Hochuekkito (TJ-41), o formulă Kampo, ameliorează cașexia indusă de adenocarcinom colon 26 la șoareci

Abstract

Casexia, o cauză majoră a deceselor cauzate de cancer, se caracterizează prin epuizarea țesuturilor musculare și grase, anorexiei, asteniei și hipoglicemiei. Studiile recente arată că secrețiile citokinelor proinflamatorii, cum ar fi interleukina-6 (IL-6), joacă un rol crucial în dezvoltarea cașexiei și că aceste citokine sunt secretate nu numai din celulele canceroase, ci și din celulele gazdă, cum ar fi macrofagele. În acest studiu, am investigat efectele terapeutice ale hochuekkito, o formulă Kampo, asupra cașexiei induse de adenocarcinomul de colon 26 la șoareci. Tratamentul cu Hochuekkito nu a inhibat creșterea tumorală, dar a atenuat în mod semnificativ reducerea greutății carcasei, aportul de alimente și apă, greutatea mușchiului gastrocnemius și a țesutului adipos din jurul testiculelor și scăderea nivelului trigliceridelor serice în comparație cu martorii. Mai mult, tratamentul cu hochuekkito a redus semnificativ nivelul IL-6 al serului și nivelul de exprimare a IL-6 în macrofagele țesuturilor din jurul tumorii. Studiile in vitro au arătat că hochuekkito a suprimat producția de IL-6 prin celule macrofage THP-1 sau RAW264.7, deși nu a afectat producția de IL-6 de către celulele carcinomului de colon 26. Aceste rezultate sugerează că hochuekkito inhibă producerea citokinelor proinflamatorii, în special IL-6, de către celulele gazdă cum ar fi macrofagele. Prin urmare, hochuekkito poate fi un agent anticachetic promițător pentru tratamentul pacienților cu cancer.

1. Introducere

Cachexia de cancer, care se caracterizează prin pierderea mușchiului și a țesutului gras, precum și anorexia, astenia și anemia, face ca intervențiile terapeutice să fie dificilă la pacienții cu cancer [ 1 , 2 ]. Casexia este asociată nu numai cu deteriorarea calității vieții (QOL), ci și cu o perioadă mai scurtă de supraviețuire [ 1 , 2 ]. Prin urmare, este important să se gestioneze starea de cachectică la pacienții cu cancer. Cu toate acestea, terapiile curente pentru casexia de cancer au un beneficiu limitat datorită eficacității slabe și multiplelor efecte secundare [ 3 ]. Stabilirea unei noi modalități terapeutice pentru prevenirea stării casectice cu puține efecte secundare este necesară pentru pacienții cu cancer cu cașexie.

Deși mecanismele precise ale cașexiei de cancer nu sunt pe deplin elucidate, acum este clar că citokinele proinflamatorii, cum ar fi interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală- α (TNF- a ) celulele gazdă, sunt implicate în inducerea și dezvoltarea cașexiei cancerului4 , 5 ]. Aceste citokine au demonstrat că produc alterarea metabolică, ducând la pierderea țesuturilor musculare și adipoase în gazdă [ 6 ]. Dintre acestea, IL-6 este considerat un mediator cheie în patogeneza cașexiei de cancer. La pacienții cu cancer, niveluri ridicate de IL-6 circulant au fost observate cu aproape orice tip de tumoare și au prezis un rezultat slab [ 7 ]. În cazul modelelor experimentale pe animale, tratamentul cu anticorpi monoclonali la receptorii IL-6 sau IL-6 a suprimat în mod semnificativ dezvoltarea cașexiei la șoarecii purtători de tumori8 , 9 ].Recent, am raportat că tocilizumab, anticorpul monoclonal umanizat împotriva receptorului IL-6, a avut efectul dramatic asupra cașexiei la un pacient cu cancer pulmonar care supraexprimă IL-610 ]. Aceste linii de dovezi indică faptul că citokinele proinflamatorii, cum ar fi IL-6, joacă roluri pivotante în patogeneza cașexiei de cancer și sunt ținte potențiale pentru terapia pacienților cu cancer cu o stare casectică.

Hochuekkito este o formulă Kampo și este compusă din 10 specii de plante medicinale.

 

Acesta a fost folosit pe scară largă pentru tratamentul plângerilor de oboseală generală cauzate de răcelile comune cu puține efecte secundare. Hochuekkito a îmbunătățit QOL și starea imunologică a pacienților vârstnici [ 11 , 12 ]. În plus, tratamentul cu hochuekkito a ameliorat inflamația sistemică și pierderea în greutate corporală și îmbunătățirea stării nutriționale și QOL la pacienții cu boală pulmonară obstructivă cronică (COPD) [ 13].

Aceste rapoarte anterioare ne-au determinat să investigăm eficacitatea hochuekkito în cașexie. Aici, am examinat efectele hochuekkito asupra severității parametrilor cheie ai cașexiei în modelul murinic bine stabilit de cașexie experimentală indusă de adenocarcinomul colonului 26 (C26). De asemenea, am investigat efectele hochuekkito asupra producerii de citokine proinflamatorii incluzând IL-6 din celulele adenocarcinom C26 și două linii de celule macrofage in vitro și am discutat despre semnificația hochuekkito în tratamentul casexiei de cancer.

2. Materiale și metode

2.1. animale

Șoarecii BALB / c masculi fără virus au fost achiziționați de la Japonia SLC (Hamamatsu, Japonia) la vârsta de 5 până la 6 săptămâni. Animalele au fost adăpostite în grup (5 pe cușcă) la o temperatură de 24 ± 2 ° C, o umiditate relativă de 55% ± 10% și un ciclu de lumină de 12 ore / 12 ore de întuneric. După obișnuirea timp de o săptămână, șoarecii au fost adăpostiți câte 2 pe cușcă pe tot parcursul experimentului.Apa clorinată și alimentele iradiate au fost furnizate ad libitum. Toate procedurile efectuate asupra animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) al Universității Juntendo, numărul de aprobare 220010.

2.2. Droguri

Hochuekkito (TJ-41, Lot nr. 2100041010)a fost furnizat de la Tsumura Co. (Tokyo, Japonia).

Hochu-ekki-to/Bu-Zhong-Yi-Qi Tang/Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang se fabrică sub formă de pulbere uscată prin pulverizare cu extract de apă fierbinte obținută din 10 plante medicinale în următorul raport: Rădăcina Astragalus (4,0 rădăcini de Astragalus membranaceus Bunge), Atractylodes Lancea Rizom (4,0, rizomii de Atractylodes lancea DC.), Ginseng Radacina (4.0, rădăcini de Panax ginseng CA Meyer), Angelica Radacina (3.0, rădăcini de Angelica acutiloba Kitagawa), Bupleurum Radacina (2.0), Zizyphi Fruct (2.0, Rehder), Aurantii Bobilis Pericarpium (2,0, pericarp de fructe coapte de Citrus unshu Markovich), Glycyrrhizae radacina (1,5, rădăcini de Glycyrrhiza uralensis Fisch și DC), Cimicifugae Rizom (1,0, rizomii de Cimicifuga simplex Worms kjord) și Zingiberis Rizom (0,5, rizomii de Zingiber officinale Roscoe).

Radix Astragali Membranacei
Radix Codonopsis Pilosulae
Radix Angelicae Sinensis
Rhizoma Atractylodis Macrocephalae
Pericarpium Citri Reticulatae
Rhizoma Cimicifugae
Radix Bupleuri Chinensis
Radix Glycyrrhizae Uralensis
Rhizoma Zingiberis Officinalis Recens
Fructus Jujubae

plantele medicinale traditionale chinezesti TCM / CHM si koreene si formulele derivate cu si din acestea le cautati dupa nume pe

http://www.activeherb.com/

http://www.activeherb.com/chineseherbs

http://www.activeherb.com/buzhong/

Calitatea anumitor indicatori ai acestui medicament este controlată prin măsurarea conținutului prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Profilul chimic al Hochuekkito obținut prin analiza 3D HPLC este prezentat în figura 1 .

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ECAM2012-976926.001.jpg

Profilul tridimensional HPLC al hochuekkito. Fiecare vârf din profilul HPLC al hochuekkito a fost identificat prin comparație cu timpii de retenție și spectrele UV ale compușilor standard definiți chimic. Condițiile HPLC au fost: coloană: Tosoh TSK GEL ODS-80Ts (4,6 x 250 mm), purtător A: acetat de amoniu 0,05 M (pH 3,6), purtător B: acetonitril, gradient: purtător linear 10-100% B în 60 min, : 1,0 mL min -1 și volum de injecție: 30 μ L. Detector: Shimadzu SPD-M10A VP.

2.3. Linii telefonice

Adenocarcinomul Colon 26 (C26) (clona 20) cu o capacitate puternică de a induce cașexie letală la șoareci a fost furnizat de laboratorul Chugai Pharmaceutical Co. (Kamakura, Japonia) [ 14 ]. Linia celulară macrofagă umană THP-1 a fost obținută de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Linia celulară macrofagă de șoarece, celule RAW264.7, a fost achiziționată de la Riken Cell Bank (Tsukuba, Japonia). Celulele au fost menținute în RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japonia) cu 10% ser fetal bovin (FBS) și penicilină și streptomicină (100 U / ml și 100 ug / ml, respectiv).

2.4. Modele de mouse de Cachexia

Celulele C26 (clona 20) (1 x 106) au fost inoculate subcutanat (sc) în flancul drept al fiecărui șoarece.Creșterea tumorii a fost măsurată de două ori pe săptămână utilizând un etrier digital și înregistrată ca cea mai lungă lungime a suprafeței (a) și lățimea (b) în cm. Volumul tumoral ( V , cm3) a fost calculat conform următoarei formule: V = ab 2/2 . Șoarecii au fost repartizați aleatoriu în 4 grupe. Grupa 4 a primit dieta standard amestecată cu hochuekkito la o doză de 1% (adică 1,2 g / kg greutate corporală) [ 15,16 ] în zilele 0-14 după injectarea tumorală. Acest grup a fost denumit Tumor (+), hochuekkito (+). Pentru a diseca efectele specifice hochuekkito asupra cașexiei, dieta la fel ca cea administrată grupului 4 a fost administrată unui alt grup de șoareci (grupul 2), iar acest grup a fost marcat Tumor (-), hochuekkito (+) și un alt grup de tumori (grupa 3, grupul a fost marcat Tumor (+), hochuekkito (-)). Grupul de control sănătoși a inclus șoareci potriviți în funcție de vârstă fără tratament (grupa 1; această grupă a fost denumită Tumor (-), hochuekkito (-)). Grupurile 1 și 2 au constat din 5 șoareci, iar alte grupuri au constat din 4 șoareci. Toate experimentele au fost efectuate de două ori. Pe parcursul experimentelor de timp, șoarecii au fost atent monitorizați și s-au măsurat greutatea corporală și aportul alimentar / apă. Cincisprezece zile după inocularea tumorii, șoarecii au fost anesteziați cu somnopentil și au fost eutanasiate. În momentul sacrificării, tumora, mușchiul gastrocnemius și țesutul adipos din jurul testiculelor au fost disecate și cântărite [ 17 , 18 ]. Greutatea carcasei a fost calculată ca diferența dintre greutatea întregului corp și tumoră așa cum a fost descris anterior [ 14 ]. Greutatea tumorii a fost estimată din volumul tumorii ( V = ab 2/2 ) prin înmulțirea acesteia cu un factor de corecție, care a fost determinat prin compararea greutăților reale cu volumele tumorii [ 19 ]. S-au colectat probe de sânge și serul s-a separat în decurs de 1 oră de sacrificare. Valorile serice ale IL-6 și ale factorului de necroză tumorală (TNF- a ) au fost măsurate prin testul imunosorbant legat de enzime (ELISA) utilizând kitul ELISA de șoarece IL-6 și TNF- a (R & D Systems, Minneapolis, MN, SUA). În plus, pentru a determina starea nutrițională a animalelor, am măsurat concentrațiile serice de glucoză, trigliceride, colesterol total, hemoglobină (Hb) și hematocrit (Hct) și numărul de celule albe din sânge (WBC) , iar plachetele (Plt) se numără în sânge utilizând teste de laborator.

2.5. Analiza imunohistochimică

Țesutul a fost fixat în paraformaldehidă 4%, înglobat în parafină și tăiat în secțiuni groase de 4 pm .Secțiunile au fost epuizate de parafină și apoi au fost rehidratate într-o serie de soluții de etanol gradate.Pentru analiza imunohistochimică s-au folosit secțiuni seriale din aceeași probă. Secțiunile au fost spălate cu soluție salină tamponată cu Tris (TBS), supuse recoltării prin încălzire timp de 10 minute la 100 ° C în citrat de sodiu 0,01 M (pH 6,0) și expuse la 3% H202 înainte de incubarea cu anticorpi primari, Anticorpul Mac-1 / CD11b (BD Pharmingen, NJ, SUA) sau anticorpul IL-6 (Abcam, Cambridge, UK). Complexele complexe s-au detectat cu ajutorul unui kit Vectastain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) și 3,3-diaminobenzidinei, iar secțiunile au fost contracarate cu hematoxilină.

Zonele care conțin macrofage de infiltrare Mac-1 / CD11b-pozitive au fost identificate mai întâi prin scanarea secțiunilor țesuturilor, iar numărul de macrofage a fost determinat în 4 astfel de zone sub x 200-mărire. Suprafața pozitivă pentru imunoreactivitatea Mac-1 / CD11b sau IL-6 a fost cuantificată cu ajutorul software-ului BZ Analyzer (Keyence, Osaka, Japonia), utilizând un prag de culoare constantă în 4 câmpuri pe diapozitiv. Producția de IL-6 de către macrofage a fost estimată prin raportul dintre suprafața pozitivă IL-6 și aria Mac-1 pozitivă.

2.6. Determinarea efectului inhibitor al Hochuekkito asupra producerii de citokine proinflamatorii prin macrofage

Celulele THP-1 (5 x 105 celule / godeu în plăci cu 6 godeuri) au fost cultivate timp de 24, 48 sau 72 de ore în absența sau prezența hochuekkito la o concentrație de 0, 10, 50, 100 sau 500 ug / ml. Supernatantele culturii au fost colectate prin centrifugare și concentrația de citokine secretate în supernatant a fost cuantificată prin utilizarea Multiplex Suspension Array (Genetic Lab Corp. Ltd., Sapporo, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele RAW264.7 au fost stimulate cu lipopolizaharidă (LPS) din serotipul Escherichia coli 055: B5 (Sigma) (1 ug / ml) [ 17 ], deoarece nivelul citokinelor secretate din RAW264 .7 celulele au fost sub limita inferioară de detectare fără un stimul timp de 24, 48 sau 72 de ore în absența sau prezența hochuekkito la o concentrație de 0, 10, 50, 100 și 500 ug / mL [ 20 ]. Supernatantele de cultură s-au colectat și concentrația de IL-6 și TNF- a secretate în supernatant a fost cuantificată utilizând ELISA conform instrucțiunilor producătorului.

2.7. Testul de proliferare celulară in vitro

Celulele de carcinom C26, celulele RAW264.7 sau celulele THP-1 au fost placate pe plăci cu 96 de godeuri la 1 x 103 celule / godeu în patru ori. Celulele au fost crescute în absența sau prezența hochuekkito la concentrații de 0, 10, 50, 100 și 500 ug / ml. La punctele de timp desemnate, numărul de celule a fost cuantificat folosind Cell Counting Kit-8 (Wako, Japonia) așa cum s-a descris anterior [ 21 ].

2.8. Statistici

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD Variabilele pentru diferite grupuri au fost comparate folosind t-test nereparat sau Tukey’s Honest Differences Significant (HSD) după analiza varianței (ANOVA); P <0,05 a fost considerat statistic semnificativ.

3. Rezultate

3.1. Hochuekkito îmbunătățită cașexia la șobolanii cu adenocarcinom-coloană de 26 de coloane

Ziua în care celulele C26 au fost inoculate în șoareci a fost desemnată ca ziua 0. Toți șoarecii inoculați cu clona 20 au murit între 16 și 20 de zile după inocularea tumorii. Prin urmare, am evaluat cașexia cancerului în modelul experimental la 15 zile după inocularea tumorii. La sfârșitul experimentelor din ziua 14, greutatea carcasei, a mușchiului gastrocnemius și a țesutului adipos în jurul testiculelor a fost semnificativ mai scăzută la șoarecii netratați cu tumori (tumoră (+) hochuekkito (-), grupa 3) decât la șoarecii de control sănătoși (tumora (-) hochuekkito (-); grupa 1) ( tabelul 1 ). În plus, concentrațiile de Hb, valoarea Hct, numărul Plt și nivelele de trigliceride și glucoză au fost semnificativ mai scăzute la șoarecii netratați cu tumori (grupa 3) decât la șoarecii normali (grupa 1) ( Tabelul 1 ).

tabelul 1

Schimbări în parametrii cașectici la șobolanii cu șoareci cu adenocarcinoame de colon.

Parametru Tumor (-), Hochuekkito (-)
n = 5)
Tumor (-), Hochuekkito (+)
n = 5)
Tumora (+), Hochuekkito (-)
n = 4)
Tumora (+), Hochuekkito (+)
n = 4)
Greutatea carcasei (g) 27,1 ± 0,7 26,2 ± 0,29 20,2 ± 2,3 * 24,2 ± 2,9 ††
Gastrocnemius muscular (mg) 141,1 ± 10,3 128 ± 8,7 115,7 ± 6,9 ** 148,8 ± 8,9 
Țesutul de țesut în jurul testiculelor (mg) 209,5 ± 14,4 226,5 ± 7,3 32,2 ± 55,7 * 155,4 ± 77,9 ††
Hb (g / dl) 16,3 ± 1,2 15,4 ± 1 13,5 ± 0,9 ** 15,3 ± 1,6
Hct (%) 51,6 ± 3,2 48,2 ± 2,7 41,7 ± 2,1 * 47,2 ± 5,1
Plt (× 10 4 / μL ) 103,5 ± 9,7 115,6 ± 20,1 38,3 ± 8,7 * 37,7 ± 13,6
Triglicerida (mg / dl) 117,2 ± 21,1 115 ± 14 16,8 ± 5,7 * 63,8 ± 9,5 ††
Glucoza (mg / dl) 176,9 ± 20,4 181,5 ± 22,3 61,7 ± 13,3 * 126,6 ± 56,5

Celulele 26 din clona 26 au fost implantate subcutanat la șoareci BALB / c, iar hochuekkito a fost administrat pe cale orală șoarecilor timp de 15 zile consecutive. Șoarecii au fost sacrificați la 15 zile după inocularea tumorii și s-au colectat probe de sânge, iar mușchiul gastrocnemius și țesutul gras din jurul testiculelor au fost cântărite în momentul uciderii. Hb: hemoglobină; Hct: hematocrit; Plt: plachete. Greutatea carcasei a fost calculată ca diferența între greutatea totală a corpului și greutatea tumorii. Datele reprezintă media ± SD. Semnificația statistică a fost evaluată cu HSD de la Tukey după ANOVA cu o singură cale.

* Semnificativ diferit de grupul de tumori (-), hochuekkito (-); P <0,01.

** În mod semnificativ diferit de grupul de tumori (-), hochuekkito (-); P <0,05.

† În mod semnificativ diferit de grupul de tumori (+), hochuekkito (-); P <0,01.

†† Semnificativ diferit de grupul de tumori (+), hochuekkito (-); P <0,05.

Hochuekkito a fost administrat pe cale orală din ziua după inocularea tumorii și a fost continuată timp de 15 zile consecutive (+) hochuekkito (+); grupa 4). Așa cum este arătat în figura 2 (a) , tratamentul cu hochuekkito nu a afectat rata de creștere a adenocarcinomului C26 la șoareci în ziua 14 (tumora (+) hochuekkito (-), grupa 3 față de tumoră (+) hochuekkito (+); ). Cu toate acestea, scăderea greutății carcasei la șoarecii purtători de tumori tratați cu hochuekkito (grupa 4) a fost semnificativ mai mică decât la șoarecii netratați cu tumori (grupa 3) ( tabelul 1 și figura 2 (b) ). Reducerea progresivă a consumului de alimente și apă a fost observată la șoarecii purtători de tumori începând din ziua 7 și diferențele semnificative au fost observate la aceste valori între șoarecii tratați cu hochuekkito și cei netratați cu tumori în ziua 14 (figurile 2 (c) și 2 ) ). Nu s-au observat diferențe semnificative în ceea ce privește greutatea carcasei și aportul de alimente și apă între controalele sănătoase netratate și cele tratate sănătoase (figurile 2 (b) , 2 (c) și 2 (d) ).Aceste rezultate indică faptul că administrarea hochuekkito a redus semnificativ reducerea greutății carcasei și a aportului alimentar și a apei fără a afecta creșterea tumorală într-un model murin de cașexie indus de adenocarcinomul C26.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ECAM2012-976926.002.jpg

Efectul hochuekkito asupra creșterii tumorii (a), a greutății carcasei (b), a consumului de alimente (c) și a aportului de apă (d) la șoarecii cu adenocarcinom de colon 26 / clona 20. Celulele tumorale (1 x 10 6 ) au fost implantate sc la șoareci în ziua 0 și hochuekkito administrat pe șoareci timp de 15 zile consecutiv (tumora (-), hochuekkito (+), n = 5, tumora (+), hochuekkito (+), n = 4) și nici un medicament nu a fost administrat unui alt grup (tumora (+), hochuekkito (-), n = 4). Tumorile de grup (-), hochuekkito (-) au fost șoareci de control sănătoși (◆; n = 5). S-au măsurat dimensiunile tumorii, greutatea corporală, consumul de alimente și admisia de apă în zilele 0, 3, 7, 10 și 14. Cantitatea măsurată de alimente sau apă a fost împărțită la numărul de șoareci și zile pentru a determina fiecare consum pe animal și zi. Experimentele pe animale au fost efectuate de două ori și este reprezentat un rezultat reprezentativ. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. Semnificația statistică a fost evaluată prin diferențele semnificative cinstite ale lui Tukey (HSD) după ANOVA cu o singură cale. Nu există o diferență semnificativă în creșterea tumorii între hochuekkito (-) sau hochuekkito (+) în ziua 14. * În mod semnificativ diferit de grupul de tumoare (-), hochuekkito (-) în aceeași zi; P <0,01. † În mod semnificativ diferit de grupul de tumori (+), hochuekkito (-) în aceeași zi; P <0,01. †† În mod semnificativ diferit de grupul de tumori (+), hochuekkito (-) în aceeași zi; P <0,05.

Nu s-au observat diferențe semnificative în concentrația de Hb, valoarea Hct și numărul de Plt între șoarecii tratați cu hochuekkito și cei netratați pe tumoare în ziua 14. Totuși, nivelul trigliceridelor serice a fost semnificativ mai mare la șoarecii tratați cu hochuekkito decât la șoarecii netratați 1 ). În plus, am evaluat greutatea țesuturilor musculare și grase în modelul murin al cașexiei. Greutățile din mușchiul gastrocnemius și din țesutul adipos din jurul testiculelor la șoarecii purtători de tumori tratați cu hochuekkito au fost semnificativ mai mari decât cei ai șoarecilor netratați cu tumoriTabelul 1 ). Nu s-au observat diferențe semnificative în nivelul trigliceridelor serice și în greutatea mușchiului gastrocnemius și a țesutului adipos în jurul testiculelor între controalele sănătoase netratate și cele tratate ( tabelul 1 ).

3.2. Nivelul IL-6 seric inhibat de Hochuekkito la șobolanii cu adenocarcinom-coloană 26

Nivelurile de IL-6 și TNF- a din ser au fost măsurate prin ELISA. Am confirmat faptul că nivelul serului de IL-6 a fost sub limita inferioară de detectare la șoarecii de control sănătoși și nivelul IL-6 a fost semnificativ crescut în cazul șoarecilor netratați cu tumori ( Figura 3 ). Mai mult, nivelul serului IL-6 a fost semnificativ scăzut prin tratamentul cu hochuekkito la șoarecii purtători de tumori comparativ cu șoarecii netratațifigura 3 ).

 Nivelul seric al TNF- a a fost sub limita inferioară de detectare în toate grupurile (datele nu sunt prezentate). Luate împreună, aceste constatări sugerează că administrarea de hochuekkito a redus semnificativ nivelul seric al IL-6 la șoarecii purtători de tumori și a atenuat modificările metabolice ale mușchilor și țesuturilor adipoase asociate cu cașexia cancerului.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ECAM2012-976926.003.jpg

Efectul hochuekkito asupra nivelului seric IL-6 la șoarecii cu adenocarcinom de colon 26 / clona 20. Celulele tumorale (1 x 106) au fost implantate sc la șoareci în ziua 0 și hochuekkito a fost administrat pe cale orală la șoareci timp de 15 zile consecutiv. Serul a fost colectat în momentul uciderii și măsurat prin testul imunosorbant legat de enzime (ELISA) utilizând un kit ELISA de șoarece IL-6. Numărul de probe serice este de 7 pentru fiecare grup. Semnificația statistică a fost evaluată cu HSD de la Tukey după ANOVA cu o singură cale. * Semnificativ diferit de grupul de tumori (+), hochuekkito (-); P <0,05.

3.3. Efectul Hochuekkito asupra infiltrației macrofage și producției de IL-6 de către macrofage în coloane 26 de șoareci cu adenocarcinom-poartă

Pentru a investiga în continuare efectul hochuekkito in vivo, am examinat expresia IL-6 în țesuturile tumorale colectate de la șoareci purtători de C26 tratați cu sau fără hochuekkito. La început, am efectuat imunohistochimia pentru a detecta IL-6 și am evaluat efectul inhibitor al hochuekkito asupra producției de IL-6 la șoarecii purtători de tumori. IL-6 a fost puternic exprimat de către celulele canceroase în țesuturile tumorale de la șoareci purtători de C26 ( Figura 4 (a) ). Cu toate acestea, nivelul de expresie al IL-6 în celulele canceroase nu a fost modificat prin tratamentul cu hochuekkito prin analiză imunohistochimică ( Figura 4 (a) ). Prin urmare, am examinat, de asemenea, țesuturile care înconjoară tumorile ca micromediul.Pentru analiza imunohistochimică pentru markerul IL-6 și macrofagele specifice Mac-1 s-au utilizat secțiuni seriale din aceeași probă de țesut. Interesant, IL-6 a fost de asemenea puternic exprimat în macrofage în țesuturile din jurul tumorilor fără hochuekkito ( Figura 4 (b) ). Analiza imunohistochimică cantitativă a demonstrat că infiltrarea macrofagelor în țesuturile din jurul tumorilor a fost semnificativ redusă prin administrarea cu hochuekkito (Figurile 4 (b) și 4 (c) ), și nu s-a găsit macrofage infiltrative în tumorile C26 (date nereprezentate). Producția IL-6 de către macrofage a fost estimată prin raportul zonei pozitive IL-6 la zona Mac-1 pozitivă din țesuturile care înconjoară tumorile și a fost inhibată semnificativ prin tratamentul cu hochuekkito ( Figura 4 (d) ). Luate impreuna, aceste descoperiri sugereaza ca hochuekkito ameliorat casexia cancerului experimental la soareci prin inhibarea productiei de citokine derivate din macrofage, in special IL-6.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ECAM2012-976926.004.jpg

Efectul hochuekkito asupra infiltrației macrofagelor și producției de IL-6 de către macrofage sau celulele canceroase de la șoareci purtători de C26. (a) Imunofarbirea IL-6 în tumori de la șoareci purtători de C26 care au fost tratați cu sau fără hochuekkito, la 15 zile după inocularea celulelor canceroase. Scări: 100 μm. (b) Imunostainizarea Mac1 / CD11b și IL-6 în țesuturile care înconjoară tumori de la șoareci purtători de C26 cu sau fără tratament cu hochuekkito, la 15 zile după inocularea celulelor canceroase. Secțiunile secționale din aceeași probă de țesut au fost utilizate pentru analiză. Scări: 100 μm. (c) Analiza imunohistochimică cantitativă a infiltrării macrofagelor. Graficul grafic arată schimbarea în foldere în infiltrarea macrofagelor în țesuturile care înconjoară tumori la șoareci purtători de C26, tratați cu sau fără hochuekkito, calculată prin stabilirea raporturilor dintre numărul de macrofage la șoareci netratați ca 1. * Diferență statistic semnificativă comparativ cu grupul de hochuekkito (-); P <0,01 (d) Analiza cantitativă imunohistochimică pentru producerea de IL-6 de către macrofage în țesuturile care înconjoară tumori la șoareci purtători de C26 tratați cu sau fără hochuekkito. Suprafața pozitivă pentru imunoreactivitatea Mac-1 sau IL-6 a fost cuantificată în 4 câmpuri pe diapozitiv. Producția IL-6 de către macrofage a fost estimată prin determinarea raportului dintre suprafața IL-6 pozitivă și aria Mac-1-pozitivă. Datele cantitative sunt prezentate ca mijloace ± SD. Semnificația statistică a fost evaluată cu t -testul Studentului necalificat. * Diferență statistic semnificativă în comparație cu grupul de hochuekkito (-); P <0,01.

3.4. Hochuekkito inhibă producția IL-6 in vitro prin macrofage

Pentru a examina efectele biologice ale hochuekkito asupra secreției citokinelor proinflamatorii de către celulele canceroase sau macrofagele, am cultivat celule adenocarcinom C26 și două linii celulare macrofage, THP-1 și RAW264.7 și le-am tratat cu hochuekkito. Tratamentul cu hochuekkito la concentrații de 0, 10, 50, 100 și 500 ug / mL nu a afectat proliferarea celulelor carcinom C26, celulelor THP-1 sau celulelor RAW264.7 (datele nu sunt prezentate). Concentrarea citokinelor, incluzând IL-6, TNF- a , IL-1 și IL-8, în mediul de cultură al celulelor THP-1 a fost analizată utilizând Multiplex Suspension Array. Dintre aceste citokine, administrarea hochuekkito a suprimat producția de IL-6 de către celulele THP-1 într-o manieră dependentă de doză la 48 și 72 de ore după administrare ( Figura 5 (a) ). Pe baza acestor constatări, am examinat, de asemenea, efectul inhibitor al hochuekkito asupra producerii de IL-6 din celulele RAW264.7. Hochuekkito a suprimat în mod semnificativ secreția de IL-6 din celulele RAW264.7 ( Figura 5 (b) ), dar nu a inhibat producția de IL-6 din celulele adenocarcinom C26 (datele nu sunt prezentate). Aceste constatări sugerează că tratamentul cu hochuekkito a inhibat producția de IL-6 prin macrofage fără a afecta proliferarea celulelor.

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ECAM2012-976926.005.jpg

Efectul hochuekkito asupra producției de IL-6 din celule macrofage THP-1 sau RAW264.7 in vitro. Celulele RAW264.7 (b) stimulate cu LPS-au fost cultivate în absența hochuekkito (0 ug / ml) sau cu prezența hochuekkito la concentrații diferite (10, 50, 100 și 500 ug / ml). Supernatantul de cultură a fost colectat la 24, 48 și 72 ore și concentrația de IL-6 secretizată în supernatant a fost cuantificată prin utilizarea unei serii multiple de suspensie pentru THP-1 (a) sau ELISA pentru RAW264.7 (b) respectiv . S-a realizat matricea de suspensie multiplexă în monoterapie și s-a efectuat ELISA în două exemplare. Datele cantitative sunt prezentate ca mijloace ± SD. Semnificația statistică a fost evaluată cu t -testul Studentului necalificat. * Diferență semnificativă statistic față de martor (0 μg / ml) la fiecare punct temporal; P <0,01.  diferență statistic semnificativă comparativ cu martor (0 pg / ml) la fiecare punct de timp; P <0,05.

4. Discutie

În studiul nostru, am folosit șoareci purtători de tumori C26, un model animal bine caracterizat de cașexie și am dezvăluit că o formulă Kampo, hochuekkito, ameliorat evenimentele cacactice cum ar fi reducerea greutății carcasei, consumul de alimente și apă, greutatea musculară gastrocnemius și grăsimea greutatea țesutului în jurul testiculelor și scăderea nivelurilor serice ale trigliceridelor fără nici un efect asupra creșterii tumorale. Mai mult, tratamentul cu hochuekkito a redus nivelul IL-6 seric și a inhibat producția de IL-6 în macrofage în țesuturile din jurul tumorilor la șoareci cu cașexie. În concordanță cu aceste constatări, hochuekkito a inhibat semnificativ eliberarea IL-6 din celulele macrofage in vitro. Aceste rezultate sugerează că tratamentul cu hochuekkito este eficient și benefic pentru tratamentul cazexiei cauzate de cancer prin suprimarea producției de citokine proinflamatorii, în special IL-6 prin macrofage.Din cele mai bune cunoștințe, studiul nostru este primul raport care dezvăluie efectul anticachetic al hochuekkito într-un model murin bine stabilit de cașexie indusă de adenocarcinomul C26.

Recent, efectele biologice ale medicinii Kampo au beneficiat de o atenție deosebită și un număr de studii susțin eficacitatea și siguranța mai multor medicamente Kampo în multe domenii [ 22 ]. De exemplu, hochuekkito are diverse efecte biologice cum ar fi creșterea imunității [ 11 , 12 ]. Interesant este faptul că hochuekkito reduce in vitro secreția indusă de rinovirus de IL-6, TNF- a , IL-1 și IL-8 din celulele epiteliale traheale umane [ 23 ]. În plus, tratamentul cu hochuekkito scade nivelul seric al proteinelor IL-6, TNF- α și C-reactive și reduce pierderea în greutate corporală și îmbunătățește starea nutrițională a pacienților cu BPOC [ 13 ]. Aceste indicații de bază și clinice susțin puternic concluziile noastre actuale că hochuekkito are capacitatea biologică de a inhiba producția de citokine proinflamatorii cum ar fi IL-6 de către celulele gazdă și este eficientă și benefică pentru tratamentul cazexiei de cancer.

În micromediul tumoral, macrofagele gazdă pot fi activate și produc citokine proinflamatorii [ 24 ].Eliberarea acestor citokine de către macrofage joacă un rol important în progresia cancerului de cașexie [ 25 ]. Sophocarpina și matrina inhibă producția de IL-6 și TNF- a de către linia celulară macrofagă murină, RAW264.7, și atenuează în mod semnificativ cașexia experimentală indusă de adenocarcinomul C26 la șoareci [ 17 ]. Astfel, citokinele derivate din macrofage, cum ar fi IL-6 și TNF- a , ar putea fi ținte terapeutice promițătoare pentru cașexia cancerului. Deși în studiul nostru, hochuekkito a inhibat producția de TNF- a de către celulele RAW264.7 (datele nu au fost prezentate), nivelul TNF- a serului a fost sub limita inferioară de detectare în modelul nostru murin. Astfel, implicarea TNF- a în cazexia cancerului în modelul nostru murin nu a fost clară. În contrast, nivelul IL-6 al serului a fost în mod semnificativ reglat în mod semnificativ în modelul murinic de cașexie comparativ cu cel din martori și a fost semnificativ scăzut prin tratamentul cu hochuekkito ( Figura 3 ). Analiza imunohistochimică a arătat că IL-6 a fost puternic exprimat în macrofage în țesuturile care înconjoară tumori la șoareci cachectici, iar producția de IL-6 a macrofagului a fost semnificativ inhibată prin tratamentul cu hochuekkito, cu toate că nivelul IL-6 în celulele canceroase nu a fost modificat 4 ). Aceste constatări au fost în concordanță cu rezultatul nostru, conform căruia hochuekkito a inhibat eliberarea IL-6 nu din celulele carcinomului C26 ci din celulele macrofage RAW264.7 murine in vitro. Prin urmare, cercetările viitoare ar trebui direcționate spre înțelegerea mecanismului prin care hochuekkito suprimă producția de IL-6 prin macrofage.

Recent, un mare interes se concentrează asupra rolului lipazei în cașexia [ 26 , 27 ]. Lipaza activată în țesutul adipos descompune grăsimea stocată care constă predominant din trigliceride, rezultând un nivel crescut al trigliceridelor serice și depunerea scăzută a grăsimilor în țesut în etapa inițială de cașexie. În studiul nostru, tratamentul cu hochuekkito a redus semnificativ nivelul IL-6 seric și a crescut atât nivelul trigliceridelor serice, cât și greutatea țesutului adipos la șoareci purtători de C26, deși hochuekkito nu a afectat nici nivelul trigliceridelor serice, nici greutatea țesutului gras din sânge controale ( tabelul 1 ). Nu a fost publicată nici o lucrare despre efectul hochuekkito asupra activității lipazei și nu am examinat activitatea lipazei în modelul nostru murin cachectic tratat cu hochuekkito. Prin urmare, relația dintre nivelul crescut al trigliceridelor și activitatea de lipază la șoarecii purtători de C26 tratați cu hochuekkito a fost incertă. Cu toate acestea, concluziile noastre sugerează că hochuekkito nu a afectat activitatea lipazei trigliceridelor adipoase, deoarece hochuekkito a crescut atât nivelul trigliceridelor serice, cât și depunerea grăsimilor la șoarecii cachectici, dar nu la controalele sănătoase. Mai multe studii au arătat că atât nivelul trigliceridelor serice cât și greutatea țesutului adipos au fost reduse în stadiul terminal al cașexiei cancerului la șoareci [ 28 , 29 ]. În acest studiu, am evaluat efectul hochuekkito asupra stării cachectice a șoarecilor purtători de tumori în stadiul terminal, nu în stadiul inițial. De asemenea, s-a raportat că administrarea unui inhibitor de NF- κ B, dehidroximetil-epoxichinomicină (DHMEQ), a redus semnificativ nivelul IL-6 al serului la șoarecii cachectici care purtau tumori, rezultând ameliorarea atât a greutății de grăsime epididimală cât și a nivelului trigliceridelor serice [ 30 ]. Aceste concluzii anterioare sunt în concordanță cu rezultatul nostru că tratamentul cu hochuekkito a redus semnificativ nivelul IL-6 seric și a crescut atât nivelul trigliceridelor serice cât și greutatea țesutului adipos la șoarecii purtători de C26 în stadiul terminal.

În concluzie, studiul nostru a arătat că formula Kampo, hochuekkito, a ameliorat cachexia cancerului experimental la șoareci și a inhibat producția de citokine derivate din macrofage, în special IL-6. Studiile noastre in vivo și in vitro oferă informații valoroase despre rolul formulării Kampo în tratamentul cazexiei de cancer și indică faptul că hochuekkito poate avea o mare valoare în viitor pentru pacienții cu carachexie de cancer, deși sunt necesare studii suplimentare.

Finanțarea

Acest studiu a fost susținut de Grants-in-Aid pentru Cercetare Științifică nr. 21591003 (Kazuhisa Takahashi) și nr. 23591906 (Fumiyuki Takahashi) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei din Japonia.

Logo-ul ecam

Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM
Comportament bazat pe evidente Alternat Med . 2012; 2012: 976926.
Publicat online 2012 Dec 24 doi: 10.1155 / 2012/976926
PMCID: PMC3543823
PMID: 23326296

Suzu Yae , 1, 2 Fumiyuki Takahashi , 1, 2, * Toshifumi Yae , 1, 2 Takuji Yamaguchi , 3 Rika Tsukada , 3 Kengo Koike , 1, 2Kunihiko Minakata , 1, 2 Akiko Murakami , 1, 2 Fariz Nurwidya , 1 , 2 Motoyasu Kato , 1, 2 Mayumi Tamada , 4Momoko Yoshikawa , 4 Hiroyuki Kobayashi , 3 Kuniaki Seyama , 1, 2 și Kazuhisa Takahashi 1, 2

Contribuția autorilor

S. Yae și F. Takahashi au contribuit în mod egal la acest studiu.

Conflict de interese

Autorii declară că nu au un conflict de interese.

Recunoasteri

Autorii ar dori să mulțumească laboratorului de la Chugai Pharmaceutical Co. pentru furnizarea unui subclon al celulei adenocarcinomului de colon 26 (clona 20). De asemenea, le mulțumește companiei Tsumura & Co. pentru furnizarea hochuekkito (Lot nr 2100041010) și I. Ishimatsu (Universitatea Keio), Y. Sasaki (Link Genomics Co.), Y. Hata (Link Genomics Co.) și T Oka (World Fusion Co.) pentru asistență tehnică.

Referințe

1. Gordon JN, Verde SR, Goggin PM. Cachexia de cancer. Jurnalul trimestrial al medicinei . 2005; 98(11): 779-788. PubMed ]
2. Tisdale MJ. Cachexia la pacienții cu cancer. Natura Recenzii Cancer . 2002; 2 (11): 862-871. PubMed ]
3. Muscaritoli M, Bossola M, Aversa Z, Bellantone R, Rossi Fanelli F. Prevenirea și tratamentul cazhexiei de cancer: noi perspective asupra unei probleme vechi. European Journal of Cancer . 2006; 42 (1): 31-41. PubMed ]
4. Tisdale MJ. Mecanismele cașexiei de cancer. Recenzii fiziologice . 2009; 89 (2): 381-410. PubMed ]
5. Tisdale MJ. Patogeneza cașexiei de cancer. Jurnalul de Oncologie de Suport . 2003; 1 (3): 159-168.PubMed ]
6. Tisdale MJ. Biologia cașexiei. Jurnalul Institutului Național al Cancerului . 1997; 89 (23): 1763-1773.PubMed ]
7. Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 și receptorul său în cancer: implicații pentru terapeutica translatoare. Rac . 2007; 110 (9): 1911-1928. PubMed ]
8. Strassmann G, Fong M, Kenney JS, Jacob CO. Dovada implicării interleukinei 6 în cașexia cancerului experimental. Jurnalul de Investigații Clinice . 1992; 89 (5): 1681-1684. Articol gratuit PMC ]PubMed ]
9. Strassmann G, Kambayashi T. Inhibarea cașexiei cancerului experimental prin terapie anti-citokină și anti-citokină. Citokine și terapie moleculară . 1995; 1 (2): 107-113. PubMed ]
10. Ando K, Takahashi F, Motojima S, și colab. Rolul posibil al tocilizumabului, anticorp anti-interleukin-6 receptor, în tratarea cazexiei cauzate de cancer. Journal of Clinical Oncology . In presa. PubMed ]
11. Kuroiwa A, Liou S, Yan H, Eshita A, Naitoh S, Nagayama A. Efectul unui medicament tradițional japonez pe bază de plante, Hochu-ekki-to (Bu-Zhong-Yi-Qi Tang), privind imunitatea persoanelor vârstnice. Imunofarmacologie internațională . 2004; 4 (2): 317-324. PubMed ]
12. Satoh N, Sakai S, Kogure T, și colab. Un studiu clinic randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, al medicamentului Hochuekkito, un medicament tradițional pe bază de plante, în tratamentul pacienților vârstnici cu slăbiciune N de unu și cu un design restrâns de responder. Phytomedicină . 2005; 12 (8): 549-554. PubMed ]
13. Tatsumi K, Shinozuka N, Nakayama K, Sekiya N, Kuriyama T, Fukuchi Y. Hochuekkito îmbunătățește inflamația sistemică și starea nutrițională la pacienții vârstnici cu boală pulmonară obstructivă cronică. Jurnalul Societatii Americane de Geriatrie . 2009; 57 (1): 169-170. PubMed ]
14. Fujimoto-Ouchi K, Tamura S, Mori K, Tanaka Y, Ishitsuka H. Stabilirea și caracterizarea clonelor inducerea și inducerea cașexiei a carcinomului de colon murin 26. Jurnalul Internațional al Cancerului .1995; 61 (4): 522-528. PubMed ]
15. Tajima S, Bando M, Yamasawa H, și colab. Efectul preventiv al lui Hochu-ekki-on asupra leziunii pulmonare acute induse de lipopolizaharidă la șoareci BALB / c. Lung . 2006; 184 (6): 318-323.PubMed ]
16. Tajima S, Bando M, Yamasawa H, și colab. Efectul preventiv al hochu-ekki-to, un medicament japonez pe bază de plante, asupra leziunilor pulmonare induse de bleomicină la șoareci. Respirologie . 2007; 12 (6): 814-822. PubMed ]
17. Zhang Y, Wang S, Li Y, Xiao Z, Hu Z, Zhang J. Sophocarpine și matrine inhiba producerea de TNF – αși IL-6 în macrofage murine și prevenirea simptomelor legate de cașexie induse de adenocarcinom colon26 la șoareci. Imunofarmacologie internațională . 2008; 8 (13-14): 1767-1772. PubMed ]
18. Fujita J, Tsujinaka T, Yano M, și colab. Anticorpul receptorilor anti-interleukină-6 previne atrofia musculară la șoarecii cu adenocarcinoame de colon-26 cu modularea căilor proteolitice lizozomale și ATP-ubiquitin-dependent. Jurnalul Internațional al Cancerului . 1996; 68 : 637-643. PubMed ]
19. Tanaka Y, Eda H, Tanaka T, și colab. Cachexia de cancer experimentată indusă de adenocarcinomul transplantabil colon 26 la șoareci. Cancer Research . 1990; 50 (8): 2290-2295. PubMed ]
20. Matsumoto T, Moriya M, Kiyohara H, Tabuchi Y, Yamada H. Hochuekkito, un medicament Kampo (medicina tradițională japoneză pe bază de plante) și porțiunea sa de polizaharidă stimulează secreția de G-CSF din celulele epiteliale intestinale. Dovezi bazate pe medicina complementară și alternativă . 2010; 7(3): 331-340. Articol gratuit PMC ] PubMed ]
21. Minakata K, Takahashi F, Nara T, și colab. Hipoxia induce rezistența la gefitinib în cancerul pulmonar cu celule mici, atât cu receptori de factori de creștere epidermali mutanți, cât și cu tip sălbatic. Cancer Science . 2012; 103 (11): 1946-1954. PubMed ]
22. Uezono Y, Miyano K, Suzuki M, și colab. O revizuire a medicamentelor tradiționale japoneze și a mecanismului de acțiune potențial al acestora. Proiectare farmaceutică curentă . 2012; 18 (31): 4839-4853.PubMed ]
23. Yamaya M, Sasaki T, Yasuda H, și colab. Hochu-ekki – pentru a inhiba infecția cu rinovirus în celulele epiteliale traheale umane. British Journal of Pharmacology . 2007; 150 (6): 702-710.Articol gratuit PMC ] PubMed ]
24. Seruga B, Zhang H, Bernstein LJ, Tannock IF. Citokine și relația lor cu simptomele și rezultatul cancerului. Natura Recenzii Cancer . 2008; 8 (11): 887-899. PubMed ]
25. Billingsley KG, Fraker DL, Strassmann G, Loeser C, Fliot HM, Alexander HR. Factorul de necroză tumorală derivat de la macrofage și factorul inhibitor al leucemiei și interleukina-6 derivate din tumoare: mecanisme celulare posibile ale cașexiei de cancer. Analele Oncologiei Chirurgice . 1996; 3 (1): 29-35.PubMed ]
26. Arner P. Lipaze în cașexie. Știință . 2011; 333 (6039): 163-164. PubMed ]
27. Das SK, Eder S, Schauer S, și colab. Lipazele trigliceridice adipoase contribuie la cazexia asociată cancerului. Știință . 2011; 333 (6039): 233-238. PubMed ]
28. Soda K, Kawakami M, Kashii A, Miyata M. Caracterizarea șoarecilor care poartă subclonele adenocarcinomului de colon 26 descalifică interleukina-6 ca unic inductor al cașexiei. Jurnalul japonez de cercetare în domeniul cancerului . 1994; 85 (11): 1124-1130. Articol gratuit PMC ] PubMed ]
29. Naoe Y, Kawamura I, Inami M, și colab. Efectul anti-cachectic al FK317, un nou agent anti-cancer, în modelele Colon26 și LX-1 la șoareci. Jurnalul japonez de cercetare în domeniul cancerului . 1998; 89(12): 1318-1325. Articol gratuit PMC ] PubMed ]
30. Kuroda K, Horiguchi Y, Nakashima J, și colab. Prevenirea cașexiei cancerului de către un nou factor nuclear kb inhibitor în cancerul de prostată. Clinical Cancer Research . 2005; 11 (15): 5590-5594.PubMed ]

Articolele de la medicina complementară și alternativă bazată pe dovezi: eCAM sunt oferite aici prin amabilitatea companiei Hindawi Limited

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.