mourtzakis M, Mulder KE, Reiman T, și colab. Compoziția corpului ca determinant independent al toxicității chimioterapice pe bază de 5-fluorouracil. Clin Cancer Res. 2007; 13 : 3264-3268. [ PubMed ]
• Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghrelin induce adipozitatea la rozătoare. Natură. 2000; 407 : 908-913. [ PubMed ]
• Granore M, Priego T, Martin AI, Villanua MA, Lopez-Calderon A. Ghrelin, agonistul receptorului GHRP-2 previne creșterea indusă de artrită în expresiile genelor MuRF1 și MAFbx în mușchiul scheletic în enzimele de legare a ubiquitinei E3. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005; 289 : E1007-E1014. [ PubMed ]
• Sugiyama M, Yamaki A, Furuya M, Inomata N, Minamitake Y, Ohsuye K, și colab. Ghrelinul îmbunătățește pierderea în greutate corporală și catabolismul mușchilor scheletici asociate cu cașexia indusă de angiotensina II la șoareci. Regula Pept. 2012; 178 : 21-28. [ PubMed ]
• Hiura Y, Takiguchi S, Yamamoto K, Kurokawa Y, Yamasaki M, Nakajima K, și colab. Scăderea concentrațiilor plasmatice de ghrelină după chimioterapia pe bază de cisplatină la pacienții cu cancer esofagian. Int J Clin Oncol. 2012; 17 : 316-323. [ PubMed ]
• Sandri M, Sandri C, Gilbert A, Skurk C, Calabria E, Picard A, și colab. Factorii de transcripție Foxo induc atrofia-1 legată de atributul ubiquitin și provoacă atrofie musculară scheletică. Cell. 2004; 117: 399-412. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Zhang G, Jin B, Li YP. C / EBPbeta mediază reglarea uroquitin ligazei indusă de tumori, atrogin1 / MAFbx, și pierderea musculară. EMBO J. 2011; 30 : 4323-4335. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Soarele YS, Ye ZY, Qian ZY, Xu XD, Hu JF. Exprimarea TRAF6 și a mRNA ubiquitin în mușchii scheletici ai pacienților cu cancer gastric. J Exp Clin Cancer Res. 2012; 31 : 81.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Stephens NA, Gallagher IJ, Rooyackers O, Skipworth RJ, Tan BH, Marstrand T, și colab. Folosind transcriptomics pentru a identifica si validarea biomarkerilor noi de cașexie cancerului de mușchi scheletici umane. Genome medicine. 2010; 2 : 1. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Li YP, Chen Y, John J, Moylan J, Jin B, Mann DL, și colab. TNF-alfa acționează prin intermediul p38 MAPK pentru a stimula exprimarea ligandului ubiquitin atrogin1 / MAFbx în mușchiul scheletic. FASEB J. 2005; 19 : 362-370. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Clavel S, Siffroi-Fernandez S, Coldefy AS, Boulukos K, Pisani DF, Derijard B. Reglarea localizării intracelulare a Foxo3a prin căi de semnalizare a protein kinazei activate în stres în celulele musculare scheletice. Mol Cell Biol. 2010; 30 : 470-480. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Cuadrado A, Nebreda AR. Mecanisme și funcții ale semnalizării p38 MAPK. Biochem J. 2010; 429 : 403-417. [ PubMed ]
• McClung JM, judecător AR, Powers SK, Yan Z. p38 MAPK afectează stresul oxidativ la expresia genelor legate de autofagie în pierderea musculară cachectică. Am J Physiol Cell Physiol. 2010; 298: C542-C549. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Kim J, Won KJ, Lee HM, Hwang BY, Bae YM, Choi WS și colab. p38 MAPK participă la atrofia mediată de inelul 1 în inimă musculară în mușchiul gastrocnemius de șobolan imobiliar turnat. Jurnalul coreean de fiziologie și farmacologie: Jurnalul Oficial al Societății fiziologice coreene și Societatea coreeană de farmacologie. 2009; 13 : 491-496. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Filigheddu N, Gnocchi VF, Coscia M, Cappelli M, Porporato PE, Taulli R, și colab. Ghrelinul și glicina des-acilică favorizează diferențierea și fuziunea celulelor musculare scheletice C2C12. Mol Biol Cell. 2007; 18 : 986-994. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Morissette MR, Cook SA, Buranasombati C, Rosenberg MA, Rosenzweig A. Myostatin inhibă hipertrofia miotubă indusă de IGF-I prin Akt. Am J Physiol Cell Physiol. 2009; 297 : C1124-C1132.[ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Trendelenburg AU, Meyer A, Rohner D, Boyle J, Hatakeyama S, Glass DJ. Myostatinul reduce semnalarea Akt / TORC1 / p70S6K, inhibând diferențierea mioblastelor și dimensiunea micotubului. Am J Physiol Cell Physiol. 2009; 296 : C1258-C1270. [ PubMed ]
• Allen DL, Cleary AS, Hanson AM, Lindsay SF, Reed JM. Extracția proteinei-delta legată de CCAAT / amplificator este crescută în mușchiul scheletic rapid prin privarea alimentară și reglează transcripția miostatinei in vitro. Am J Physiol Regul Integral Comp Physiol. 2010; 299 : R1592-R1601. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Layne MD, agricultor SR. Factorul de necroză tumorală-alfa și factorul de creștere a fibroblastelor bazice inhibă diferențiat expresia miogeninei induse de factorul de creștere-I de insulină-I în mioblastele C2C12. Exp Cell Res. 1999; 249 : 177-187. [ PubMed ]
• Penna F, Costamagna D, Fanzani A, Bonelli G, Baccino FM, Costelli P. Pierderea musculară și miogeneza afectată la șoarecii purtători de tumori sunt prevenite prin inhibarea ERK. Plus unu. 2010;5 : e13604. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
• Zhang W, Zhao L, Mulholland MW. Ghrelin stimulează dezvoltarea miocitului. Fiziologie celulară și biochimie: jurnal internațional de fiziologie celulară experimentală, biochimie și farmacologie. 2007;20 : 659-664. [ PubMed ]
• Fanzani A, Zanola A, Rovetta F, Rossi S, Aleo MF. Cisplatina declanșează atrofia myotubelor scheletice C2C12 prin afectarea căii de semnalizare Akt și prin creșterea ulterioară a activității sistemelor de proteazom și autofagie. Toxicol Appl Pharmacol. 2011; 250 : 312-321. [ PubMed ]
• Sakai H, Sagara A, Arakawa K, Sugiyama R, Hirosaki A, Takase K, și colab. Mecanisme de atrofie musculară indusă de cisplatină. Toxicol Appl Pharmacol. 2014; 278 : 190-199. [ PubMed ]
• Sun Y, Garcia JM, Smith RG. Ghrelin și expresia receptorului secretor de hormon de creștere la șoareci în timpul îmbătrânirii. Endocrinologie. 2007; 148 : 1323-1329. [ PubMed ]
• Sheriff S, Kadeer N, Joshi R, prietenul LA, James JH, Balasubramaniam A. Des-acil ghrelin prezintă efecte proanabolice și anti-catabolice asupra miotubelor C2C12 expuse la citokine și reduc proteoliza musculară indusă de arsură la șobolani. Mol Cell Endocrinol. 2012; 351 : 286-295. [ PubMed ]
• Gershon E, Vale WW. Receptorii CRF de tip 2 mediază efectele metabolice ale ghrelinului în celulele C2C12. Obezitatea (primăvara de argint) 2014; 22 : 380-389. [ Articol gratuit PMC ][ PubMed ]
• Cassoni P, Papotti M, Catapano F, Ghe C, Deghenghi R, Ghigo E, și colab. Locații specifice de legare pentru secretagogii sintetici ai hormonului de creștere sintetic în țesutul tiroidian uman ne-tumoral și neoplastic. J Endocrinol. 2000; 165 : 139-146. [ PubMed ]
• Cassoni P, Papotti M, Ghe C, Catapano F, Sapino A, Graziani A, și colab. Identificarea, caracterizarea și activitatea biologică a receptorilor specifici pentru secretagogii naturali (ghrelin) și hormon de creștere sintetici și analogi în carcinoamele de sân umane și liniile celulare. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86 : 1738-1745. [ PubMed ]
• Hanada T, Toshinai K, Kajimura N, Nara-Ashizawa N, Tsukada T, Hayashi Y, și colab. Efectul anti-cachectic al ghrelinului asupra șoarecilor goi care poartă celule de melanom umane. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 301 : 275-279. [ PubMed ]
• Wang W, Andersson M, Iresjo BM, Lonnroth C, Lundholm K. Efectele ghrelinului asupra anorexiei la șoarecii purtători de tumori cu cașexie legată de eicosanoid. Int J Oncol. 2006; 28 : 1393-1400.[ PubMed ]

---

Articolele din Jurnalul de Cachexia, Sarcopenia și Muscle sunt oferite aici prin amabilitatea lui Wiley-Blackwell