Abstract
Casexia la pacienții cu cancer, caracterizată printr-o pierdere gravă involuntară în greutate și o afectare a funcției fizice, este asociată cu un prognostic nesatisfăcător ca răspuns la tratamentul canceros alopat/ convențional și cu o creștere a mortalității legate de cancer. Prevenirea pierderii mușchilor scheletici în casexia indusă de cancer prin inhibarea factorilor pro-casectici, precum și o reducere a masei tumorale a fost considerată o intervenție farmacologică și nutrițională rezonabilă pentru tratarea pacienților cu cancer. În acest studiu, am construit o formulă de plante noua, SGE, care conține Ginseng Radix alba, Atractylodis Rhizoma alba și Hoelen , și-a examinat eficacitatea anti-cancer și anti-casexia.
plantele medicinale traditionale chinezesti TCM / CHM si koreene si formulele derivate cu si din acestea le cautati dupa nume pe
http://www.activeherb.com/chineseherbs
În experimente in vitro , SGE a indus moartea celulelor carcinomului de colon murin CT-26 prin stresul reticulului endoplasmatic și a suprimat producția de citokine inflamatorii în celulele macrofage murine 264.7. În plus, tratamentul cu SGE a atenuat atrofia celulelor musculare scheletale C2C12 indusă de CT-26, precum și reducerea acumulării lipidelor în adipocit 3T3-L1 indusă de CT-26.
La șoarecii cu tumori CT-26, administrarea pe cale orală zilnică de 10 și 50 mg / kg SGE a atenuat remarcabil simptomele legate de cașexie, inclusiv greutatea corporală și pierderea mușchiului, comparativ cu tratamentul cu soluție salină, în timp ce aportul alimentar nu a fost afectat. Aceste date colectiv sugerează că SGE este benefic ca adjuvant anti-cancer pentru a trata pacienții cu cancer cu scădere gravă în greutate.
INTRODUCERE
Cancerul colorectal (CRC) este al treilea cel mai frecvent diagnosticat cancer și a doua cauză principală a deceselor legate de cancer la adulți din SUA [ 1 , 2 ]. In 2017, Societatea Americana de Cancer a estimat 95.520 de cazuri noi de cancer de colon si 39.910 de cazuri noi de cancer rectal diagnosticate in SUA [ 3 ].Pe măsură ce tumorile cresc, pacienții cu CRC prezintă diferite simptome, cum ar fi sângerarea rectală, disconfortul persistent abdominal, modificări ale obiceiurilor intestinale, inclusiv constipație sau diaree, slăbiciune sau oboseală și scăderea apetitului [ 4 ]. În mod special, mai mult de 50% din pacienții cu CRC suferă o pierdere neintenționată în greutate, cu pierdere musculară severă, iar această afecțiune, distinctă de pierderea mușchilor și a mușchilor legați de vârstă, nu poate fi prevenită sau recuperată prin suport nutrițional convențional [ 5 , 6 ]. La pacienții cu cancer, sindromul de risipă, inclusiv anorexia, modificările metabolice și endocrine, oboseala și pierderea masei corporale slabe, este cunoscută sub denumirea de cașexie de cancer, iar această afecțiune diminuează eficacitatea chimioterapiei și radioterapiei convenționale, reduce calitatea vieții și agravează prognosticul pacienților cu cancer. De fapt, cel puțin 20% dintre pacienții cu cancer mor din cauza simptomelor cachectice, cum ar fi pierderea în greutate [ 7 – 9]. Prin urmare, pentru a depăși cancerul de colon, este necesară suprimarea directă a celulelor canceroase și controlul simptomelor casectice induse de cancer, în special pentru conservarea masei corporale slabe.
În ultimii ani, mecanismele patofiziologice care stau la baza pierderii mușchilor scheletici și a țesutului adipos în timpul cașexiei de cancer au fost investigate intens și au fost identificate procese-cheie și ținte terapeutice, inclusiv mediatori pro-inflamatori (de exemplu, IL-6, TNF-a, IL 6, IL-1 și IFN-y) și mediatori de proteoliză (de exemplu, myostatin, factor de inducere a proteolizei, angiotensin II și sistemul proteazom ubiquitin) secretați din celulele tumorale și celulele gazdă ca răspuns la tumori [ , 10 , 11 ]. Au fost efectuate mai multe studii medicamentoase pentru a controla cașexia cancerului, utilizând medicamente sintetice care stimulează pofta de mâncare, suprimă răspunsul inflamator, reduc proteoliza și sporesc sinteza proteinelor [ 12-14 ]; cu toate acestea, utilizarea acestora este limitată datorită efectelor lor neașteptate și a eficacității scăzute in vivo . În plus, anticorpii sau peptidele sintetice care vizează mediatorii casectici au fost eficienți în inversarea condițiilor de cașexie [ 15 , 16 ]; totuși, acești agenți au un cost ridicat și lipsa datelor clinice pentru eficacitatea și siguranța acestora. Recent, medicamentele pe bază de plante s-au dovedit a fi benefice pentru gestionarea simptomelor de cașexie induse de cancer, incluzând anorexia, scăderea în greutate, oboseala și pierderea musculară, la șoarecii purtători de tumori, datorită acțiunilor lor farmacologice multimodale și toxicității scăzute [ 17-19 ] .
În acest studiu, am formulat un cocktail de plante noua, SGE, compus din Ginseng Radix alba, Atractylodis Rhizoma alba și Hoelen .
Ginseng Radix alba , rădăcină de ginseng neprocesată numită ginseng alb, a fost folosită de mii de ani ca tonic pentru a ridica starea de spirit și pentru a reduce oboseala și a fost raportată că are antidiabetic, antihipertensiv, anti-hiperglicemic, antidepresiv și efectele hemopoietice [ 20-22 ].
Atractylodis Rhizoma alba este o plantă medicinală frecvent utilizată cu activități antiinflamatorii, anti-osteoporotice, anti-canceroase și antimelanogene [ 23-25 ].
Hoelen este o ciupercă subterană care crește pe rădăcinile pinilor și a fost folosită de mult timp ca diuretic, sedativ și remediu pentru bolile gastrice în medicina tradițională orientală [ 26 ].
În ciuda numeroaselor proprietăți farmacologice, eficacitatea acestor componente împotriva cașexiei induse de cancer, fie singură, fie în combinație ca un cocktail pe bază de plante, nu a fost demonstrată.
În studiul de față, am analizat dacă SGE suprimă creșterea tumorală și ameliorează simptomele de cașexie la șoareci purtând carcinoame de colon CT-26. Mai mult, am elucidat în detaliu mecanismele anti-cancer și anti-casectice utilizând celule carcinom de colon CT-26 murine, celule asemănătoare macrofagelor 264.7, myoblaste C2C12 și adipocite 3T3-L1.
REZULTATE
SGE inhibă proliferarea și induce moartea celulelor apoptotice în celulele carcinomului de colon murin CT-26
Pentru a examina dacă SGE poate afecta proliferarea și viabilitatea celulelor CT-26, am măsurat celulele viabile prin analiza CCK-8 după tratarea celulelor cu concentrații crescătoare de SGE timp de 24 de ore.După cum se arată în Figura 1A 1A și 1B ,1B , SGE a inhibat proliferarea celulară și a indus o citotoxicitate severă într-o manieră dependentă de doză la concentrații de 100 pg / ml sau mai mare și morfologia celulelor a fost aproape complet prăbușită la o concentrație de 1000 pg / ml (F = 339,4, p <0,0001, ANOVA cu sens unic). În cadrul testului de imagine celulară LIVE / DEAD, tratamentul cu SGE a indus o scădere semnificativă a celulelor vii fluorescente verde și o creștere concomitentă a celulelor moarte fluorescente roșii (Figura 1C ). Western blot a arătat că SGE a stabilit în mod semnificativ nivelurile de proteine anti-apoptotice, incluzând Bcl-2 și XIAP, și a reglat în sus nivelurile proteinelor pro-apoptotice, inclusiv Bax, Bad și PARP scindate, în doză și timp – maniere dependente (Figura 1D și 1E ). Deoarece SGE este un amestec de plante format din trei ierburi Ginseng Radix alba , Atractylodis Rhizoma alba și Hoelen , am examinat în continuare efectele extractelor de etanol din fiecare planta asupra viabilității celulare. După cum se arată în figura 1 , tratamentul cu extracte de etanol din fiecare plantă și co-tratamentul cu cele trei plante până la 500 μg / ml nu au determinat citotoxicitatea, indicând faptul că aceste plante exercită o activitate antiproliferativă mai mare atunci când sunt utilizate împreună într-un cocktail din plante .
SGE scade viabilitatea și induce moartea apoptotică în celulele carcinomului de colon murin CT-26
(A) Celulele CT-26 însămânțate în plăci de cultură cu 96 de godeuri au fost incubate cu SGE (10-1000 pg / ml) timp de 48 de ore și apoi a fost măsurată viabilitatea celulară utilizând kitul CCK-8. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente efectuate în triplicat și sunt exprimate ca mijloace ± SD. ** p <0,01 față de controlul netratat. (B) Modificările morfologice ale celulelor CT-26 tratate cu SGE au fost observate sub un microscop inversat la o mărire de x 200. (C) CT-26 celuloză pe plăci de cultură cu 12 godeuri au fost incubate cu SGE (0,500, 1000 pg / ml) timp de 36 ore. După etichetarea celulelor utilizând setul de imagistică celulară LIVE / DEAD, celulele vii (verde) și moarte (roșu) au fost observate sub un microscop fluorescent. (DE)Nivelurile proteinelor legate de moartea celulară au fost analizate prin Western blot în celulele tratate cu concentrațiile indicate de SGE timp de 24 ore (D) sau în celulele tratate cu SGE de 500 μg / ml timp de 24 și 36 ore (E). Intensitățile banda relativă au fost calculate utilizând software-ul ImageJ după normalizarea la exprimarea tubulinei.
SGE induce fosforilarea MAPK și AMPK, precum și stresul ER, în celulele carcinomului de colon murin CT-26
S-a raportat că stresul ER prelungit poate declanșa moartea celulelor datorită unui răspuns defectuos al proteinei [ 27 ], iar activarea MAPK a fost implicată în moartea celulară indusă de stresul ER [ 28 ]. În plus, AMPK care cuprinde o subunitate catalitică a a și două subunități de reglare (β și γ) este activată sub stres metabolic, determinând în final moartea celulei [ 29 ]. Așa cum se arată în Figura 2A ,2A , Western blot a arătat că tratamentul cu SGE a crescut rapid nivelele de p38 și ERK fosforilate la 30 min după tratament și a scăzut treptat aceste niveluri după 1 h. Între timp, SGE a indus, de asemenea, fosforilarea JNK și AMPK, până la 24 ore. În plus, proteinele legate de stres ER, incluzând Bip, CHOP, Ero1-Lα, IRE1α și PERK, au fost remarcabil crescute prin SGE, dar PDI nu a fost afectat (Figura 2B ). Pentru a investiga rolul activării MAPK și AMPK în moartea celulară mediată de SGE, celulele CT-26 au fost pre-tratate cu inhibitori farmacologici ai p38 (SB203580), ERK (PD98059), JNK (SP600125) și AMPK Tratamentul cu SGE. După cum se arată în Figura 2C și Figura 2 , tratamentul prealabil cu compusul C protejează eficient celulele CT-26 de moartea celulară mediată de SGE la aproximativ 80% la 500 pg / ml SGE, în timp ce PD98059 și SP600125 au indus o protecție slabă și SB203580 efect mic. Aceste date indică faptul că activarea AMPK urmată de stresul ER este crucială pentru moartea celulară mediată de SGE în celulele CT-26.
SGE creste fosforilarea MAPK si AMPK si induce stresul ER
(A) Celulele CT-26 au fost tratate cu 500 ug / ml SGE timp de 0,5, 1, 3 și 6 ore, iar nivelurile p38, ERK, JNK și AMPK totale și fosforilate au fost examinate prin Western blot. (B) Nivelurile de proteine legate de stres ER au fost măsurate prin Western blot în celule CT-26 după tratarea cu SGE de 500 pg / ml timp de 3, 6, 12 și 18 ore. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente, iar intensitățile relative ale benzii au fost calculate utilizând software-ul ImageJ după normalizarea la expresia tubulinei. (C) Celulele pretreate cu sau fără compusul C (5 pM) timp de 1 oră au fost tratate cu 250 și 500 pg / ml SGE. După incubare timp de 24 de ore, viabilitatea celulară a fost evaluată prin analiza CCK, iar morfologia celulară a fost observată sub un microscop inversat. ** p <0,01 față de controlul netratat.
SGE suprimă producția indusă de LPS a citokinelor inflamatorii și NO, exprimarea iNOS și activarea MAPK și NF-κB în macrofagele murine
S-a demonstrat că răspunsul inflamator cronic la pacienții cu cancer poate provoca și accelera simptomele de cașexie induse de cancer, inclusiv anorexia, pierderea în greutate, greața, lipoliza și pierderea musculară [ 8 , 30 ]. Prin urmare, limitarea răspunsului inflamator este considerată o strategie eficientă anti-casectică. Apoi am examinat dacă SGE poate inhiba producerea de citokine pro-inflamatorii și pro-cachectice cum ar fi IL-1, IL-6 și TNF-a în macrofagele stimulate cu LPS. Așa cum se arată în Figura 3A ,3A , SGE la concentrații de până la 100 pg / ml nu a induce citotoxicitate în macrofagele peritoneale murine; astfel, am tratat macrofagele cu 5, 10, 25 și 50 μg / ml SGE în acest studiu. Nivelurile mRNA de IL-1a, IL-6 și TNF-a au crescut semnificativ după stimularea cu LPS, în timp ce ele au scăzut considerabil prin pretratarea SGE într-o manieră dependentă de doză (IL-1; F = 6,574e + 008, p <0.0001, IL-6, F = 1.198e + 008, p <0.0001, TNF-a, F = 4.45e + 008, p <0.0001, ANOVA cu o singură cale). În supernatantele de cultură, nivelele secretate ale IL-1p, IL-6 și TNF-a au fost, de asemenea, remarcabil scăzute la celulele tratate cu SGE comparativ cu celulele martor netratate, similare cu efectele dexametazonei, utilizate ca martor pozitiv (IL- 1, F = 539,3, p <0,0001, IL-6, F = 206,3, p <0,0001, TNF-a, F = 111,6, p <0,0001, ANOVA unidirecțională ). În plus, în celulele 264.7 Raw, SGE a redus eficient producția de NO produsă de LPS și expresia iNOS atât la nivelul mRNA, cât și la nivelul proteinei, în măsurarea nivelurilor comparabile cu cele induse de dexametazonă (producția de NO, F = 2926, p <0,0001, mRNA iNOS, F = 258,0, p <0,0001, proteină iNOS, F = 132,6, p <0,0001, ANOVA cu sens unic) (Figura 4A și 4B ). După cum sa raportat în studiile anterioare, producția de citokine inflamatorii a fost inhibată considerabil prin tratamentul cu extract de etanol cu plante unice, dar eficacitatea SGE a fost superioară celei a unei plante unice. În special, eficacitatea fiecărei plante la 16,7 μg / ml, adică concentrația corespunzătoare SGE 50 μg / ml, a fost nesemnificativă, ceea ce indică faptul că aceste plante au o activitate antiinflamatorie mai mare atunci când sunt utilizate ca un cocktail pe bază de plante ( Figura 3 ). S-a demonstrat că activarea MAPK și NF-κB este critică pentru producerea indusă de LPS a citokinelor proinflamatorii. Am constatat că stimularea LPS a crescut semnificativ nivelele p38, ERK și JNK fosforilate în celulele 264.7 Raw, în timp ce pre-tratamentul SGE a scăzut în mod eficient nivelurile lor într-o manieră dependentă de doză. În plus, fosforilarea indusă de LPS și degradarea IkBa au fost, de asemenea, remarcabil scăzute în celulele tratate cu SGE (p-p38, F = 75,28, p <0,0001, p-ERK, F = 70,46, p <0,0001, p-JNK; = 34,05, p <0,0001, pIkBa / IkBa; F = 144,7, p <0,0001, ANOVA cu sens unic) (Figura ( Figura 4C4C ).
SGE inhibă producția indusă de LPS a citokinelor inflamatorii în macrofagele peritoneale murine
(A) După însămânțarea macrofagelor peritoneale pe plăci de cultură cu 96 de godeuri, SGE (10-500 pg / ml) a fost adăugat în godeuri și incubat timp de 24 de ore. Viabilitatea celulelor a fost determinată utilizând kitul CCK-8. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SD efectuate în triplicat. (B) Celulele pretreate cu sau fără 10, 25 și 50 pg / ml SGE timp de 1 h au fost stimulate cu LPS (200 ng / ml) timp de 6 ore și nivelele mRNA ale IL-1a, IL-6 și TNF -α au fost determinate prin RT-PCR. Intensitățile benzii relative la cele ale celulelor netratate cu SGE au fost normalizate la GAPDH și au fost exprimate ca mijloace ± SD de la două experimente independente. (C) Celulele au fost pre-tratate cu sau fără 5, 10, 25 și 50 pg / ml SGE sau dexametazonă (10 pM) timp de 1 h și stimulate cu LPS (200 ng / ml) timp de 24 de ore. După colectarea supernatanților de cultură, nivelele de IL-1p, IL-6 și TNF-a au fost măsurate prin ELISA și exprimate ca mijloace ± SD efectuate în triplicat. # p <0,01 față de controlul netratat, ** p <0,01 față de controlul netratat cu SGE.
SGE inhibă producția de NO induse de LPS și activarea MAPK / NF-κB în celulele 264.7 Raw
(A) Celulele au fost pretratate cu sau fără concentrațiile indicate de SGE sau dexametazonă (10 uM) timp de 1 oră și apoi au fost stimulate cu LPS (200 ng / ml). După 24 de ore, s-au măsurat nivelele de NO în supernatantele de cultură. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente și sunt exprimate ca mijloace ± SD efectuate în triplicat. (B) nRNA și nivelurile de proteină ale iNOS în celulele tratate așa cum s-a descris în (A) au fost examinate prin RT-PCR și, respectiv, Western blotting. Datele au fost exprimate ca mijloace ± SD a două experimente independente. (C) Celule pre-tratate cu sau fără concentrațiile indicate de SGE timp de 1 oră au fost stimulate cu LPS (200 ng / ml) timp de 1 h și apoi supuse la Western blotting.Intensitățile benzii relative la celulele netratate cu SGE au fost determinate și reprezentate ca mijloace ± SD de la două experimente independente. # p <0,01 față de controlul netratat, * p <0,05 și ** p <0,01 față de controlul netratat cu SGE.
SGE atenuează inhibiția mediată de CT-26 CM a proliferării myoblastului C2C12 și a pierderii de miocub C2C12 mediată de CT-26 CM
În studiile anterioare, tratamentul cu CT-26 CM a suprimat proliferarea și diferențierea mioblastelor în miotuburi și degradarea miotubului accelerat, sugerând că factorii derivați de la tumori, cum ar fi myostatina și IL-6, promovează pierderea mușchilor scheletici [ 31 , 32 ]. Pentru a examina efectele SGE asupra pierderii musculare induse de tumori, am măsurat mai întâi proliferarea myoblastului C2C12 după tratamentul cu CT-26 CM tratat cu SGE sau CT-26 CM neautentic diluat 1: 5 în GM timp de 48 de ore.După cum este arătat în Figura Figura 5A ,5A , CT-26 CM netratată cu SGE a suprimat sever proliferarea myoblastului C2C12 cu aproximativ 65% comparativ cu martor GM, în timp ce tratamentul cu CT-26 CM tratat cu SGE de 10, 25 și 50 pg / nu afectează în mod semnificativ proliferarea myoblastului C2C12 (F = 523,4, p <0,0001, ANOVA cu sens unic). În mod special, celulele incubate în 25 și 50 pg / ml CM tratate cu SGE au fost afectate în mod similar cu cele incubate în martor GM. Apoi, am analizat dacă SGE atenuează atrofia musculară mediată de CT-26 CM prin inhibarea diferențierii mioblastelor C2C12 în miotuburi și miotuburi C2C12 degradante. Similar studiilor anterioare, am observat că CT-26 CM de control netratat cu SGE a afectat semnificativ diferențierea C2C12 în comparație cu DM de control, însoțită de numerele micotuburilor reduse și expresia MyH. Între timp, CT-26 CM tratată cu SGE nu a împiedicat sever diferențierea mioblastului C2C12, prezentând o formare a miotubului mai crescută și o expresie MyH în comparație cu CM controlul CT-26 (Figura 5B ). Când miotuburile C2C12 diferențiate au fost tratate cu CT-26 CM sau TNF-a, ele au fost remarcabil degradate în morfologie, iar nivelurile de MyH în miotuburi au fost reduse. Totuși, tratamentul cu CT-26 CM sau SGE tratat cu SGE înainte de stimularea cu TNF-a a împiedicat aproape complet degradarea miotuburilor și scăderea expresiei MyH (Figura 5C ).În plus, s-a evaluat efectul SGE asupra lipolizei mediate de CT-26 CM în adipocite bine diferențiate. După cum se arată în Figura 5D ,5D , incubarea adipocitelor 3T3-L1 cu CT-26 CM a scăzut acumularea de lipide la aproximativ 28% din nivelele lipidelor din adipocitele 3T3-L1 tratate cu mediu de cultură proaspăt, în timp ce CT-26 CM tratat cu SGE scăderea acumulării lipidelor la aproximativ 65-73%, sugerând că SGE inhibă lipoliza mediată de CT-26 CM (F = 50,17, p <0,0001, ANOVA cu sens unic).
SGE atenuează atrofia musculară indusă de CT-26 CM în celulele C2C12 și lipoliza adipocitelor 3T3-L1
(A) Myoblastele C2C12 au fost tratate cu CT-26 CM tratate cu SGE sau netratate după diluare cu GM și incubate timp de 48 de ore. Celulele au fost observate sub un microscop inversat, iar celulele viabile au fost măsurate prin analiza CCK-8. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SD efectuate în triplicat. (B) Pentru a induce diferențierea miogenică, mioblastele C2C12 s-au incubat în DM sau în CT-26 CM tratate cu SGE sau după diluare cu DM. După 3 zile, celulele au fost observate sub un microscop inversat și expresia MyH a fost detectată prin Western blotting. (C) Miotubele C2C12 diferențiate în DM timp de 3 zile au fost incubate suplimentar în DM sau în CT-26 CM tratate cu SGE sau timp de 48 de ore. În plus, miotuburile C2C12 au fost tratate cu TNF-a (20 ng / ml) timp de 48 de ore în prezența sau absența SGE. S-au observat celule și expresia MyH a fost determinată prin Western blotting. Intensitățile benzii relative au fost calculate utilizând software-ul ImageJ după normalizarea la tubulină. (D) Adipocitele mature 3T3-L1 au fost tratate cu CT-26 CM tratate cu SGE sau netratate timp de 48 de ore și acumularea de lipide în celule a fost măsurată prin colorarea Oil Red O. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente și sunt exprimate ca mijloace ± SD efectuate în triplicat. # p <0,01 față de controlul netratat CT-26 CM, ** p <0,01 față de controlul netratat cu SGE.
Administrarea orală zilnică a SGE la șoarecii purtători de tumori CT-26 a atenuat scăderea în greutate și creșterea tumorilor suprimate
În experimentele in vitro , SGE a indus moartea celulelor CT-26 și a inhibat pierderea musculară mediată de CT-26, lipoliza și răspunsul inflamator indus de LPS. Prin urmare, am examinat în continuare eficienta in vivo a tratamentului cu SGE în termenii efectelor sale anti-canceroase și anti-casectice la șoarecii purtători de tumori CT-26. Așa cum este arătat în Figura 6A ,6A , greutatea corporală a șoarecilor normali sănătoși a crescut constant în timpul perioadei experimentale, în timp ce sarcina tumorală CT-26 a redus greutatea corporală cu aproximativ 5,7% la 5 zile după injectarea tumorii; diferența de greutate corporală între șoarecii normali și cei care suferă de tumori a fost de aproximativ 10% indiferent de greutatea tumorii. Pe de altă parte, greutatea corporală a fost semnificativ crescută la șoarecii cu tumori CT-26 tratați cu SGE de 10 și 50 mg / kg, indicând o recuperare de aproximativ 95% și 93,3% din greutatea corporală a șoarecilor normali, respectiv 20). În concordanță cu efectul inhibitor al SGE asupra proliferării celulelor CT-26 in vitro , am observat că administrarea SGE de 10 și 50 mg / kg a suprimat în mod semnificativ creșterea tumorii cu 44,2% și, respectiv, 48,8% în șoarecii cu tumori CT-26, comparativ cu șoarecii de control tratați cu soluție salină în ziua 20 (Figura 6B ). Șoarecii de control au avut o greutate medie a tumorii de 1,88 ± 0,89 g, în timp ce șoarecii tratați cu 10 și 50 mg / kg SGE aveau greutăți medii ale tumorii de 0,79 ± 0,36 g și 0,84 ± 0,20 g, indicând suprimarea respectivă de 57,98% și respectiv 55,32% = 5.881, p = 0.0166, ANOVA cu sens unic). După cum se arată în figura 6C ,6C , în momentul sacrificării, parametrii legati de cașexie, inclusiv greutățile din masa corporală finală, carcasă, grăsime epididimală, grăsime subcutanată abdominală, mușchi gastrocnemius și inimă, doza / zi / șoarece au fost semnificativ reduse la șoarecii de control tratați cu soluție salină comparativ cu cei la șoarecii normali. În plus, nivelul IL-6 al serului a fost în mod dramatic crescut la soarecii tratați cu CT-26 cu șoareci purtători de tumori. Prin contrast, administrarea orală de SGE de 10 și 50 mg / kg a împiedicat considerabil pierderile în greutatea corporală finală (F = 6,270, p = 0,0137), greutatea carcasei (F = 6,862, p = 0,0103) , p = 0,0654), pierderea țesutului adipos (F = 9,562, p = 0,0033) și a mușchilor scheletici (F = 8,001, p = 0,0062) -26 soareci purtatori de tumori, in timp ce tratamentul cu SGE nu a restabilit pofta de mancare.Aceste rezultate arată în mod colectiv că SGE a redus povara tumorală, a reprimat răspunsurile inflamatorii și a atenuat simptomele de cașexie indusă de tumoarea CT-26.
Administrarea SGE ameliorează scăderea în greutate și întârzie creșterea tumorii la șoarecii purtători de tumori CT-26
(A-B) Șoarecii BALB / c masculi (n = 15) au fost inoculați subcutanat cu celule CT-26 (3 x 106 / șoarece).După 5 zile, șoarecii purtători de tumori au fost repartizați aleatoriu în trei grupe (n = 5 per grup) și s-au administrat zilnic salină sau SGE în doze de 10 și 50 mg / kg timp de 15 zile. De asemenea, șoarecii normali cu șobolani fără șoareci (n = 5) au fost de asemenea administrați un volum egal de soluție salină zilnic în timpul experimentului. Greutatea corporală și volumul tumorii au fost măsurate la fiecare 3 zile și au fost exprimate ca mijloace ± SD pentru fiecare grup. * p <0,05 față de controlul tratat cu soluție salină. (C) în ziua 20 șoarecii au fost sacrificați, tumorile excizate și carcasa, grăsimea epididimală, grăsimea subcutanată abdominală, mușchiul gastrocnemius și inima cântărită. Nivelurile IL-6 din ser au fost determinate prin ELISA. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente și sunt exprimate ca mijloace ± SD pentru fiecare grup. # p<0,01 față de grupul normal, * p <0,05 și ** p <0,01 față de controlul tratat cu soluție salină.
DISCUŢIE
Cuvântul „cașexia” provine din cuvintele grecești kakos, ceea ce înseamnă rău și hexia, ceea ce înseamnă starea și descrie un sindrom de risipă multifactorială caracterizat prin pierderea excesivă în greutate și epuizarea grăsimii și a mușchilor scheletici. Casexia apare la 10-40% dintre pacienții cu afecțiuni cronice, inclusiv insuficiența renală și hepatică, boala pulmonară obstructivă cronică, sindromul imunodeficienței dobândite, artrita reumatoidă și cancerul și afectează mai mult de 5 milioane de persoane din SUA [ 5,33 ].În special, cașxia indusă de cancer este unul dintre factorii cei mai critici care reprezintă morbiditatea și mortalitatea ridicată la până la 80% dintre pacienții cu cancer avansat și aproape 20% dintre pacienții cu cancer mor direct din pierderea în greutate indusă de cașexie. În plus, cașexia indusă de cancer cauzează răspunsuri slabe la chimioterapia convențională și la radioterapie în ceea ce privește eficacitatea și efectele adverse și scade supraviețuirea și calitatea vieții [ 34 , 35 ]. Mai mulți agenți prezintă eficacitate considerabilă în gestionarea cașexiei cancerului prin stimularea apetitului (de exemplu, acetat de megesterol, canabinoide, corticosteroizi și ghrelin) și reglarea mediatorilor pro-cachectici (de exemplu, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene, acidul eicosapentaenoic și beta- β-metilbutirat) [ 7 ]. Cu toate acestea, aceste medicamente au arătat limitări în ceea ce privește biodisponibilitatea lor scăzută și efectele secundare nedorite și până în prezent nu au existat tratamente aprobate pentru cașexia.
Există dovezi considerabile care arată că inversarea greutății și a pierderii masei musculare reprezintă obiectivul terapeutic pentru cașexia cancerului, mai degrabă decât stimularea apetitului [ 36-38 ]. Recent, câteva medicamente pe bază de plante, inclusiv Hochuekkito (TJ-41) și Coptidis rhizoma , au demonstrat atenuarea cașexiei cancerului prin reducerea producției de IL-6, care este un mediator critic al pierderii musculare [ 39 , 40 ]. În plus, ZBHP, cuprinzând ierburile Rhizoma Anemarrheana și Cortex Phellodendri , a crescut greutatea corporală și a suprimat atrofia musculară indusă de tumori prin inhibarea citokinelor proinflamatorii și a catabolismului muscular într-un model C26 [ 19 ]. În studiile noastre anterioare, extractul de coajă Citrus unshiu și formula tradițională orientală Sosiho-tang (Xiaochaihu-tang în chineză, Sho-saiko-to în japoneză) au îmbunătățit eficient simptomele legate de cașexie în șoarecii cu tumori CT-26 prin reducerea sistemică inflamația și degradarea mușchiului [ 32 , 41 ]. În unele cazuri, simptomele de cașexie au fost atenuate prin inhibarea creșterii tumorale, stimularea apetitului și eliminarea factorilor proacachetici derivați din tumori, cum ar fi IL-6 și miostatina [ 42 ]. Deoarece cașexia cancerului este un sindrom complex care implică factori diferiți de gazdă și tumori, medicamentele multidisciplinare pe bază de plante pot fi un remediu bun pentru tratamentul acestuia.
În studiul actual, am formulat un amestec de plante numit SGE, compus din Ginseng Radix alba , Atractylodis Rhizoma alba și Hoelen , bazat pe efectele anticanceroase, antiinflamatorii, anti-oboseală și imună pentru fiecare plante. S-a constatat că SGE la o concentrație mai mare de 100 pg / ml a determinat moartea celulelor CT-26 indusă eficient prin reglarea expresiei proteinelor anti- și pro-apoptotice și inducerea stresului ER, iar activarea AMPK a fost esențială pentru moartea celulară mediată de SGE ( Figurile1 și 2 ). Interesant, SGE a prezentat o activitate anti-proliferativă mai puternică ca amestec pe bază de plante, comparativ cu fiecare plante medicinale sau tratamentul lor co-tratament ( Figura 1 ). În plus, SGE a inhibat remarcabil producția citokinelor proinflamatorii prin suprimarea expresiei iNOS și activarea MAPK / NF-kB în celulele Raw 264.7 (Figura 3 și 4 ). Mai mult, CT-26 CM tratat cu SGE nu a afectat sever proliferarea sau diferențierea myoblastului C2C12, dar a împiedicat în mod eficient degradarea miocubului C2C12, într-o măsură similară cu cea indusă de GM sau DM normale. În plus, CT-26 CM tratat cu SGE a arătat un efect redus asupra acumulării lipidelor în adipocitele 3T3-L1 (Figura 5 ). Așa cum s-a demonstrat în experimentele in vitro în care SGE posedă activități anticanceroase, antiinflamatoare, anti-musculare și anti-lipoliză, administrarea SGE la șoarecii cu tumori CT-26 a dus la recuperarea considerabilă a greutății corporale și suprimarea semnificativă a în comparație cu tratamentul cu soluție salină (Figura 6A și 6B ).Masele musculare scheletice, masa de grăsime și greutatea inimii scăzute prin sarcina CT-26 au fost de asemenea crescute prin administrarea de SGE, în timp ce aportul de alimente a fost similar între șoarecii tratați cu soluție salină și SGE. În plus, nivelul serului IL-6 crescut de sarcina tumorală a fost, de asemenea, redus dramatic prin administrarea SGE, susținând efectele benefice ale SGE asupra simptomelor de cașexie indusă de cancer (Figura 6C ). Pe de altă parte, administrarea de SGE la șoareci normali sănătoși fără tumori nu a arătat niciun efect semnificativ al creșterii greutății corporale în comparație cu grupul martor administrat cu soluție salină ( Tabelul suplimentar 2 ). În plus, administrarea SGE a avut un efect redus asupra modificărilor de greutate ale organelor majore și a parametrilor asociați cu toxicitatea hepatică și renală, consolidând eficacitatea SGE pentru a atenua pierderea de greutate indusă de cancer, fără efecte adverse ( tabelele suplimentare 3 și 4 ).
În plus față de cașexia indusă de cancerul în sine, agenții anti-cancer provoacă, de asemenea, simptome de cașexie însoțite de greutate și pierdere de mușchi, care pot afecta eficacitatea agenților și rata de supraviețuire a pacienților. Cisplatina este un agent chimioterapeutic utilizat pe scară largă pentru tratamentul mai multor tumori solide. Recent, cisplatina a activat sistemul p38 / CEBP-β și proteome / autophagy, creșterea miostatinei și citokinelor inflamatorii și scăderea Akt și miogenin / myoD, ceea ce a dus în cele din urmă la proteoliză sporită, scăderea masei și a forței musculare, ]. Prin urmare, agenții care atenuează simptomele de cașexie induse de cisplatină pot fi aplicate chimioterapiei ca adjuvanți anti-cancer. În acest sens, medicamentele pe bază de plante care au activități farmacologice multimodale pot fi utile pentru depășirea acestor condiții și este justificată cercetarea eficacității preventive și terapeutice a SGE împotriva cașexiei induse de cisplatină.
În rezumat, studiul prezent a demonstrat că SGE reduce masa tumorală, inflamația sistemică și simptomele de cașexie la șoarecii purtători de tumori CT-26, urmată de prevenirea mușchilor induse de cancer și a degradării grăsimilor. Aceste date indică faptul că SGE este un tratament eficace pe bază de plante pentru pacienții cu cancer atunci când este combinat cu agenți chimioterapeutici anti-cancer.
MATERIALE SI METODE
Linii celule
Celulele carcinoame de colon murine CT-26 (ATCC) CRL-2638), celulele macrofage murine macrofage 264.7 (ATCC TIB-71), myoblastele murine C2C12 (ATCC CRL-1772) și pre-murine 3T3-L1 -adipocite (ATCC CL-173) au fost achiziționate de la ATCC (Manassas, VA, USA) și au fost menținute la 37 ° C într-o atmosferă de 5% C02. Mediul de mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) sau mediul Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Lonza, Walkersville, MD, USA) conținând 10% ser fetal de bovine (FBS, Biotechnics Research, Lake Forest, CA) a fost utilizat streptomicină (Cellgro, Manassas, VA, SUA) pentru celulele CT-26 și C2C12 sau, respectiv, celulele 264,7 Raw.
animale
Șoareci BALB / c de sex masculin în vârstă de șase săptămâni au fost achiziționați de la Taconic Farms (Samtako Bio Korea, Osan, Coreea) și au fost adăpostiți în condiții de patogeni specifici (ciclu de lumină / întuneric 12 h / 12 h, 22 ± 1 ° C, 55 ± 5% umiditate). Experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Institutul Coreei de Medicină Orientală (KIOM, Daejeon, Coreea, numerele de referință 13-100, # 14-074 și # 15-011) și au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la KIOM.
Prepararea macrofagelor peritoneale murine
Pentru prepararea macrofagelor peritoneale, șoarecii BALB / c masculi au fost injectați fiecare intraperitoneal cu 300 ui de tioglicolat de sodiu 3% steril (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). În ziua 3, macrofagele au fost recoltate prin irigarea cavității abdominale cu 10 ml soluție salină tamponată cu fosfat rece (PBS) și celulele roșii sanguine (RBCs) au fost lizate cu tampon de liză RBC și apoi celulele suspendate în mediu FBS / RPMI 10% au fost incubat într-un incubator de 5% C02 la 37 ° C peste noapte.După adăugarea unui mediu proaspăt, s-au utilizat celule atașate la suprafața plăcii de cultură.
Reactivi și anticorpi
Lipopolizaharida (LPS) din Escherichia coli și factorul de necroză tumorală murină recombinantă-a (rmTNF-a) au fost obținute de la Sigma Chemical Co. și Promokine (Heidelberg, Germania). Albuminul seric bovin alb (BSA) și Tween 20 au fost achiziționate de la GenDEPOT Inc. (Barker, TX, SUA) și AMRESCO (Solon, OH, SUA). Anticorpii împotriva polimerazei ribose polimerazice ADP polimerazice Bcl-2, XIAP, Bax, Bad, poly ADP ribose (PARP), sintaza oxidului nitric inductibil (iNOS), p38, p38 (Thr180 / Tyr182), kinaza reglată extracelulară (ERK) (AMPK), p-AMPK (Thr172), IkBa, pIkBa (Thr202 / Tyr204), kinaza N-terminală c-jun (JNK) Ser32) și tubulină au fost achiziționate de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA). Un anticorp anti-miozin cu lanț greu (MyH) și kitul de anticorpi ER de stres, incluzând anticorpi împotriva Bip, ER oxidoreductază 1 (Ero1) -La, enzima care necesită inozitol (IRE) 1α, izomerază proteică disulfurică (PDI) Proteina omoloagă (CHOP) și kinaza ER de tip kinază de proteină kinază (PERK), au fost obținute de la R & D Systems (Minneapolis, MN, SUA) și Cell Signaling Technology, respectiv. Dexametazona și compusul C au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co., și inhibitorii protein kinazei activate mitogen (MAPK), incluzând SP600125, SB203580 și PD98059, au fost achiziționați de la Calbiochem (San Diego, CA, SUA).
Prepararea SGE
Toate plantele uscate, inclusiv Ginseng Radix alba, Atractylodis Rhizoma alba și Hoelen , au fost achiziționate de pe piața Yeoncheon Hyundai Herbal (Yeoncheon, Coreea), au confirmat identitatea profesorului Ki Hwan Bae (Universitatea Națională Chungnam, Coreea) bancă a Centrului de aplicare a medicamentelor coreene (Daegu, Coreea). Originea fiecărei plante este prezentată în tabelul suplimentar 1 .Pentru a prepara SGE, 16,67 g din fiecare planta se macină în pudră și apoi se extrage în 500 ml etanol 70% într-un incubator de agitare la 37 ° C la 100 rpm timp de 24 ore. Extractul s-a filtrat folosind hârtie de filtru de 185 mm (Whatman, Piscataway, NJ, SUA) și s-a concentrat folosind un evaporator rotativ vid (Buchi, Tokyo, Japonia). După uscarea prin congelare, pulberea SGE a fost colectată și cântărită la 1,96 g;prin urmare, randamentul a fost de 3,92%. Pentru experimentele in vitro , pulberea SGE a fost dizolvată în DMSO 10% (v / v) până la o concentrație finală de 50 mg / ml, filtrată printr-un filtru de disc de 0,22 pm și apoi depozitată la -20 ° C până la utilizare.
Testul viabilității celulare și colorarea celulelor vii / moarte
Efectul SGE asupra viabilității celulare a fost determinat utilizând Cell Counting Kit-8 (CCK, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, celulele au fost însămânțate în plăci de cultură cu 96 de godeuri (0,5-1×104 / godeu / 100 pL), lăsate să se atașeze la plăci și apoi tratate cu concentrații variate de SGE timp de 24-48 ore. S-a adăugat o soluție CCK (10 uL / godeu) în fiecare godeu și s-a măsurat absorbanța la 450 nm utilizând cititorul de microplăci SpectraMaxi3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) după o altă incubație timp de 1 oră. În plus, celulele vii și cele moarte au fost vizualizate utilizând Kitul de imagistică celulară LIVE / DEAD (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform protocolului producătorului. Celulele vii (verde) și moarte (roșu) au fost observate sub un microscop fluorescent (Nikon Eclipse Ti, Instrumente Nikon, Kanagawa, Japonia).
Analiza Western blot
După spălarea celulelor cu PBS, s-au preparat lizatele celulare utilizând reactivul de extragere a proteinelor M-PER Mammalian (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația proteinei lizate a fost determinată utilizând Pierce ™Kitul pentru determinarea proteinei cu acid bicinchoninic (Thermo Scientific) și cantități egale din fiecare probă de proteină au fost amestecate cu tampon de probă NuPAGE 4 x dodecil sulfat de litiu (Invitrogen) și denaturați prin încălzire timp de 10 minute la 95 ° C. Probele au fost separate prin SDS-PAGE de 8-15% și transferate electro-pe o membrană de difluorură de poliviniliden (Immobilon-P, Millipore, DARMSTADT, Germania). Membranele au fost blocate într-o soluție salină 3% BSA Tris tamponată conținând 0,05% Tween 20 (TBST) timp de 1 oră la temperatura camerei și au fost incubate mai întâi cu anticorpi specifici peste noapte la 4 ° C și apoi cu anticorpi secundari conjugați HRP timp de 1 oră la temperatura camerei. După spălarea cu TBST, benzi imunoreactive au fost vizualizate folosind Substratul Western ECL Bio-Rad Clarity ™ sub ChemiDoc ™Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Intensitatea benzii a fost măsurată utilizând software-ul ImageJ (Institutul Național de Sănătate, Bethesda, MD, SUA).
Reacția în lanț cu transcripție inversă-polimerază (RT-PCR)
ARN – ul total a fost extras folosind o soluție de extracție a ARN (bioexperimentul Co., Daejeon, Coreea) și transcris invers utilizând 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (bioexperimentul Co.) în conformitate cu protocolul producătorului. s-a efectuat amplificarea cADN a iNOS, IL-6, TNF-a și IL-1a în Vertiti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și produsele ADN au fost vizualizate pe agaroză 1% gel prin colorare cu GreenLight ™ (BioAssay Co.). Intensitatea benzii relative a fost calculată folosind software-ul ImageJ.
Determinarea nivelurilor de NO în supernatantele de cultură
Celulele au fost pre-tratate cu concentrațiile indicate de SGE timp de 1 oră și apoi au fost stimulate cu LPS (200 ng / ml) timp de 24 de ore. Supernatantele culturii au fost obținute după centrifugare la 12000 rpm timp de 10 minute pentru a îndepărta reziduurile celulare și au fost amestecate cu același volum de reactiv Griess (1% sulfanilamidă, 0,1% diclorhidrat de naftiletilendiamină și 2,5% acid fosforic). După incubare timp de 5 minute la temperatura camerei, absorbanța la 570 nm a fost măsurată utilizând cititorul Multi-mode SpectraMaxi3 (Molecular Devices).
Analiza imunosorbantă enzimatică legată de citokine (ELISA)
Nivelurile de proteine ale IL-1β, IL-6 și TNF-a de șoarece în supernatantele de cultură și serurile de șoarece au fost evaluate utilizând kitul ELISA-Ready-SET-Go (eBioscience, San Diego, CA, SUA) .
Prepararea mediei condiționate CT-26 (CM)
CT-26 celule suspendate în 10% FBS / DMEM au fost însămânțate în vase de cultură de 100 mm la o densitate de 5 x 10 4 celule / cm 2 , lăsate să adere și apoi tratate cu concentrațiile indicate de SGE. După 24 ore, celulele au fost spălate de trei ori cu PBS, spălate suplimentar de două ori cu DMEM fără ser și apoi incubate timp de 24 de ore în DMEM fără ser. CM a fost colectat și centrifugat pentru a îndepărta resturile celulare, urmată de filtrare utilizând un filtru de disc de 0,22 pm.
Detectarea proliferării mioblastelor C2C12, a diferențierii miotuburilor și a degradării miotubului
CT-26 CM a fost diluat 1: 5 fie cu FBS / DMEM 10% (mediu de creștere GM), fie cu 5% ser de cal (HS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) / DMEM și au fost adăugate cantitățile corespunzătoare de FBS, HS și antibiotice pentru a compensa CM. Pentru a măsura proliferarea mioblaste C2C12, celule însămânțate în placa de cultură cu 96 de godeuri (1 x 10 3 celule / godeu) au fost tratate cu control al GM, SGE-tratate CT-26 CM, sau netratate CT-26 CM. După incubare timp de 48 ore la 37 ° C, proliferarea celulară a fost observată și măsurată utilizând kitul CCK-8. Pentru a induce diferențierea miogenică, mioblastele C2C12 la o confluență de aproximativ 80% au fost incubate în DM de control, CT-26 CM tratate cu SGE sau CT-26 CM netratate timp de 3-7 zile. Degradarea miotubului a fost indusă prin adăugarea de CT-26 CM sau TNF-a (20 ng / ml).
Măsurarea acumulării lipidelor în adipocitele 3T3-L1
Pentru a induce diferențierea adipogenică, celulele 3T3-L1 cultivate la confluență în FBS / DMEM 10% au fost incubate în DM adipocite constând din FBS / DMEM 10%, insulină (1 pg / ml), dexametazonă (1 pM) și 3-izobutil- 1-metilxantină (0,5 mM) timp de 3 zile. Ulterior, celulele au fost menținute în 10% FBS / DMEM conținând insulină (10 pg / ml) timp de 2 zile și în FBS / DMEM 10% timp de încă 2 zile, schimbând mediul zilnic. În lipoliza indusă de tumoare, adipocitele mature 3T3-L1 au fost incubate cu CT-26 CM tratate cu SGE sau netratate timp de 2 zile și apoi acumularea celulară de vacuole neutre a lipidelor a fost evaluată prin colorarea Oil Red O. Colorantul roșu reținut a fost eluat cu izopropanol și absorbanța a fost măsurată la 520 nm.
Experimente pentru cașexia indusă de cancer in vivo
Pentru a induce cancer induse cașexie, CT-26 celule (3 x 10 6celule / șoarece) au fost injectate subcutanat în regiunea abdominală a șoarecilor BALB / c masculi. În ziua 5 după injectarea tumorală, greutatea corporală și consumul de alimente au fost scăzute la șoarecii cu tumori cu aproximativ 10% comparativ cu cea a șoarecilor normali (fără tumori + salină). Șoarecii purtători de tumoare au fost împărțiți aleatoriu în trei grupe și s-a administrat zilnic salină (tumoare + salină, șoareci martor) sau SGE zilnic la doze de 10 și 50 mg / kg într-un volum de 100 uL timp de 15 zile. Șoareci normali sănătoși au fost de asemenea administrați un volum egal de soluție salină. În timpul experimentului, greutatea corporală, aportul alimentar și volumul tumorii au fost măsurate la fiecare 3 zile. În ziua 20 după injectarea tumorii, tumori, grăsime epididimală, grăsime subcutanată abdominală, mușchi gastrocnemius și inima au fost rezecați de la șoareci după sacrificare cu CO 2prin inhalare și apoi cântărit. În plus, probele de sânge integral s-au colectat și nivelele IL-6 în ser s-au determinat prin ELISA. Pentru a măsura greutatea carcasei, sângele a fost exsanguinat, iar viscerele rămase au fost șterse clar folosind un tampon de tifon.
Statistici
Datele sunt prezentate ca mijloace ± deviația standard (SD). Valorile semnificative diferite între cele două grupuri au fost analizate prin t- testul Student . Efectul tratamentului a fost analizat utilizând metoda ANOVA într-o singură direcție prin testul de comparație Dunnett. O p- valoare mai mică de 0,05 a fost considerată ca indicând semnificația statistică. Toate variabilele au fost analizate utilizând GraphPad Prism5 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA).
Note de subsol
Contribuit de
Contribuția autorului
AK și JYM au conceput cercetarea. AK și MI au proiectat și au efectuat experimentele. AK a analizat datele și a scris manuscrisul. Toți autori au analizat manuscrisul.
CONFLICTE DE INTERES
Toți autori declară că nu au conflicte de interese.
FINANȚAREA
Această lucrare a fost susținută de Grant K17281 acordat Institutului Coreei de Medicină Orientală (KIOM) din cadrul Ministerului Științei, TIC și Planificării Viitoare (MSIP), Republica Coreea.
REFERINȚE
Articolele de la Oncotarget sunt oferite aici prin amabilitatea Impact Journals, LLC
TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice 