Sosiho-tang ameliorează simptomele legate de cașexie la șoareci care suferă de adenocarcinom de colon 26 prin reducerea inflamației sistemice și a pierderii musculare

Casexia însoțită de pierderea musculară este un factor cheie determinant al prognosticului slab la pacienții cu cancer și la decesele legate de cancer. Studiile anterioare au demonstrat că citokinele inflamatorii, cum ar fi interleukina-6 (IL-6), factorul de necroză tumorală-α (TNF-α), IL-1 și interferonul-γ (IFN- y) duc la o pierdere a mușchilor scheletici, urmată de o pierdere severă a greutății corporale. Prin urmare, se consideră că blocarea răspunsului inflamator este o țintă logică pentru intervențiile farmacologice și nutriționale pentru a menține masele musculare scheletice în condiții casectice.
Sosiho-tang (SO; Xiao chai hu tang în chineză și Sho-saiko-în japoneză) este un medicament oriental pe bază de plante care a fost utilizat pentru a trata bolile hepatice cronice și pentru a controla febra.

plantele medicinale traditionale chinezesti TCM / CHM si koreene si formulele derivate cu si din acestea le cautati dupa nume pe

http://www.activeherb.com/

http://www.activeherb.com/chineseherbs

http://www.activeherb.com/chaihu/

 

În studiile recente, SO a inhibat producția de citokine inflamatorii în macrofagele stimulate de lipopolizaharidă (LPS), a împiedicat formarea trombilor și a progresat progresia cancerului. Cu toate acestea, activitatea anti-cachectică a SO la șoarecii purtători de tumori nu a fost încă examinată. În studiul de față, am caracterizat efectul administrării de SO asupra cașexiei induse de cancer la șoarecii purtători de CT-26 și a elucidat mecanismele anti-cachectice. Administrarea orală zilnică a SO în doze de 50 și 100 mg / kg la șoarecii purtători CT-26 a întârziat semnificativ creșterea tumorii și a împiedicat pierderea greutății corporale finale, a greutății carcasei, a greutății inimii, a mușchiului gastrocnemius și a grăsimii epididimale, – șoareci de control tratați. În plus, nivelele serice ale IL-6 crescute prin cancer au fost scăzute prin administrarea de SO. În linia de celule macrofage J774A.1, SO a suprimat în mod eficient creșterea LPS mediată de expresia inactivabilă a oxidului de azot (iNOS), oxid de azot (NO) și producerea de citokine inflamatorii procactice prin inhibarea factorului nuclear-kB (NF-κB) p38 activare. În plus, atrofia musculară SO atenuată provocată de celulele canceroase prin afectarea proliferării și diferențierii mioblastelor și a pierderii de miocub C2C12. Luate impreuna, aceste rezultate sugereaza ca SO este o terapie anti-cachectica sigura si folositoare pentru pacientii cu cancer cu pierdere in greutate severa.

Introducere

Cachexia cailor este un sindrom sever, debilitant și care pune viața în pericol, caracterizat printr-o pierdere marcată a mușchilor scheletici și a țesutului adipos și a apetitului, o reducere a funcțiilor fizice și o scădere profundă a greutății involuntare, în ciuda aportului alimentar adecvat ( 1-3 ). Pierderea în greutate este mai frecvent întâlnită de 80-90% dintre pacienții cu cancer pancreatic și gastrointestinal decât de pacienții cu sarcom și cancer de sân, iar cașexia severă cu o scădere în greutate de peste 10% este strâns corelată cu mortalitatea crescută, calitatea vieții afectată și răspunsul slab la chimioterapie sau radioterapie ( 4 ). În plus, pacienții cu boala cachectică sunt mai predispuși la efecte secundare toxice legate de chimioterapie. De aceea, este important să se controleze starea de cachectică la pacienții cu cancer, deoarece cașexia este principala cauză a decesului cauzat de cancer la aproximativ 25-30% dintre pacienți.

Deși mecanismele de cașexie a cancerului nu sunt complet cunoscute, studii recente au arătat că producția persistentă de citokine proinflamatorii și factori catabolici secretați atât din celulele tumorale, cât și din celulele gazdă, cum ar fi macrofagele, joacă un rol esențial în inducerea și progresia cașexiei cancerului 5 , 6 ). Printre citokinele proacachetice, interleukina-6 (IL-6) este considerată un mediator-cheie în patogeneza cașexiei cancerului. În studiile anterioare, s-a raportat că celulele secretoare de IL-6 induc pierderea atât a mușchiului, cât și a grăsimii, iar IL-6 este responsabil pentru pierderea musculară la șoareci cachectici cu cancerul uterin CT-26 sau Yomoto7 ).Tratamentul cu anticorpi monoclonali la IL-6 sau la receptorul IL-6 suprimă în mod semnificativ dezvoltarea cașexiei la șoarecii purtători de tumori și la pacienții cu cancer pulmonar care supraexprimă IL-6, sugerând că blocarea funcției IL-6 ar putea fi o o intervenție eficientă pentru administrarea pacienților cu doză cachectică8 , 9 ).

Au fost efectuate mai multe studii clinice pentru tratarea casexiei de cancer, care implică medicamente care stimulează pofta de mâncare, reduc producția de citokine proinflamatorii și inhibă degradarea proteinei induse de tumori. Cu toate acestea, tratamentele medicale actuale sunt limitate datorită eficacității scăzute și toxicității ridicate. Dintre aceștia, acetatul de medroxiprogesteron, aprobat în Europa pentru tratamentul cancerului și cachexia asociată cu sindromul imunodeficienței (SIDA), este utilizat pe scară largă în tratamentul cancerului asociat cu hormoni ca terapie de susținere ( 10 , 11 ). Cu toate acestea, acest tratament are, de asemenea, efecte secundare nedorite, incluzând diabetul, osteoporoza, modificările de dispoziție și tromboembolismul ( 12 ). Prin urmare, este esențial să se găsească agenți noi capabili să prevină cașexia indusă de cancer, cu efecte adverse minime.

Sosiho-tang (SO, cunoscut sub numele de Xiaochaihu-tang în chineză și Sho-saiko-to japoneză) este o formulă tradițională orientală orientală formată din șapte plante medicinale, inclusiv rădăcină Bupleurum, Glycyrrhizae radacina si rizom, Ginseng, radacina, Pinellia tubercul, rădăcina Scutellaria, Zingiberis rizom crud și Zizyphi fruct. SO este folosit de mult timp pentru a trata boli hepatice cronice, cum ar fi hepatita și ciroza hepatică în Coreea, China și Japonia ( 13 ). In plus, SO previne inflamatia si progresia cancerului ( 14-17 ), sugerand ca ar putea preveni, de asemenea, casexia indusa de cancer prin suprimarea raspunsurilor inflamatorii cauzate de cancer.

În studiul de față, am examinat efectele administrării orale a SO asupra gravității parametrilor cheie ai cașexiei la șoarecii purtători CT-26. În plus, am investigat, de asemenea, eficacitatea SO pentru producerea citokinelor proinflamatorii și a pierderii musculare și a elucidat în continuare mecanismul in vitro al activității sale anti-cachectice folosind liniile celulare murine, incluzând carcinomul colonului CT-26, J774A.1 macrofage și liniile de celule myoblast C2C12.

materiale si metode

celulele

Celule CT-26 de carcinom de colon murin și celule C2C12 murine mioblaste au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celulele J774A.1 asemănătoare cu macrofagele de tip mormăit [Banca de linie celulară coreeană (KCLB): nr. 40067] au fost obținute de la KCLB (Seoul, Coreea). Celulele s-au menținut în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) sau Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 (Lonza, Walkersville, MD), suplimentat cu ser fetal bovin inactivat termic (FBS; Cellgro, Manassas, VA, SUA) și penicilină (100 U / ml) / streptomicină (100 ug / ml) (Cellgro) într-un incubator umidificat cu 5% C02 la 37 ° C. Pentru a induce diferențierea miogenică, celulele C2C12 la o densitate de 70-80% au fost cultivate în DMEM conținând 5% ser de cal (HS; Gibco-BRL, Grand Island, NY, SUA) timp de 5-7 zile.

animale

Șoareci BALB / c de sex masculin în vârstă de șase săptămâni au fost cumpărați de la Taconic Farms (Samtako Bio Korea, Osan, Coreea) și adăpostiți în condiții de patogene specifice în cadrul unui ciclu de lumină-întuneric de 12 ore la 22 ± 1 ° C și 55 ± 5% umiditate. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Institutul coreean de medicină orientală (KIOM, Daejeon, Coreea) cu numerele de referință # 13-100, # 14-074 și # 15-011.Experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la KIOM.

Anticorpi și reactivi

Anticorpii împotriva p21, kinaza dependentă de ciclină (CDK) 2, ciclina D, p38, p-p38 (Thr180 / Tyr182), p-lkBa (Ser32), p-IKKa / au fost procurate transcripția (STAT) 3, p-STAT3 (Tyr705), p65, p-p65 (Ser536), sintaza de oxid nitric inductibil (iNOS) și TBP de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anticorpul anti-a-tubulină a fost obținut de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anticorpul împotriva lanțului greu de miozină a fost achiziționat de la R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anticorpii anti-șoarece și anti-iepure conjugați cu peroxidază de hrean (hRP) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology. Factorul de necroză tumorală murină tumorală recombinantă (rMu TNF-a) a fost achiziționat de la Promokine (heidelberg, Germania).

Prepararea SO

Compoziția extractului de plante SO este prezentată în tabelul I. Toate plantele au fost obținute de pe piața de plante Yeongcheon (Yeongcheon, Coreea), validată de profesorul Ki hwan Bae (Universitatea Națională Chungnam, Daejeon, Coreea), și depozitate în banca de plante de la KIOM înainte de utilizare. Un total de 1.674,5 g de SO se toacă au fost extrase prin căldură în 16,745 litri de apă distilată timp de 3 ore la 115 ° C folosind un extractor Cosmos-600 (Gyungseo, Incheon, Coreea). Decocția a fost filtrată prin site de testare standard (150 pm , Retsch, Haan, Germania), liofilizată și depozitată în desicatoare la 4 ° C. Cantitatea finală de pulbere de liofilizată a fost de 416,783 g, iar randamentul a fost de 24,89%. Pentru experimentele in vitro , pulberea de SO a fost dizolvată în 10% dimetilsulfoxid la 50 mg / ml, filtrată printr-un filtru de disc de 0,22 μm și apoi depozitată la -20 ° C înainte de utilizare.

Design experimental al cașexiei de cancer

Celulele CT-26 au fost inoculate subcutanat în regiunea abdominală a șoarecilor BALB / c masculi de șapte săptămâni (5 x 106 celule / șoarece). Pentru a confirma inducerea cașexiei mediate de cancer, greutățile corporale și volumele tumorilor șoarecilor au fost măsurate o dată la 2 zile pe tot parcursul experimentului. Pierderile semnificative de greutate la șoarecii purtători de tumori au fost observate între 8-10 zile după inocularea tumorală și șoarecii au fost hrăniți cu soluție salină sau SO în doze de 50 și 100 mg / kg din ziua 10 până în ziua 27 după inocularea tumorii. Doza administrată a fost calculată în funcție de cantitatea utilizată la adulți umani (33,49 g / 60 kg greutate corporală / zi) și randamentul extractului pulbere (24,89%). Șoarecii de control sănătoși cu vârsta potrivită care nu au tumori au fost tratați cu soluție salină. În timpul experimentelor, consumul de alimente a fost calculat ca valoarea medie a cinci șoareci pe cușcă. La momentul sacrificării, șoarecii au fost eutanasiati prin injectare intraperitoneală cu un amestec de zoletil (Virbac, Magny-en-Vexin, Franța) și rompun (Bayer, Seul, Coreea) din 2: 1, apoi tumora, grăsimea epididimală, gastrocnemius mușchiul și inima au fost disecate și cântărite. În plus, s-au obținut probe de ser pentru măsurarea nivelurilor de IL-6, a factorului de necroză tumorală (TNF) -α și IL-1β. După expansiune, viscerele rămase au fost îndepărtate, iar greutatea carcasei a fost măsurată.

Prepararea mediului condiționat condiționat CT-26 (CM)

Celulele CT-26 au fost placate în bucăți de cultură de 100 mm la o densitate de 5×104 celule / cm2 și tratate cu sau fără SO timp de 24 de ore în condiții complete de mediu.După spălarea de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), celulele au fost spălate suplimentar de două ori cu mediu fără ser și apoi incubate timp de încă 24 de ore în DMEM fără ser. CM rezultat a fost centrifugat pentru a îndepărta resturile, a fost filtrat utilizând un filtru de disc de 0,22 μm și apoi a fost depozitat într-un congelator.CM a fost diluat la un raport 1: 3 sau 1: 5 cu DMEM conținând FBS 10% și antibiotice [mediu de creștere (GM)] pentru tratamentul cu myoblast sau DMEM conținând 5% hS și antibiotice [mediul de diferențiere (DM) tratamentul cu miotube. Înainte de diluare, o cantitate adecvată de FBS, hS sau antibiotice pentru compensare a fost adăugată la CM.

Testul de proliferare a mioblastelor

Pentru a examina proliferarea myoblastului C2C12, celulele s-au placat într-o placă de cultură cu 96 de godeuri la o densitate de 1 x 103 celule / godeu și apoi s-au tratat cu CM tratat cu SO sau -TC necircit la 37 ° C timp de 48 ore. La punctele de timp indicate, proliferarea celulară a fost determinată utilizând Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonia) conform protocolului producătorului.

Determinarea producției de NO

Celulele au fost pretratate cu concentrațiile indicate de SO timp de 1 oră și apoi au fost stimulate cu LPS timp de 24 de ore. Supernatantul de cultură colectat a fost amestecat cu un volum egal de reactiv Griess (1% sulfanil-amidă, 0,1% dihidroclorură de naftiletilendiamină și 2,5% acid fosforic) și incubat la temperatura camerei timp de 5 minute și apoi absorbția a fost măsurată la 570 nm.

Reacția în lanț cu transcripție inversă-polimerază (RT-PCR)

ARN-ul total a fost izolat utilizând o soluție de extracție a ARN (BioAssay Co., Daejeon, Coreea) conform instrucțiunilor producătorului, iar concentrațiile de ARN au fost cuantificate utilizând un spectrofotometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, SUA). ARN-ul (3 ug) a fost transcris invers folosind un kit de sinteză cADN cDNA (BioAssay Co.) și apoi probele cADN au fost analizate prin PCR semicantitative folosind primeri specifici ( tabelul II ). Produsele PCR au fost vizualizate prin electroforeză folosind geluri de agaroză și colorare cu GreenLight ™ (BioAssay Co.), iar intensitățile benzii au fost analizate utilizând software-ul ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

Tabelul II

Primerii utilizați pentru PCR.

Analiza Western blot

Pentru lizatele de celule întregi, celulele au fost recoltate, spălate și lizate în M-PER Reactiv de extracție a proteinei mamifere (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA).Fracțiunile citosolice și nucleare au fost obținute folosind NE-PER Reactiv de extracție nucleară și citoplasmică (Thermo Scientific). Lizatele s-au separat utilizând electroforeza pe gel de poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE), urmată de transferul pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA), apoi blocată cu albumină serică bovină 3% ) în soluție salină tamponată cu Tris conținând 0,05% Tween-20 (TBST) și imunoblotată utilizând anticorpi specifici la 4 ° C peste noapte. După spălarea cu TBST, membranele au reacționat cu anticorpi secundari conjugați cu HRP timp de 1 oră la temperatura camerei și proteinele țintă au fost vizualizate utilizând substratul de sensibilitate maximă SuperSignal WestFemto (Pierce, Rockford, IL, SUA) și ImageQuant LAS 4000 Mini (GE healthcare, Piscataway, NJ, SUA).Intensitățile relative ale benzii au fost măsurate utilizând software-ul ImageJ.

Enzimă-legată de imunosorbant (ELISA)

Nivelurile de IL-6 murine, TNF-a și IL-1p în supernatantele de cultură și seruri au fost determinate utilizând un kit de anticorpi ELISA (eBioscience, San Jose, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± deviația standard (SD). Diferențele între grupuri au fost analizate prin testul t Student folosind software-ul SigmaPlot (versiunea 8.0; SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). P <0,05 a fost considerată a indica o diferență statistic semnificativă.

Rezultate

Administrarea orală a SO ameliorează simptomele de cașexie la șoarecii purtători de tumori CT-26 și suprimă creșterea tumorală

Pentru a examina dacă SO este un tratament eficient pentru cașexia indusă de cancer, șoarecii au fost administrați SO de la 10 zile după inocularea celulară CT-26, când șoarecii au prezentat reduceri ale greutății corporale și ale consumului de alimente cu ~ 10-12% comparativ cu șoarecii normali Figura 1 ). Șoarecii normali au prezentat o creștere treptată a greutății corporale în timpul perioadei experimentale cu 21,6%, în timp ce șoarecii de control au avut o creștere a greutății corporale cu 4,3% ( figura 2A ).Administrarea de SO în doze de 50 și 100 mg / kg a crescut semnificativ greutatea corporală, respectiv cu 13,1 și respectiv 13,7%, indicând recuperarea greutății corporale la 93,5 și, respectiv, 93,9% la șoarecii normali.

În studiile anterioare, s-a raportat că SO inhibă proliferarea celulelor prin stoparea ciclului celular la G0 / G1 și induce apoptoza diferitelor tipuri de celule canceroase, incluzând carcinomul hepatocelular, carcinomul pulmonar Lewis, cholangiocarcinomul, carcinomul ovarian și celulele renale carcinomul ( 15 , 16 ). În studiul prezent, administrarea SO la 50 și 100 mg / kg a întârziat semnificativ creșterea tumorii CT-26, cu 34,29 și, respectiv, 38,81% comparativ cu șoarecii martor în ziua 27.

Șoarecii de control au avut o greutate medie a tumorii de 2,88 ± 0,89 g, în timp ce șoarecii tratați cu 50 și 100 mg / kg SO au avut greutăți medii ale tumorii de 2,52 ± 0,61 și 2,26 ± 0,19 g, reflectând reduceri de 12,56 și, respectiv, 21,37%Figura 2B ).

Valorile medii ale consumului de alimente / șoarece / zi în timpul experimentului pentru șoarecii normali, de control și 50 și 100 mg / kg SO au fost de 3,56 ± 0,11, 3,13 ± 0,24, 3,32 ± 0,16 și respectiv 3,37 ± 0,18 g , indicând faptul că SO contribuie la îmbunătățirea apetitului (datele nu sunt prezentate).

În plus, administrarea de SO a împiedicat în mod semnificativ pierderea greutății corporale finale, a greutății carcasei, a greutății inimii și a pierderii țesutului adipos epididimal și a mușchiului gastrocnemius la șoarecii purtători de tumori CT-26. Mai mult, nivelele IL-6 ale serului au fost semnificativ crescute la șoarecii de control care poartă tumori comparativ cu șoarecii normali purtători de tumori și aceste valori au fost semnificativ reduse prin administrarea de SOFigura 2C ). 

Nivelurile serice ale TNF-a și IL-1β au fost sub limita de detecție în toate grupurile (datele nu sunt prezentate).

 Aceste rezultate indică faptul că SO reduce povara tumorală și întârzie procesul de cașexie indusă de tumoarea CT-26.

Figura 2

Efectele administrării de SO asupra greutății corporale, a creșterii tumorale, a parametrilor nutriționali și a nivelelor serice de interleukină (IL) -6 în șoarecii purtători de tumori CT-26. În ziua 10 după inocularea tumorii, șoarecii au fost administrați zilnic cu SO în doze de 50 și 100 mg / kg sau cu soluție salină timp de 17 zile consecutiv.Soarecii de control sănătoși fără tumori au fost, de asemenea, tratați zilnic cu soluție salină. Greutatea corporală, dimensiunea tumorii și consumul alimentar au fost măsurate în zilele 14, 17, 20, 24 și 27 (A și B). După sacrificarea șoarecilor, carcasa, grăsimea epididimală, mușchiul gastrocnemius și inima au fost cântărite, iar nivelele IL-6 serice au fost măsurate utilizând un test imunoabsorbant legat de enzime (ELISA) (C). Experimentele pe animale s-au efectuat de trei ori. Sunt prezentate rezultate reprezentative.

SO reduce producția de NO indusă de LPS, expresia iNOS și producerea de citokine inflamatorii în celulele macrofage J774A.1 murine

Figura 2C arată că nivelul seric al IL-6 a fost semnificativ scăzut prin administrarea de SO la șoarecii care poartă CT-26 comparativ cu șoarecii de control. La pacienții cu cancer, tumoarea induce un răspuns inflamator al gazdei cronice, caracterizat prin producerea de citokine cum ar fi IL-6, IL-1 (3, IFN-y și TNF-a. Aceste citokine sunt cunoscute ca fiind implicate în inducerea pierderii musculare cauzate de cancer prin activarea expresiei iNOS și producției de NO ( 18-20 ). Prin urmare, am examinat dacă SO ar putea suprima expresia iNOS, producerea de NO și producerea de citokine inflamatorii în celulele J774A.1 stimulate cu LPS. Astfel, aproape total blocat creșterea LPS indusă de expresia iNOS atât la nivelul mRNA, cât și la nivel proteic ( fig.3A ). Mai mult, SO la 10, 50 și 100 ug / ml au inhibat producția de NO cu 59,62, 76,43 și respectiv 90,42%, într-o manieră dependentă de doză, comparativ cu martorii netratați ( Figura 3B ). Nivelurile mRNA ale IL-6, IL-1a și TNF-a, precum și nivelele de proteină ale IL-6, IL-1p și TNF-a au crescut puternic prin stimularea LPS și au fost suprimate eficient prin tratamentul cu SO ( Fig.3C și D ). Similar cu observațiile din celulele J774A.1, SO a suprimat producția de NO produsă de LPS, expresia iNOS și producția de citokine în macrofagele peritoneale (datele nu sunt prezentate). SO la concentrațiile utilizate în experimente nu au afectat viabilitatea celulelor J774A.1 sau a macrofagelor peritoneale primare, excluzând posibilitatea efectelor citotoxice.

Figura 3

Efectul inhibitor al SO asupra producției de oxid nitric (NO) indusă de lipopolizaharidă (LPS) și a producerii de citokine inflamatorii în celule J774A.1 de macrofage murine. (A) Celulele J774A.1 au fost pretratate cu concentrațiile indicate de SO timp de 1 oră și apoi au fost stimulate cu 200 ng / ml LPS timp de 24 de ore. Nivelurile ARNm și proteinele inductibile de sintază de oxid de azot (iNOS) au fost examinate prin RT-PCR și, respectiv, Western blotting. Intensitățile benzii relative la celulele stimulate cu LPS au fost calculate utilizând software-ul ImageJ. Nivelurile de gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și tubulină au fost măsurate pentru normalizare. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente. (B) Supernatantele de cultură au fost colectate și analizate pentru producerea de NO. Celulele martor au fost tratate cu vehicul singur. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente efectuate în triplicat și sunt exprimate ca mijloace ± SD. #P <0,05 față de controlul netratat, * P <0,05 față de celulele de control netratate cu SO. (C) Celulele J774A.1 pretreate cu SO timp de 1 oră au fost stimulate cu 200 ng / ml LPS timp de 6 ore.Nivelurile mRNA pentru interleukina (IL) -6, IL-1α și factorul de necroză tumorală (TNF) -α au fost analizate prin RT-PCR, iar creșterile relative ori au fost calculate după normalizarea cu GAPDH utilizând software-ul ImageJ. Datele arată mijloace ± SD a două experimente independente. #P <0,05 față de controlul netratat, * P <0,05 față de celulele de control netratate cu SO. (D) După stimularea celulelor pre-tratate cu LPS timp de 24 h, nivelurile de IL-6, IL-1 p și TNF-a din supernatantele de cultură au fost cuantificate prin ELISA. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente independente efectuate în triplicat și sunt exprimate ca mijloace ± SD. #P <0,05 față de controlul netratat, * P <0,05 față de celulele de control netratate cu SO.

SO blochează activarea p38, NF-kB și STAT3 indusă de LPS în celulele J774A.1

Deoarece activările mitogen-protein kinazei (MAPK), NF-κB și STAT3 sunt strâns legate de citokine proinflamatorii, am examinat dacă aceste căi au fost afectate de tratamentul cu SO. După stimularea cu LPS, nivelurile de p38, IkBa, IKKαβ și STAT3 fosforilate au fost scăzute semnificativ prin tratamentul cu SO, într-o manieră dependentă de doză ( Figura 4A ). Cu toate acestea, nivelurile de ERK și JNK fosforilate nu au fost afectate (datele nu sunt prezentate). Deoarece activarea NF-kB necesită translocarea nucleară a p65, am măsurat nivelele p65 în fracțiile citozolice și nucleare. În celulele martor, subunitatea p65 a fost translocată din citozol la nucleu prin stimulare cu LPS, în timp ce tratamentul cu SO a împiedicat în mod eficient translocarea nucleară p65 într-o manieră dependentă de doză ( Figura 4B ).

Figura 4

Efectul SO asupra fosforilării p38 și STAT3 indusă de LPS și a activării NF-kB în celulele J774A.1. (A) Celulele pretreate cu SO (50 sau 100 pg / ml) timp de 12 ore au fost stimulate cu LPS (200 ng / ml) timp de 30 min și apoi supuse la Western blotting.Intensitățile banda relativ la celulele martor netratate cu SO au fost calculate după normalizare la exprimarea tubulinei. (B) Translocarea nucleară indusă de LPS a subunității NF-kB p65 a fost măsurată prin Western blotting. Tubulina și TBP au fost utilizate ca martori de încărcare pentru fracțiunile citosolice și nucleare, respectiv.

SO atenuează atrofia mușchilor scheletici mediată de CT-26 în miotuburile murine C2C12

În cazexia cancerului, citokinele proinflamatorii incluzând IL-6, IL-1 β, IFN-γ și TNF-α au fost implicate în progresia pierderii mușchilor scheletici ( 21 ). Pe lângă acești factori umorali, factorii derivați din tumori, cum ar fi factorul de inducere a myostatinei și proteoliză, promovează în mod colectiv pierderea mușchilor scheletici ( 22-24 ). În studiile anterioare, s-a raportat că CT-26 CM a inhibat proliferarea și diferențierea mioblastului C2C12 și a stimulat pierderea miocubului C2C12, în timp ce miostina secretă din tumori a acționat ca un factor cheie ( 22 ). Pentru a examina efectele SO asupra pierderii musculare induse de tumori, am evaluat proliferarea myoblastului C2C12 după expunerea la CT-26 CM tratați cu SO sau la diluții 1: 3 sau 1: 5 cu GM.Controlul CM a întârziat semnificativ creșterea mioblastelor C2C12 cu ~ 65 și 55% la diluții de 1: 3 și 1: 5, comparativ cu GM ( Fig.5A ). Cu toate acestea, în comparație cu controlul CM, CM tratat cu SO la 100 ug / ml nu a provocat o inhibare semnificativă a proliferării myoblastului C2C12, rezultând inhibarea 28,2 și 7,7% la diluții 1: 3 și 1: 5, comparativ cu GM. Deoarece CT-26 CM inhibă proliferarea mioblastelor prin stoparea ciclului celular, am examinat în continuare efectul CM tratat cu SO sau nemodificat asupra expresiei proteinelor legate de ciclul celular în mioblastele C2C12. În concordanță cu studiile anterioare, nivelul p21 a fost reglat dramatic în sus după expunerea la martor CM, în timp ce nivelurile de CDK2 și ciclină D au scăzut. Totuși, schimbările în aceste proteine ​​în mioblastele C2C12 expuse la CM tratate cu SO au fost nesemnificative, în concordanță cu efectele lor asupra proliferării celulare ( Figura 5B ).În mod special, nivelurile de IL-6 din CT-26 CM au fost semnificativ scăzute prin tratamentul cu SO, într-o manieră dependentă de doză ( Figura 5C ). Apoi am examinat dacă SO a atenuat inhibarea mediată de CT-26 a diferențierii de mioblast C2C12. Figura 6A arată că mioblastele C2C12 care diferențiază în controlul CM (diluat la un raport de 1: 5 cu DM) au prezentat numere de miotuburi reduse comparativ cu controlul netratat, în timp ce CM tratat cu SO a atenuat ușor degradarea diferențierii de mioblast C2C12.Analiza imunoblotului a arătat că expresia Myh în diferențierea mioblastelor în CM de control a fost semnificativ mai scăzută comparativ cu DM, în timp ce SO a împiedicat în mod semnificativ o reducere mediată CT-26 în exprimarea Myh ( Figura 6B ). Pentru a examina efectul SO asupra pierderii de miotub C2C12, miotuburile C2C12 diferențiate au fost incubate în CT-26 CM tratate cu SO sau la un diluție 1: 5 cu DM timp de 48 de ore. Miotuburile incubate cu martor CM au prezentat un aspect considerabil de pierdere a mușchilor, în timp ce miotuburile incubate cu CM tratate cu SO nu au prezentat pierderi musculare, menținând aproape intact miotuburile într-o manieră similară cu cele controlate cu DM ( fig.6C ). Expresia Myh în miotuburi a fost de asemenea redusă prin controlul CM, în timp ce a fost semnificativ conservată în miotuburile incubate cu CM tratate cu SO în comparație cu martorii tratați cu DM. În plus, controlul CM a crescut fosforilarea p65 în miotuburi, în timp ce CM tratat cu SO nu a făcut-o ( Figura 6D ). Studiile anterioare au arătat că atrofia mușchilor scheletici a fost indusă de TNF-a, după cum arată o scădere semnificativă a miotubelor de suprafață a celulelor derivate din celulele C2C12 și expresia Myh ( 25 ). Am confirmat faptul că TNF-α a indus pierderea miotubului și SO a atenuat semnificativ atrofia mușchilor scheletici mediată de TNF-a în celulele C2C12 ( fig.6C și D ).

Figura 6

Efectul SO asupra diferențierii miogenice a myoblasturilor C2C12 și asupra pierderii de miotuburi C2C12. (A și B) Myoblastele C2C12 au fost incubate în mediu de diferențiere (DM) sau în CT-26 CM tratat cu SO sau diluat 1: 5 cu DM. Conținutul serului de cai și al antibioticelor a fost corectat la DM de control. După 4 zile, celulele au fost observate sub un microscop inversat, iar expresia lanțului greu de miozină (Myh) a fost măsurată prin Western blot. (C și D) Myotuburile C2C12 diferențiate în DM-uri timp de 4 zile au fost incubate în DM sau în CT-26 CM tratat sau SO-diluat diluat 1: 5 cu DM. După 48 de ore, s-a observat degradarea miotubului sub un microscop inversat, iar expresia Myh a fost măsurată prin western blotting. Deșeurile de miotuburi de C2C12 au fost, de asemenea, examinate după tratamentul cu TNF-a (20 ng / ml) cu sau fără concentrațiile indicate de SO.

Discuţie

Casexia este un sindrom metabolic complex caracterizat prin anorexie, pierderea masei musculare scheletice și a țesutului adipos, scăderea semnificativă a greutății corporale și astenia. Se întâmplă în numeroase boli cronice, incluzând cancerul, SIDA, insuficiența renală, diabetul și boala pulmonară obstructivă cronică. Jumătate din toți pacienții cu cancer și 80-90% dintre pacienții cu tumori de origine pancreatică și gastrică prezintă un sindrom de cașexie, care are un impact profund asupra calității vieții și cauzează reacții adverse mai severe legate de chimioterapie și o durată de viață mai scăzută. Cel mai important, majoritatea pacienților cu cancer terminal suferă de cașexie, iar 22% dintre ei mor ca urmare a acestei tulburări ( 1 – 3 , 26 ).

Numeroase citokine secretate din tumora sau celulele inflamatorii gazdă, incluzând TNF-a, IL-1, IL-6 și IFN-y, au fost postulate pentru a acționa ca factori proacachetici care imită semnalarea leptinei și suprimă semnalizarea ghrelinelor, conducând la anorexie susținută . Mai mult, aceste citokine sunt, de asemenea, implicate în inducerea pierderii musculare scheletale mediate de cancer prin inhibarea sintezei proteinelor și / sau accelerarea degradării proteinelor. Scăderea mușchilor scheletici este strâns asociată cu rezultate mai grave la pacienții supuși intervenției chirurgicale, chimioterapiei și radioterapiei; prin urmare, inversarea masei musculare scheletice și scăderea în greutate corporală prin inhibarea citokinelor proacachetice pot fi utile pentru managementul pacienților cu cancer și pentru o creștere generală a bunăstării3 , 6 , 18-20 ).

Strategiile actuale de gestionare a cașexiei de cancer care utilizează stimulente pentru apetit, agenți progestativi și agenți orexigeni sunt limitate datorită eficacității lor slabe in vivo și toxicității ridicate. În schimb, medicamentele pe bază de plante au primit o atenție sporită pentru a fi utilizate ca adjuvanți pentru a spori eficacitatea și pentru a diminua complicațiile în timpul chimioterapiei sau radioterapiei. 

Studii recente au arătat că administrarea Rikkunshito, o medicină japoneză Kampo compusă din opt plante medicinale, a atenuat anorexia-cașexia, a prelungit supraviețuirea și a promovat eficacitatea anticanceros prin potențarea semnalizării ghrelinului la șoareci purtători de tumori27 , 28 ). 

Hochuekkito, o formulă Kampo compusă din 10 plante medicinale, a atenuat în mod semnificativ reducerile semnificative ale greutății carcasei, aportului alimentar și a apei și greutatea mușchiului gastrocnemius și a țesutului adipos epididimal cauzat de adenocarcinomul CT-26 prin suprimarea producției de IL-6 în macrofage 29 ). 

În plus, Sipjeondaebo-Tang (Shi-Quan-Da-Bu-Tang în chineză și Juzen-Taiho-To în japoneză), compus din 10 specii de ierburi, a arătat efecte terapeutice asupra anorexiei și cașexiei prin modificarea greutății corpului și a mușchiului, consumul de alimente și producția de citokine și hormoni 30 ).

 Unele ierburi naturale și componentele acestora, inclusiv Rhizoma coptidis, berberină și quercetin, au prezentat efecte anti-cachectice prin inhibarea creșterii tumorilor și suprimarea inflamației31 , 32 ).

SO este o rețetă tradițională pe bază de plante orientale care a fost folosită de mult timp pentru a vindeca frisoane alternante și febră de la jumătate exterioară, jumătate din boala Yang mai mică și a fost utilizată pentru a trata pacienții cu afecțiuni hepatice, inclusiv fibroza hepatică, hepatitele cronice și carcinomul hepatocelular ( 14-16 ). SO este în prezent prescris pentru gestionarea febrei și a durerilor în gât. Studiile anterioare au demonstrat că SO previne comportamentul depresiv la rozătoare prin creșterea valorilor serotoninei și a acidului 5-hidroxiindoleacetic în cortexul și hipocampul prefrontal, inhibând formarea de trombi prin activitatea antiplachetară și suprimă reacția anafilactică în celulele mastocite ( 33-35 ). Recent, am demonstrat că SO are activitate antiinflamatorie în celulele RAW 264.7 stimulate cu LPS prin suprimarea activării NF-kB și fosforilarea MAPK ( 17 ).

Studiul de față a examinat dacă administrarea de SO a exercitat efecte inhibitoare asupra inducției cașexiei la șoarecii purtători de adenocarcinom CT-26 și a determinat apoi acțiunea mecanismului zof pentru această activitate antiacachetică. Datele noastre au arătat că administrarea orală SO a inhibat semnificativ creșterea tumorală și greutatea corporală recuperată în comparație cu șoarecii de control tratați cu soluție salină. Astfel, s-a prevenit pierderea de mușchi scheletici / țesut adipos și creșterea nivelurilor serice ale IL-6 determinate de tumora CT-26. De asemenea, am observat că SO a suprimat producția de citokine inflamatorii procacctice, inclusiv IL-6, IL-1 și TNF-a, în macrofage prin inhibarea generării NO și suprimarea activării p38, NF-kB și STAT3.În plus, SO a prevenit atrofia musculară mediată de CT-26 implicând proliferarea, diferențierea și risipirea în myoblastele și myotuburile murine C2C12.

Rezumat, rezultatele prezente demonstrează că SO reduce povara tumorală și răspunsurile inflamatorii sistemice, urmată de prevenirea degradării musculare și a lipidelor, indicând faptul că SO este un medicament pe bază de plante sigur și eficient pentru tratarea pacienților cu cancer cu cașexie prin protejarea împotriva pierderii masei musculare scheletice în condiții catabolice.

Recunoasteri

Prezentul studiu a fost susținut de Grant K15280 acordat Institutului Coreei de Medicină Orientală (KIOM) din cadrul Ministerului Științei, TIC și Planificării Viitoare (MSIP), Republicii Coreea

Metrics: HTML 0 vizualizări | PDF 0 vizualizări     Citată de (CrossRef): 0 citate
4

4 total citations on Dimensions.

4 Total citations
4 Recent citations
1.76 Field Citation Ratio
0.79 Relative Citation Ratio
6 readers on Mendeley

Referințe

1

Fearon KC, Voss AC și Hustead DS; Cancerul de Cachexie de cancer Grupa de studiu: Definirea cașexiei cancerului: Efectul pierderii în greutate, aportul alimentar redus și inflamația sistemică asupra stării funcționale și a prognosticului. Am J Clin Nutr. 83: 1345-1350. 2006. PubMed / NCBI

2

Tazi E și Errihani H: Tratamentul cașexiei în oncologie. Îngrijirea indiană J Palliat. 16: 129-137. 2010.

3

Aoyagi T, Terracina KP, Raza A, Matsubara H și Takabe K: Cachexia cancerului, mecanism și tratament. World J Gastrointest Oncol. 7: 17-29. 2015. PubMed / NCBI

4

Ozzy Zalite I, Zykus R, Francisco Gonzalez M, Saygili F, Pukitis A, Gaujoux S, Charnley RM și Lyadov V: Influența cașexiei și sarcopeniei asupra supraviețuirii în adenocarcinomul ductal pancreatic: O revizuire sistematică. Pancreatology.15: 19-24. 2015. Vezi articolul : Google Scholar

5

Grabiec K, Burchert M, Milewska M, Błaszczyk M și Grzelkowska-Kowalczyk K: mecanisme sistemice și locale care duc la cașexie în cancer. Postepy hig Med Dosw (online). 67: 1397-1409. 2013. În poloneză. Vizualizați articolul : Google Scholar

6

Onesti JK și Guttridge DC: Reglarea bazată pe inflamație a cașexiei de cancer.BioMed Res Int. 2014: 1684072014. Vizualizați articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

7

Tamura S, Ouchi KF, Mori K, Endo M, Matsumoto T, Eda H, Tanaka Y, Ishitsuka H, ​​Tokita H și Yamaguchi K: Implicarea interleukinei 6 umane în cașexia experimentală indusă de un xenogref de carcinom cervical uterin uman. Clin Cancer Res. 1: 1353-1358. 1995. PubMed / NCBI

8

Enomoto A, Rho MC, Fukami A, hiraku O, Komiyama K și hayashi M: Suprimarea cașexiei cancerului prin 20S, 21-epoxy-resi bufogenin-3-acetat – un nou antagonist al receptorului IL-6 nepeptidic. Biochem Biophys Res Commun. 323: 1096-1102. 2004. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

9

Ando K, Takahashi F, Kato M, Kaneko N, Doi T, Ohe Y, Koizumi F, Nishio K și Takahashi K: Tocilizumab, o terapie propusă pentru cașexia cancerului pulmonar care exprimă Interleukin6. Plus unu. 9: e1024362014. Vizualizați articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

10

Madeddu C, Macciò A, Panzone F, Tanca FM și Mantovani G: Acetat de medroxiprogesteron în tratamentul cazexiei de cancer. Expert Opin Pharmacother. 10: 1359-1366. 2009. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

11

Mantovani G, Macciò A, Lai P, Massa E, Ghiani M și Santona MC: Implicarea citokinelor în anorexia / cachexia cancerului: Rolul acetatului de megestrol și acetat de medroxiprogesteron asupra reducerii citokinelor și ameliorarea simptomelor clinice. Crit Rev Oncog. 9: 99-106. 1998. Vezi articolul : Google Scholar

12

Inui A: Sindromul de anorexie-cachexie a cancerului: Probleme curente în cercetare și management. CA Cancer J Clin. 52: 72-91. 2002. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

13

Lee JK, Kim JH și Shin HK: Efectele terapeutice ale medicamentului oriental pe bază de plante Sho-saiko-pe ciroza hepatică și carcinomul. Hepatol Res. 41: 825-837. 2011. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

14

Shimizu I: Sho-saiko-to: medicament japonez pe bază de plante pentru protecția împotriva fibrozei hepatice și carcinomului. J Gastroenterol Hepatol. 15: D84-D90. 2000. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

15

Mizushima Y, Kashii T, Tokimitsu Y și Kobayashi M: Efectul citotoxic al medicamentelor din plante Sho-saiko-on asupra liniilor celulare de cancer pulmonar uman in vitro. Oncol Rep. 2: 91-94. 1995. PubMed / NCBI

16

Yano H, Mizoguchi A, Fukuda K, Haramaki M, Ogasawara S, Momosaki S și Kojiro M: Medicamentul pe bază de plante Sho-saiko – inhibă proliferarea liniilor de celule canceroase prin inducerea apoptozei și oprirea în faza G0 / G1. Cancer Res. 54: 448-454. 1994. PubMed / NCBI

17

Oh YC, Cho WK, Jeong YH, Im GY, Lee KJ, Yang HJ și Ma JY: Efectul antiinflamator al Sosihotang prin inhibarea căilor de semnalizare a factorului nuclear-kB și a mitogenului activat protein kinazelor în celule macrofage RAW 264.7 stimulate cu lipopolizaharidă . Food Chem Toxicol. 53: 343-351. 2013. Vezi articolul : Google Scholar

18

Barton BE: Citokinele asemănătoare IL-6 și carachexia cancerului: Consecințele inflamației cronice. Immunol Res. 23: 41-58. 2001. Vezi articolul : Google ScholarPubMed / NCBI

19

MacDonald N: Cachexia de cancer și țintirea inflamației cronice: O abordare unificată a tratamentului cancerului și îngrijire paliativă / suportivă. J Suport Oncol. 5: 157-162. 2007. PubMed / NCBI

20

Deans C și Wigmore SJ: Inflamația sistemică, cașexia și prognosticul la pacienții cu cancer. Curr Opin Clin Nutr Metab Îngrijire. 8: 265-269. 2005. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

21

Bonetto A, Aydogdu T, Kunzevitzky N, Guttridge DC, Khuri S, Koniaris LG și Zimmers TA: activarea STAT3 în legăturile musculare scheletice, pierderea musculară și răspunsul în fază acută în cazexia de cancer. Plus unu. 6: e225382011. Vizualizați articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

22

Lokirady S, Wijesoma IW, Bonala S, Wei M, Sze SK, McFarlane C, Kambadur R și Sharma M: Myostatinul este un nou factor tumoral care induce cașexia cancerului. Biochem J. 446: 23-36. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

23

Costelli P, Muscaritoli M, Bonetto A, Penna F, Reffo P, Bossola M, Bonelli G, Doglietto GB, Baccino FM și Rossi Fanelli F: Semnalizarea musatului muscular este îmbunătățită în cazexia cancerului experimental. Eur J Clin Invest. 38: 531-538. 2008. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

24

Jespersen J, Kjaer M și Schjerling P: Rolul posibil al miostatinei în atrofia musculară scheletică și cașexia. Scand J Med Sci Sports. 16: 74-82. 2006. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

25

Langen RC, Schols AM, Kelders MC, Wouters EF și Janssen-Heininger YM: Citokinele inflamatorii inhibă diferențierea miogenică prin activarea factorului nuclear-kappaB. FASEB J. 15: 1169-1180. 2001. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

26

Donohoe CL, Ryan AM și Reynolds JV: Cachexia cancerului: mecanisme și implicații clinice. Gastroenterol Res Pract. 2011: 6014342011. Vizualizați articolulGoogle Scholar : PubMed / NCBI

27

Fujitsuka N, Asakawa A, Amitani H, Hattori T și Inui A: Eficacitatea ghrelinului în cazexia de cancer: Studii clinice și un tratament nou de către Rikkunshito. Crit Rev Oncog. 17: 277-284. 2012. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

28

Fujitsuka N și Uezono Y: Rikkunshito, un potențator de ghrelin, ameliorează sindromul anorexie-cașexie. Front Pharmacol. 5: 2712014. Vizualizați articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

29

Yae S, Takahashi F, Yae T, Yamaguchi T, Tsukada R, Koike K, Minakata K, Murakami A, Nurwidya F, Kato M și colab.: Hochuekkito (TJ-41), o formulă kampo, ameliorează cașexia indusă de colonul 26 adenocarcinom la șoareci.Comportament bazat pe evidente Alternat Med. 2012: 9769262012. Vizualizați articolul : Google Scholar

30

Choi YK, Jung KY, Woo SM, Yun YJ, Jun CY, Park JH, Shin YC, Cho SG și Ko SG: Efectul Sipjeondaebo-tang asupra anorexiei induse de cancer și a cașexiei la șoarecii purtători de tumori CT-26. Mediatorii Inflamm. 2014: 7365632014.Vizualizați articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

31

Iizuka N, Miyamoto K, Hazama S, Yoshino S, Yoshimura K, Okita K, Fukumoto T, Yamamoto S, Tangoku A și Oka M: Efectele anticachetice ale Coptidis rhizoma, o plantă antiinflamatoare, asupra celulelor canceroase esofagiene care produc interleukină 6 Cancer Lett. 158: 35-41. 2000. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

32

Camargo CA, da Silva ME, da Silva RA, Justo GZ, Gomes-Marcondes MC și Aoyama H: Inhibarea creșterii tumorii prin quercetin cu creșterea supraviețuirii și prevenirea cașexiei la șobolanii Walker 256 care poartă tumori. Biochem Biophys Res Commun. 406: 638-642. 2011. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

33

Kim HM, Kim YY, Moon HS, Lee EH, Moon SJ și An NH: Efectul inhibitor al reacției anafilactice a lui Sosiho-Tang. Immunopharmacol Immunotoxicol. 20: 567-578. 1998. Vezi articolul : Google Scholar : PubMed / NCBI

34

Lee JJ, Kim T, Cho WK și Ma JY: Activități antitrombotice și antiplachetare ale extractului Soshiho-tang. BMC Complement Altern Med. 13: 1372013. Vizualizați articolul : Google Scholar

35

Su GY, Yang JY, Wang F, Xiong ZL, Hou Y, Zhang K, Song C, Ma J, Song SJ, Teng HF și alții: Xiaochaihutang previne comportamentul depresiv la rozătoare prin îmbunătățirea sistemului serotoninergic. J Pharm Pharmacol. 66: 823-834. 2014.

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.