Tratamentul cu METMORFINA modulează efectele de risipire induse de tumori în metabolismul proteinelor musculare, minimizând cașexia la șobolanii care poartă tumori

• André G. Oliveira ¹ și
• Maria Cristina C. Gomes-Marcondes ¹  E-mail autor

BMC Cancer 2016 16 : 418

https://doi.org/10.1186/s12885-016-2424-9

 

Abstract

fundal

Starea de cancer-cașexie în mod frecvent induce atât pierderea grăsimii, cât și a proteinelor, ducând la deces. În acest fel, cunoașterea mecanismului medicamentelor și a efectelor secundare poate fi o trăsătură nouă pentru a trata și a avea succes, contribuind la o mai bună calitate a vieții pentru acești pacienți.Metformina este un medicament pe cale orală utilizat în diabetul zaharat de tip 2, prezentând un efect inhibitor asupra proliferării în unele celule neoplazice. Din acest motiv, am evaluat efectul său modulativ asupra evoluției tumorii Walker-256 și, de asemenea, asupra metabolismului proteic în mușchiul gastrocnemius și în compoziția corporală.

metode

Șobolanii Wistar au primit sau nu tratament cu implant tumoral și cu metformină și au fost distribuite în patru grupe, după cum urmează: control (C), purtător de tumori Walker 256 (W), tratat cu metformină (M) și purtător de tumori tratat cu metformin (WM) . Animalele au fost cântărite de trei ori pe săptămână, și după detectarea stării de cașexie, șobolanii au fost eutanasiatI și mușchii și tumorile excizate și analizate prin analize biochimice și moleculare.

Rezultate

Creșterea tumorilor a favorizat unele efecte dăunătoare asupra compoziției organismului chimic, creșterea cantității de apă și scăderea procentului de grăsimi și reducerea masei corporale slabe. În țesutul muscular, tumoarea a dus la o sinteză scăzută de proteine ​​și la o proteoliză crescută, prezentând activitatea mai mare a căii ubiquitin-proteazomale. Pe de altă parte, tratamentul cu metformină a minimizat starea de risipire indusă de tumori; în acest mod, acest tratament a ameliorat compoziția corpului chimic, a redus activitățile superioare ale enzimelor proteolitice și a scăzut deșeurile de proteine.

Concluzie

Tratamentul cu metformină nu numai că diminuează creșterea tumorii, ci și îmbunătățește metabolismul proteinelor în musculatura gastrocnemius la șobolanii care poartă tumori.

fundal

Cancerul este una dintre principalele cauze ale deceselor la nivel mondial [ 1 ], iar mulți pacienți cu cancer prezintă malnutriție și scădere în greutate din cauza stresului catabolic asociat tumorii, în curs de dezvoltare a stării de cancer-casexie. Casexia este un sindrom metabolic complex asociat cu alte afecțiuni care stau la baza, caracterizat prin inducerea pierderii masei corporale slabe, cu sau fără pierderea masei de grăsime [ 2 ]. În funcție de tipul de cancer, mai mult de 50% dintre pacienții cu cancer prezintă cașexie și aceasta este una dintre cele mai frecvente cauze de morbiditate și mortalitate [ 3 ]. În cazul cașexiei de cancer, calea principală responsabilă de degradarea proteinelor musculare este calea ubiquitin-proteazomală (UPP) [ 4 ] care constă dintr-un set de enzime care cuplează proteinele țintă la moleculele ubiquitin, care sunt degradate de proteazomul 26S [ 5 ]. În celulele tumorale, țintă de fosfoinozitidă 3-kinază (PI3K) -actual mamifer de rapamicină (mTOR) este întotdeauna pornit datorită mutației genelor cheie în această cale. Pe de altă parte, în celulele musculare, această cale este responsabilă în principal pentru procesul de sinteză și degradare a proteinei de control [ 6 ]. Activarea Akt de către insulină a fost legată de suprimarea activității FOXO (caseta cu căptușeală O) și a activității caspase-3 și de o scădere a expresiei liganzilor ubiquitin [ 7 ]. În acest fel, mulți pacienți cu cancer suferă de o rezistență la insulină într-o oarecare măsură, ceea ce duce, în anumite cazuri, la o degradare crescută a proteinelor prin FOXO și o activitate UPP mai mare [ 7 ].

AMP-proteina kinaza activată (AMPK) joacă un rol esențial în menținerea stării energetice celulare, acționând ca un indicator al consumului de combustibil.Acest proces ajută celulele să se ocupe de condițiile de stres energetic și să le aducă înapoi în homoeostază [ 8 ], procese de control cum ar fi sinteza proteinelor. Metformina (1,1-dimetilbiguanida) este un medicament pe cale orală utilizat pe scară largă în tratamentul diabetului zaharat de tip 2 (T2DM), fiind prescris la peste 120 de milioane de persoane din întreaga lume [ 8 ] și multe studii arată că pacienții T2DM tratați cu metformin au un nivel mai scăzut riscul apariției cancerului [ 9 , 10 ]. Mecanismul prin care acioneaza metformin nu este complet înțeles, dar se pare că este prin intermediul fosforilării și activării AMPK.Totuși, acest efect asupra activării AMPK este indirect și ar putea fi un efect inhibitor asupra complexului mitocondrial al lanțului respirator 1 [ 11-13 ].

În ciuda faptului că metformina poate scădea nivelul insulinei și proliferarea celulelor tumorale [ 14 ], puține studii analizează acțiunea metforminei asupra mușchilor scheletici în modelele de cașexie. Prin urmare, aici am presupus că metforminul ar putea scădea efectul inhibitor asupra semnalizării insulinei în țesutul muscular cauzat de creșterea tumorii.

metode

Animale și implant tumoral

Șobolani masculi Wistar cântăriți în intervalul 60-70 g (cu vârsta de 3 săptămâni) au fost obținuți de la instalația de animale CEMIB / Universitatea de Stat din Campinas și adăpostiți într-o cușcă colectivă, menținută la 22 ± 2 ° C și 12 ore cicluri lumină / întuneric. Animalele au fost lăsate la o dietă normoproteină semi-purificată (18% din sursa de proteină, conform recomandărilor AIN-93G) [ 15 ] și apă ad libitum. Celulele Walker 256 au fost obținute inițial de la Spitalul Christ (SUA) și menținute în laboratorul nostru prin pasaje intraperitoneale consecutive;1 x 106 celule tumorale viabile, în suspensie de 0,2 ml de NaCI, au fost implantate subcutanat în flanșa dreaptă, în timp ce șobolanii fără tumoare au primit 0,2 ml soluție injectabilă de NaCI 0,9% ca procedură falsă. Au fost respectate regulamentele generale UKCCCR [ 16 , 17 ], iar protocolul experimental (# 895-1) a fost aprobat de Comitetul de etică al Universității de Stat din Campinas.

Tratamentul cu metformină și procedurile experimentale

Metforminul a fost dizolvat în apă potabilă (100 mg / l), care corespundea greutății corporale de 33 mg / kg. Concentrația metforminului a fost estimată utilizând scalarea alometrică [ 18 , 19 ] din datele la om, utilizând doza inițială recomandată pentru pacienții T2DM (500 mg / zi). Animalele au fost distribuite în patru grupe: martor (C), purtător de tumori Walker 256 (W), tratat cu metformină (M) și purtător de tumori tratați cu metformină (WM). S-a măsurat greutatea tumorii așa cum s-a descris mai sus [ 20 ] și atunci când masa tumorală la animalele W a atins 10% din masa corporală, animalele au fost supuse unei perioade de repaus peste noapte (12 ore) și au fost eutanasate prin dislocare cervicală. O probă de sânge a fost colectată prin puncție cardiacă. Greutatea carcasei a fost obținută prin cântărirea animalelor fără tractul gastro-intestinal și masa tumorală. Atât mușchiul gastrocnemius, cât și țesutul tumoral au fost exprimate ca procent din greutatea carcasei.

Analiza compoziției biochimice a corpului a fost descrisă anterior [ 21 ].Eșantioanele carcaselor uscate și extrase din grăsimi au fost analizate pentru azot total spectrofotometric [ 22 ]. O altă probă a fost supusă digestiei alcaline pentru determinarea azotului de colagen [ 22 ]. Azotul fără colagen a fost calculat prin scăderea azotului de colagen din azotul total.

Concentrația proteinelor serice

Proteinele serice totale și albumina au fost cuantificate spectrofotometric [ 23 ] (Laborlab, Brazilia), iar diferența dintre conținutul total de proteine ​​serice și albumină a determinat conținutul seric de globulină.

Eșantionarea mușchiului Gastrocnemius și testele enzimatice

Imediat după eutanasie, musculatura gastrocnemius a fost disecată, înghețată în azot lichid și menținută la -80 ° C. O probă a fost apoi omogenizată în soluție salină tampon fosfat (PBS) (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HP04, 1,8 mM KH2P04), pH 7,4, 0,1% Triton X-100 și s-a utilizat supernatantul pentru concentrația proteică [ 24 ] și pentru toate testele de activitate enzimatică.Calpainul [ 25 ], catepsina B și H [ 26 ] și activitatea chimotripsinei [ 27 ] au fost analizate așa cum s-a descris anterior fără modificări.

Degradarea și sinteza proteinei musculare

Mucusul gastrocnemiusului drept a fost disecat și incubat cu 0,5 uCi / ml L- [2,3,4,5,6-3H] fenilalanină (Amersham, UK) pentru analiza de sinteză a proteinei, în timp ce mușchiul stâng a fost incubat cu cicloheximidă 0,5 mM pentru degradarea proteinei test. Fenilalanina radioactivă încorporată în mușchi și tirozină eliberată în tampon de incubare a fost analizată așa cum s-a descris [ 28 ].Cifra de proteine ​​a fost definită ca raportul dintre sinteza proteinelor și degradarea proteinelor.

imunoblotare

Imunoblottingul a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [ 20 ]. Proteinele au fost analizate cu anticorpi primari GAPDH (sc-25778), Ubiquitin (sc-6085), UBE2A / B (sc-10479) (Santa Cruz Biotechnology, USA); 20S (PW8195), 19S (PW8165), 11S (PW8185) (Enzo-Biomol, USA); AMPK (2603), fosfo-AMPKα ^Thr172 (2535), Akt (4685), fosfo-Akt ^Thr308 (4056), anti-iepure de capră (7074) (AP106P) (MerckMillipore, USA). Imaginile au fost capturate folosind Alliance 2.7 (UVItec, UK) și intensitatea benzii a fost cuantificată folosind UVIband-D (UVItec, UK).

analize statistice

Testarea non-parametrică a fost utilizată pentru compararea între două grupuri.Comparație între grupuri, am folosit ANOVA One-way urmată de post-test Bonferroni, utilizând programul GraphPad Prism versiunea 5.00 (GraphPad, SUA) și rezultatele au fost prezentate ca medie ± deviație standard (SD). Semnificația a fost definită ca p <0,05.

Rezultate

Tratamentul cu metformină atenuează efectele creșterii tumorale asupra compoziției corporale

Pentru a analiza dacă creșterea tumorii a condus la cașexie și dacă tratamentul cu metformină, la o doză terapeutică atentă utilizată la pacienții cu T2DM, a fost capabil să reducă efectul nociv al tumorii, am analizat parametrii biochimici ai compoziției corporale. După cum se poate observa în tabelul 1 , animalele W au dezvoltat cașexie. 

Deși greutatea corporală finală a scăzut în ambele grupe tumorale, greutatea grupului W a fost cu aproximativ 10% mai mică decât șobolanii C, în timp ce grupul WM nu a avut nicio diferență față de C.

Conținutul de apă în corp a crescut în ambele grupuri care purtau tumori; în mod opus, grăsimea corporală este redusă în grupurile W și WM. 

Masa moleculara masiva in grupul W a fost de aproximativ 89% din grupul C in timp ce WM a avut o valoare similara in comparatie cu C.

Comparand ambele grupuri care purtau tumori, rezultatele au aratat ca WM a avut o masa corporala scazuta de aproximativ 8% mai mare decat W.

In plus, carcasa proteina redusă în W (cu 15% mai mică) și WM (cu 12% mai puțin) în comparație cu grupul de control.

 De asemenea, azotul de colagen din carcasă a fost redus de efectele tumorale, fiind cu 35% mai mic în grupul W, în timp ce în grupul WM a scăzut în jur de 13%; acest rezultat a arătat că tratamentul cu metformină a dus la menținerea azotului de colagen în WM în comparație cu grupul W. 

Scăderea greutății gastrocnemius sa întâmplat în ambele grupuri care prezintă tumori, fiind cu 22% mai puțin în W și doar 14% în WM;

comparând ambele grupuri care poartă tumori, în WM masa musculară a fost cu 10% mai mare decât în ​​grupul W. Conținutul de proteine ​​musculare a scăzut cu aproximativ 15% în W, în timp ce grupul WM a fost similar cu C.

Greutatea tumorală nu a fost diferită între W și WM, deși greutatea relativă a tumorii a fost cu aproximativ 23% mai mică în WM comparativ cu W.

tabelul 1

Efectele creșterii tumorale asupra compoziției corporale, a greutății țesuturilor și a marcatorilor de cașexie serică

	C ( n = 12)	W ( n = 12)	M ( n = 12)	WM ( n = 12)
Greutatea inițială a corpului (g)	65,8 ± 13,4	67,1 ± 11,3	67,2 ± 14,1	67,9 ± 11,2
Greutatea corporală finală (g)	131,5 ± 14,3	119,5 ± 11,6 *	135,2 ± 14,1	123,2 ± 11,5
Apa corpului (%)	69,1 ± 1,8	73,6 ± 2,1 ***	69,1 ± 1,0	72,9 ± 2,7 ***
Grăsime corporală (%)	5,6 ± 1,9	2,9 ± 1,3 ***	6,3 ± 0,9	3,4 ± 1,6 **
Masa corporală (%)	24,0 ± 2,9	21,3 ± 3,2 *	23,5 ± 3,3	23,0 ± 3,4
Proteina carcasei (mg / g)	30,9 ± 1,8	26,4 ± 2,1 ***	30,9 ± 1,0	27,1 ± 2,7 ***
Azotul de colagen (mg / 100 g)	21,7 ± 5,6	14,2 ± 5,9 **	19,2 ± 6,7	18,8 ± 4,8 #
Azotul fără colagen (mg / 100 g)	83,5 ± 7,2	88,4 ± 6,4	87,5 ± 6,2	84,8 ± 3,7
Azot total (mg / 100 g)	105,2 ± 7,1	100,1 ± 5,7	100,7 ± 11,0	103,3 ± 5,1
Greutatea relativă a mușchilor (%)	0,62 ± 0,05	0,48 ± 0,08 ***	0,62 ± 0,05	0,53 ± 0,07 ***
Proteina musculară (μg / pl)	5,3 ± 0,2	4,5 ± 0,1 *	5,5 ± 0,3	5,0 ± 0,2 #
Tumora de greutate (g)	–	11,4 ± 3,1	–	10,1 ± 3,3
Tumora relativa in greutate (g)	–	14,1 ± 4,0	–	10,9 ± 2,8 #
Proteine ​​plasmatice totale (g / dl)	5,4 ± 0,3	4,6 ± 0,4 *	5,7 ± 0,9	5,0 ± 0,5 #
Albumin (g / dl)	3,0 ± 0,1	2,3 ± 0,2 ***	2,9 ± 0,1	2,3 ± 0,3 ***
Globulină (g / dl)	3,2 ± 0,5	2,4 ± 0,3 *	3,1 ± 0,9	2,6 ± 0,3

Legenda: C, șobolani de control; W, șobolani Walker 256 care poartă tumori; M, șobolani tratați cu metformină (33 mg / kg); WM, Walker 256 de șobolani purtători de tumori tratați cu metformină (33 mg / kg). Numărul de animale pe grup = 12. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p <0,05 vs C; ** p<0,01 vs C; *** p <0,001 față de C; # p <0,05 vs W; ## p <0,01 vs W

Proteinele serice totale au scăzut cu 15% în W comparativ cu C, în timp ce WM a avut un conținut similar cu șobolanii C și a crescut cu 11% în comparație cu W. Conținutul de albumină a scăzut cu aproximativ 23% în fiecare grup W și WM, W (cu 22% mai mic) (Tabelul 1 ).

Metforminul scade degradarea proteinei induse de tumori și ameliorează metabolismul proteinelor

Odată ce mulți parametri corporali (Tabelul 1 ) au arătat că animalele care poartă tumori au fost casectice, s-ar putea aștepta ca sinteza proteinelor să fie afectată asociată cu o degradare crescută a proteinei. Pentru a aborda această întrebare, am analizat atât sinteza proteinelor, cât și degradarea acestora. Tumoarea a condus la o scădere a sintezei proteinelor musculare gastrocnemius, fiind cu 90% mai mică în W și 60% în grupul WM comparativ cu grupul C (figura 1a ). În paralel, creșterea tumorii a determinat o creștere semnificativă a degradării proteinei în grupul W (cu 90% mai mare) și, de asemenea, în grupul WM (74%, Fig.1b ). În ciuda faptului că au avut o tumoare, tratamentul cu metformină (grupul WM) a indus o reducere mai mică a sintezei proteinelor asociată cu o degradare a proteinelor ne-modificată ( p = 0,0571). Astfel, raportul dintre sinteza proteinelor musculare și degradarea a fost redus profund în W (93% mai puțin), în timp ce în WM acest efect a fost modulat de metformin, fiind de 4 ori mai mare în WM decât în ​​grupul W ( fig.1c ).

Figura 1

Metforminul crește cantitatea de proteine ​​din mușchiul gastrocnemius al șobolanilor care suferă de tumori Walker 256. un mușchi gastrocnemius drept a fost pre-incubat timp de 30 de minute la 37 ° C, în tampon KHB. Apoi, mușchiul a fost incubat timp de 2 h la 37 ° C în KHB conținând 0,5 uCi / ml L- [2,3,4,5,6-3H] fenilalanină. Fenilalanina încorporată în proteinele musculare reprezintă rata de sinteză a proteinei. b Musculatura gastrocnemius stânga a fost preincubată timp de 30 de minute la 37 ° C în tampon KHB; apoi incubare suplimentară (2 ore la 37 ° C) în KHB conținând cicloheximid 0,5 mM; tirozina eliberată în mediu de incubare reprezintă viteza de degradare a proteinei. c Raportul dintre fenilalanina încorporată și tirozina eliberată a fost definit ca rata de rotație a proteinelor.Legenda: C, șobolani de control; W, șobolani Walker 256 care poartă tumori; M, șobolani tratați cu metformină (33 mg / kg); WM, Walker 256 de șobolani purtători de tumori tratați cu metformină (33 mg / kg). Numărul de animale pe grup = 6. Coloanele reprezintă media ± SD. * p <0,05 vs C; ** p <0,01 vs C; ## p <0,01 vs W

Proteazomul este calea principală pentru degradarea proteinelor în mușchiul gastrocnemius al animalelor care poartă tumori

Pentru a aborda care cale de degradare a proteinei a afectat masa musculară și conținutul de proteine ​​din gastrocnemius, am analizat cele trei căi majore de degradare a proteinelor. Activitățile calpainului, catepsinei B și catepsinei H au fost similare în toate grupele experimentale (figura 2a – c ). Activitatea asemănătoare cu cea a chemotripsinei a fost cu 64% mai mare în W, în timp ce în WM această activitate enzimatică a fost similară cu cea din C (figura 2d ).Comparația dintre grupurile care au prezentat tumori a arătat că tratamentul cu metformin a modulat activitatea asemănătoare cu cea a chymotrypsinei cu 38% mai puțin comparativ cu grupul care nu a fost tratat (Figura 2d ).

Fig. 2

Proteinele musculare sunt în principal degradate prin calea proteazomului la șobolanii care poartă tumora Walker 256 și metformina modulează acest lucru. Sa analizat activitatea enzimatică a trei căi diferite de degradare a proteinei: ( a ) calea dependentă de calciu, calea lizozomală ( b și c ) și calea ( d ) ubiquitin-proteazom. Metforminul modulează activitatea asemănătoare cu chymotrypsin în șobolanii Walker 256 care poartă tumori aduce valoarea aproape de C. Legendă: C, șobolani de control; W, șobolani Walker 256 care poartă tumori;M, șobolani tratați cu metformină (33 mg / kg); WM, Walker 256 de șobolani purtători de tumori tratați cu metformină (33 mg / kg). Numărul de animale pe grup = 8. Coloanele reprezintă media ± SD. * p <0,05 vs C; # p <0,05 vs W

Metforminul minimizează efectele creșterii tumorale atât în ​​căile de sinteză, cât și în cele de degradare în mușchiul gastrocnemius

Tratamentul cu metformină a influențat în mare măsură expresia proteinelor responsabile pentru coordonarea proceselor de sinteză și de degradare în mușchi.Raportul p-AMPK / AMPK a crescut de două ori în W în timp ce WM a arătat o valoare similară cu C. Comparația dintre ambele grupuri care poartă tumori a indicat faptul că efectul tratamentului cu metformină a fost remarcabil; WM a avut o expresie p-AMPK / AMPK mai mică cu 61% decât W ( fig.3a și b ). Raportul dintre p-Akt / Akt a scăzut cu aproximativ 63% în W și nu a fost afectat în WM. Pe de altă parte, activarea Akt în WM a crescut cu aproximativ 118% comparativ cu W ( fig.3a și c ).

Figura 3

Metforminul scade efectele inhibitoare asupra sintezei proteinelor din mușchiul gastrocnemius cauzată de creșterea tumorii. Două proteine ​​amonte mTOR diferite au fost analizate prin imunoblotting. o imagine reprezentativă din cel puțin patru experimente independente. b AMPK a fost activat în W, dar nu în WM, așa cum a arătat expresia p-AMPK.c Fosforilarea Akt a fost inhibată la animalele purtătoare de tumori netratate (W), în timp ce în cazul animalelor tratate cu metformină activarea a fost similară cu grupurile martor.Graficele ( b ) și ( c ) reprezintă benzi cuantificate și normalizate prin expresia GAPDH.Valorile sunt procentuale relative ale grupului C, denumite 100%. Legenda: C, șobolani de control; W, șobolani Walker 256 care poartă tumori; M, șobolani tratați cu metformină (33 mg / kg); WM, Walker 256 de șobolani purtători de tumori tratați cu metformină (33 mg / kg). Coloanele reprezintă media ± SD. ** p <0,01 vs C; *** p <0,001 față de C; # p <0,05 vs W;### p <0,001 vs W

Ambele subunități de proteazom 20S (32 și 28 KDa) au crescut în W, dar nu în WM (Figurile 4a , b și c ). Subunitatea de 32 kDa a crescut cu aproximativ 52% în W, în timp ce în WM nu a avut nici o schimbare în comparație cu C. În comparație cu W, expresia subunității de 32 kDa a redus în jur de 36% în WM ( fig.4a și b ).Subunitatea de 28 kDa a crescut cu 20% în W și nu a avut nici o schimbare în WM.Comparând ambele grupuri purtătoare de tumori, expresia subunității de 28 kDa a scăzut cu aproximativ 22% în WM (Figurile 4a și c ). Expresia subunității 19S a crescut cu 57% doar în grupul W, în timp ce WM a avut o valoare similară față de C ( fig.4a și d ). Expresia de subunitate 11S a crescut cu aproximativ 31% în W, dar nu a avut nici o schimbare în WM (Figurile 4a și e ). Expresia UBE2A / B a crescut cu aproximativ 90% în W comparativ cu C, în timp ce grupul WM nu a avut nici o schimbare ( fig.4a și f ). Expresia ubiquitinei nu a fost afectată nici de tratamentul cu tumori sau cu metformină ( fig.4a și g ).

Figura 4

Expresia proteinelor de cale ubiquitin-proteazom este crescută la șobolanii care poartă tumora Walker 256, iar metformina este capabilă să restabilească niveluri similare cu grupul C. o imagine reprezentativă din cel puțin patru experimente independente.Exprimarea subunității proteazom 20S, a subunității de 32 KDa ( b ) și a subunității 28 kDa ( c ) a fost analizată prin imunoblotting. Subunitățile proteasomice 19S ( d ) și 11S ( e ) de asemenea au fost analizate prin imunoblotare, de asemenea, enzima E2 ( f ) de conjugare cu ubiquitină și ubiquitin ( g ). Graficele de la ( b ) la ( g ) reprezintă benzi cuantificate și normalizate prin expresia GAPDH. Valorile sunt exprimate ca procent relativ din grupul C, denumit 100%. Legenda: C, șobolani de control; W, șobolani Walker 256 care poartă tumori;M, șobolani tratați cu metformină (33 mg / kg); WM, Walker 256 de șobolani purtători de tumori tratați cu metformină (33 mg / kg). Coloanele reprezintă media ± SD. * p <0,05 vs C; # p <0,05 vs W

Discuţie

Casexia este o caracteristică comună a multor tipuri de cancer, fiind responsabilă de un prognostic mai rău la pacienții cu diferite tipuri de cancer [ 29] și este caracterizat ca o pierdere involuntară în greutate, reducerea greutății corporale și, în principal, masa corporală slabă [ 2 ]. Am verificat faptul că metforminul, la o concentrație similară cu cea prescrisă pacienților cu T2DM, a reușit să minimizeze pierderea masei corporale slabe și conținutul de proteine a fost ​​conservat în musculatura gastrocnemius. Multe studii au arătat că metforminul poate reduce proliferarea celulelor în diferite tipuri de celule tumorale [ 30 , 31 ], iar rezultatele prezentate aici nu se datorează exclusiv unei mase tumorale reduse la animalele tratate cu metformină.

Unele tumori eliberează factori care pot schimba metabolismul gazdei și pot induce scăderea în greutate, în principal masa corporală slabă [ 32 ]. Pe lângă deșeurile de masa corporală slabă, animalele purtătoare de tumori au prezentat, de asemenea, o modificare semnificativă a altor parametri care indică stabilirea stării casectice, cum ar fi masa de grăsime, conținutul de apă și concentrația albuminei serice. Tratamentul cu metformină a fost capabil să amelioreze unele dintre aceste efecte, posibil să nu diminueze niciun factor eliberat de tumoare, dar să diminueze impactul acestor factori asupra celulelor gazdă.

Celulele tumorale au o rată de metabolizare crescută în comparație cu celulele non-tumorale, probabil datorită activității celulare proliferative, care depinde de o bună furnizare a nutrienților mobilizați din țesuturile gazdă. Datorită acestui fapt, reprogramarea tumorilor metabolice a fost descrisă ca un semn distinctiv pentru cancer [ 33 ], iar posibilitatea de a explora aceste modificări utilizând tratamentul cu metformină pare a fi o excelentă oportunitate terapeutică.Generarea ATP prin glicoliză aerobă, care a fost descrisă ca efect Warburg [ 34 ], este un mod eficient prin care celulele tumorale pot obține energie. Pe de altă parte, aceste celule necesită, de asemenea, o sursă de carbon și azot furnizate din alte surse, cum ar fi ciclul acidului tricarboxilic (TCA) [ 35 ], în timp ce, paralel cu sursa de energie pentru celulele tumorale, lanțul respirator este încă necesar pentru a furniza căi biosintetice cu molecule precursoare cum ar fi lactat și alanină. Energia necesară pentru aceste activități ale celulelor neoplazice provine în principal din glicoliza aerobă, rata crescută a precursorilor biosintetici și menținerea stării redox sunt cele mai importante nevoi ale celulelor foarte proliferative [ 36 ]. 

Am arătat în lucrarea noastră anterioară că animalele purtătoare de tumori Walker 256 au o producție crescută de lactat, în timp ce animalele purtătoare de tumori tratate cu metformină au avut o reducere a concentrației serice a lactatului [ 20 ]. Lactatul produs de metabolismul tumoral este transportat în ficat și apoi transformat înapoi în glucoză prin gluconeogeneză, consumând trei molecule ATP pentru a genera glucoză pentru fiecare moleculă de lactat. În același mod, când apare proteoliza musculară, alanina generată este transportată prin fluxul sanguin către ficat, unde este transformată în glucoză. Această reacție, cunoscută sub numele de Cori Ciclu, ar putea reprezenta o pierdere suplimentară de energie la pacienții cu cancer, fiind de cel puțin 300 Kcal / zi [ 37 ].

Animalele care poartă tumora Walker 256 au o secreție redusă de insulină [ 38 ].Un raport scăzut de insulină-glucagon indică o stare asemănătoare foamei și, din acest motiv, celulele sau țesuturile gazdă nu sunt capabile să prevină degradarea proteinelor, existând o pierdere de masă corporală slabă. Am demonstrat că creșterea tumorii a condus la o scădere a sintezei proteinelor și la o degradare crescută a proteinei, reducând greutatea relativă a gastrocnemiei asociată cu o concentrație scăzută de proteine ​​musculare, precum și masa corporală slabă.Pierderea netă a proteinei din mușchiul gastrocnemius este probabil datorată unei activări scăzute a Akt și unei activări crescute a AMPK. Akt este fosforilat și activat într-o cale declanșată de insulină, care controlează procese cum ar fi creșterea celulelor, metabolismul, proliferarea, absorbția glucozei, supraviețuirea și angiogeneza [ 39 ]. Insulina circulantă redusă înseamnă o reducere a activării Akt, conducând la inhibarea mTORC1; în timp ce fosforilarea prin Akt, mTORC1 este activată, conducând la procesul de sinteză a proteinelor [ 40 ]. În schimb, AMPK este activat când raportul AMP: ATP este ridicat și inhibă mTOR, împiedicând astfel cheltuieli suplimentare de energie. Creșterea tumorii promovează o masă slabă în combinație într-o manieră pentru a obține substraturi care să mențină creșterea și să susțină cerințele metabolice ridicate ale celulelor tumorale. În acest sens, tratamentul cu metformină a fost eficient în reducerea depleției proteinelor în musculatura gastrocnemius.

Am demonstrat că căile de degradare citosolică, inclusiv calpaina și catepsina, nu au fost activate în mușchiul animalelor purtătoare de tumori Walker 256, dar UPP este calea principală prin care proteina musculară a fost degradată la aceste animale. UPP se ocupă de degradarea proteinelor musculare atât la omul [ 41 ], cât și la șoarecele [ 42 ] care are o tumoare. În lucrarea noastră anterioară, sa demonstrat că tumora Walker 256 eliberează un factor cachectic similar cu factorul de inducere a proteolizei (PIF) [ 43 ] și acest factor a fost capabil să inducă degradarea proteinelor și să inhibe sinteza proteinelor în culturile miotubelor [ 43 ]. Deși expresia PIF-like nu a fost analizată în această lucrare, probabil metforminul a condus la un efect modulator minimizând efectele nocive asupra țesutului gastrocnemius. PIF induce celulelor musculare să sporească expresia proteinelor UPP și, prin urmare, creșterea degradării proteinelor. O analiză recentă a evidențiat importanța ligazelor ubiquitin în procesul de degradare a proteinei și modul în care activarea Akt stimulată de insulină a fost capabilă să o moduleze [ 7 ]. În activitatea noastră, am demonstrat că tratamentul cu metformină la animalele care poartă tumori a reușit să mențină nivelurile de proteine ​​UPP similare cu grupul martor și, prin urmare, reducerea efectelor tumorale în mușchii scheletici. Este posibil ca metforminul să mențină nivelul insulinei aproape de valorile grupului de control; în descoperirile noastre anterioare, am verificat menținerea conținutului de insulină la șobolanii care sufereau de tumori tratați cu o doză mai mare de metformină. În acest mod, insulina activează Akt și, prin urmare, fosforilează FoxO3a păstrându-l în citozol, inhibând să acționeze ca un factor de transcripție pentru ubiquitin-ligaze.

În ansamblu, tratamentul cu metformină a fost capabil să diminueze creșterea tumorii (ca raportul tumorii / greutatea corporală) și, de asemenea, capabil să diminueze efectele dăunătoare ale tumorii asupra metabolismului proteinelor în mușchiul scheletic. După cum s-a menționat anterior, tratamentul cu metformin este, de asemenea, cunoscut că inhibă complexul mitocondrial I și, prin urmare, poate fi implicat în scăderea intermediarilor TCA [ 44 ]. În acest scenariu, ca un mecanism probabil de acțiune, metformina poate fi o taxă pentru tratamentul cancerului prin scăderea fluxului de molecule către căile biosintetice și generarea de specii reactive de oxigen (ROS) asupra celulelor tumorale. Cu toate acestea, ROS acționează ca o sabie cu două tăișuri în progresia cancerului; în anumite limite, poate acționa ca agent de stimulare a creșterii, dar în acest caz sub tratament cu metformină, poate a existat o acțiune directă la moartea celulelor [ 45 ]. Aceasta demonstrează complexitatea utilizării metodei metabolice împotriva creșterii tumorii datorită plasticității ridicate și eterogenității sale [ 46 ].

În ciuda faptului că mecanismul de acțiune al metforminei nu este complet înțeles, utilizarea acestuia pe modele de animale de laborator a demonstrat efecte antineoplazice remarcabile [ 47 ]. Cu toate acestea, sunt necesare alte date moleculare pentru a clarifica această întrebare, sporind șansa utilizării metforminei ca medicament terapeutic, deoarece dovezile că metforminul poate fi utilizat ca adjuvant în tratamentul cancerului sunt încă incipiente și aplicabilitatea acestuia trebuie confirmată în studii clinice.

Concluzie

Luând toate datele împreună, concluzionăm că starea cachectică dezvoltată de efectele tumorale, care afectează în principal țesutul muscular, ca o consecință a activității mai mari a căii ubiquitin-proteazomale, poate fi redusă la minim în tratamentul cu metformină, deoarece acest tratament ameliorează compoziția chimică a corpului, calea ubiquitin-proteazom, care a redus deșeurile de proteine.În concluzie, metformina rămâne un instrument promițător în studiile privind cancerul și cum ar putea atenua cașexia în cazul animalelor care poartă tumori este un subiect de cercetare ulterioară.

declaraţii

Recunoasteri

Carbohidrații și dextrina au fost donați cu generozitate de Ingredion Products (Sao Paulo, Brazilia), iar L-leucina și L-cisteina au fost donați cu amabilitate de către Ajinomoto Brazil (Sao Paulo, Brazilia).

Această activitate a fost susținută de un grant de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, # 2010 / 00209-9; # 2013 / 16115-1, # 2014 / 13334-7 și Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, # 304604 / 2010-0, # 302863 / 2013-3. AGO este un coleg de cercetare susținut de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, Grant # 2008 / 07737-0, São Paulo, Brazilia.

Disponibilitatea datelor și a materialelor

Articolul detaliind în cazul în care datele care susțin rezultatele pot fi partajate după publicarea manuscrisului și pot fi găsite în https://osf.io/s269w/ .

Contribuțiile autorilor

AGO a realizat proiectarea experimentală și toate procedurile experimentale in vivo, a efectuat toate testele biochimice / enzimatice și moleculare și a contribuit la interpretarea și discutarea rezultatelor și la prepararea manuscrisului. MCCGM a fost responsabilă pentru proiectarea, interpretarea și discutarea experimentală a rezultatelor, precum și pentru pregătirea și revizuirea finală a manuscrisului.Ambii autori au citit și au aprobat manuscrisul final.

Concurenți interesați

Andre Gustavo de Oliveira și Maria Cristina Cintra Gomes-Marcondes declară că nu au interese concurente.

Consimțământ pentru publicare

Nu se aplică.

Aprobarea eticii și consimțământul de a participa

Acest studiu a angajat animale și au fost respectate liniile directoare generale ale UKCCCR privind bunăstarea animalelor, iar protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru etică în cercetarea pe animale (CEEA / IB / UNICAMP, protocol nr. 895-1).

Acces liber Acest articol este distribuit în termenii Creative Commons Attribution 4.0 International License ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții în orice mediu, cu condiția să dați un credit adecvat autorului original (originale) și sursei, să furnizeze o legătură cu licența Creative Commons și să indice dacă au fost făcute schimbări. Declarația de renunțare la Dedicarea domeniului public Creative Commons ( http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ ) se aplică datelor furnizate în acest articol, dacă nu se specifică altfel.

Referințe

1. Organizația Mondială a Sănătății – Agenția Internațională pentru Cercetarea Cancerului [Internet]. 2014 [citată în 2015 19 iunie 19]. Disponibil de la: http://www.who.int/gho/database/en/ . Accesat la 19 iunie 2015.
2. Evans WJ, Morley JE, Argilés J, Bales C, Baracos V, Guttridge D, și colab. Cachexia: o nouă definiție. Clin Nutr. 2008; 27: 793-9.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
3. Choudry HA, Pan M, Karinch AM, Souba WW. Suport alimentar îmbogățit cu aminoacizi cu catenă ramificată la pacienții cu afecțiuni chirurgicale și de cancer. J Nutr. 2006; 136: 314S-8.PublGoogle Scholar
4. Lecker SH, Solomon V, Mitch WE, Goldberg AL. Distrugerea proteinei musculare și rolul critic al căii ubiquitin-proteazom în stările normale și de boală. J Nutr. 1999; 129: 227S-37.PublGoogle Scholar
5. Lecker SH, Goldberg AL, Mitch WE. Degradarea proteinei prin calea ubiquitin-proteazom în stări normale și de boală. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 1807-1819.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
6. Schiaffino S, Mammucari C. Reglarea creșterii mușchilor scheletici prin calea IGF1-Akt / PKB: intuiții din modelele genetice. Skelet Muscle. 2011; 1: 4.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
7. Onoruri MA, Kinzig KP. Rolul rezistenței la insulină în dezvoltarea pierderii musculare în timpul cazusei de cancer. J Cachex Sarcopenie Muscle. 2012; 3: 5-11.Vizualizați articolulGoogle Scholar
8. Viollet B, Guigas B, Sanz Garcia N, Leclerc J, Foretz M, Andreelli F. Metodele celulare și moleculare ale metforminei: o prezentare generală. Clinica științifică (Londra). 2012; 122: 253-70.Vizualizați articolulGoogle Scholar
9. Decensi A, Puntoni M, Goodwin P, Cazzaniga M, Gennari A, Bonanni B, și colab. Metformina și riscul de cancer la pacienții diabetici: o revizuire sistematică și o meta-analiză. Cancer Prev Res (Phila). 2010; 3: 1451-1461.Vizualizați articolulGoogle Scholar
10. Libby G, Donnelly LA, Donnan PT, Alessi DR, Morris AD, Evans JMM. Utilizatorii noi de metformină au un risc scăzut de cancer de incidență: un studiu de cohortă în rândul persoanelor cu diabet zaharat de tip 2. Îngrijirea diabetului. 2009; 32: 1620-5.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
11. El-Mir MY, Nogueira V, Fontaine E, Avereret N, Rigoulet M, Leverve X. Dimethylbiguanida inhibă respirația celulară printr-un efect indirect vizat asupra complexului de lanț respirator I. J Biol Chem. 2000; 275: 223-8.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
12. Owen MR, Doran E, Halestrap AP. Dovezile că metforminul își exercită efectele antidiabetice prin inhibarea complexului 1 al lanțului respirator mitocondrial. Biochem J. 2000; 348 (Pt3): 607-14.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
13. Brunmair B, Staniek K, Gras F, Scharf N, Althaym A, Clara R și colab. Tiazolidindionele, cum ar fi metformina, inhibă complexul respirator I: un mecanism comun care contribuie la acțiunile lor antidiabetice? Diabet. 2004; 53: 1052-9.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
14. Ben Sahra I, Le Marchand-Brustel Y, Tanti JF, Bost F. Metformin în tratamentul cancerului: o nouă perspectivă pentru un medicament antidiabetic vechi? Mol Cancer Ther. 2010; 9: 1092-9.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
15. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey Jr GC. AIN-93 diete purificate pentru rozătoarele de laborator: raport final al Comitetului ad-hoc al American Institute of Nutrition privind reformularea dieta AIN-76A pentru rozătoare. J Nutr. 1993; 123: 1939-1951.PublGoogle Scholar
16. Vale C, Stewart L, Tierney J. Cancer UKCC pentru CRNR din. Tendinte in testele de cancer din Regatul Unit: rezultate de la Comitetul de Coordonare din Regatul Unit pentru Cancer Research National Registru de studii clinice de Cancer. Br J Cancer. 2005; 92: 811-4.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
17. Workman P, Aboagye EO, Balkwill F, Balmain A, Bruder G, Chaplin DJ, și colab. Linii directoare pentru bunăstarea și utilizarea animalelor în cercetarea cancerului. Br J Cancer.2010; 102: 1555-1577.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
18. Mahmood I. Aplicarea principiilor alometrice pentru predicția farmacocineticii în dezvoltarea medicamentului uman și veterinar. Adv Drug Deliv Rev. 2007; 59: 1177-92.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
19. Caldwell GW, Masucci JA, Yan Z, Hageman W. Scalarea alometrică a parametrilor farmacocinetici în descoperirea de medicamente: pot fi prezenți oameni CL, Vss și t1 / 2 din datele șobolanilor in vivo? Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 2004; 29: 133-43.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
20. Oliveira AG, MCC Gomes-Marcondes. Metforminul îmbunătățește metabolismul carbohidraților și micșorează creșterea tumorilor Walker la șobolanii tineri. Biochem Pharmacol. 2014; 3: 125. doi: 10.4172 / 2167-0501.1000125 .
21. Ventrucci G, Mello MAR, MCC Gomes-Marcondes. Efectul unei dietă suplimentată cu leucină asupra modificărilor compoziției corporale la șobolanii gravidă care poartă tumora Walker 256. Braz J Med Biol Res. 2001; 34: 333-8.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
22. Albanese AA, LAO În: Albanese AA, redactor. Metode noi de biochimie nutrițională: cu aplicații și interpretări. New York: Academid Press; 1963.Google Scholar
23. Doumas BT, Watson WA, Biggs HG. Standardele albuminei și măsurarea albuminei serice cu bromcresol verde. Clin Chim Acta. 1971; 31: 87-96.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
24. Bradford MM. O metodă rapidă și sensibilă pentru cuantificarea cantităților de micrograme de proteine ​​utilizând principiul de legare a colorantului de proteine. Anal Biochem. 1976; 72: 248-54.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
25. Jiang ST, Wang JH, Chang T, Chen CS. O metodă continuă de măsurare a activității calpainului.Anal Biochem. 1997; 244: 233-8.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
26. Barrett AJ. Analiza fluorometrică pentru catepsina B și catepsina H cu substraturi de metilcoumaramidă. Biochem J. 1980; 187: 909-12.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
27. Orgi E, Tanaka K, Tamura T, Sone S, Ogura T, Ichihara A. Asocierea reversibilă dependentă de proteazomi ATP cu multiple componente proteice pentru a forma complexe 26S care degradează proteine ​​ubiquitinate în celulele HL-60 umane. FEBS Lett. 1991; 284: 206-10.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
28. Fedele MJ, Vary TC, Farrell PA. Contribuție selectată: Anticorpul IGF-I previne creșterea sintezei proteinelor în mușchii epitrochlearis de la șobolani diabetici, cu șobolani diabetici. J Appl Physiol. 2001; 90: 1166-1173. discuție 1165.PubMedGoogle Scholar
29. Tisdale MJ. Cachexia la pacienții cu cancer. Nat Rev Cancer. 2002; 2: 862-71.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
30. Queiroz EAIF, Puukila S, Eichler R, Sampaio SC, Forsyth HL, Lees SJ și colab. Metformin induce apoptoza și stoparea ciclului celular mediată de stresul oxidativ, AMPK și FOXO3a în celulele cancerului de sân MCF-7. Plus unu. 2014; 9: e98207.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
31. Rocha GZ, Dias MM, Ropelle ER, Osório-Costa F, FA Rossato, Vercesi AE și colab. Metforminul amplifică activarea AMPK indusă de chimioterapie și creșterea antitumorală. Clin Cancer Res.2011; 17: 3993-4005.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
32. Todorov P, Cariuk P, McDevitt T, Coles B, Fearon K, Tisdale M. Caracterizarea unui factor cachectic al cancerului. Natură. 1996; 379: 739-42.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
33. Hanahan D, Weinberg RA. Etichete de cancer: următoarea generație. Cell. 2011; 144: 646-74.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
34. Warburg O. Despre insuficiența respiratorie în celulele canceroase. Știință (New York, NY).1956; 124: 269-70.Google Scholar
35. Dang CV. Regândirea efectului Warburg cu metabolizarea micromanagerilor de glutamină Myc. Cancer Res. 2010; 70: 859-62.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
36. Cairns RA, Harris IS, Mak TW. Reglarea metabolismului celulelor canceroase. Nat Rev Cancer.2011; 11: 85-95.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
37. Eden E, Edström S, Bennegård K, Scherstén T, Lundholm K. Fluxul de glucoză în ceea ce privește cheltuielile cu energia la pacienții subnutriți cu și fără cancer în timpul perioadelor de post și hrănire. Cancer Res. 1984; 44: 1718-1724.PublGoogle Scholar
38. Fernandes LC, Machado UF, Nogueira CR, Carpinelli AR, Curi R. Secreția insulinei în cașexia tumorii Walker 256. Am J Phys. 1990; 258: E1033-6.Google Scholar
39. Manning BD, Cantley LC. Semnalizare AKT / PKB: navigare în aval. Cell. 2007; 129: 1261-1274.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
40. Laplante M, Sabatini DM. mTOR semnalizare în controlul creșterii și a bolii. Cell. 2012; 149: 274-93.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
41. Khal J, Hine AV, Fearon KC, Dejong CH, Tisdale MJ. Creșterea expresiei subunităților de proteazom în mușchii scheletici ai pacienților cu cancer cu pierdere în greutate. Int J Biochem Cell Biol. 2005; 37: 2196-206.Vizualizați articolulGoogle ScholarPubMed
42. Lorite MJ, Thompson MG, Drake JL, Carling G, Tisdale MJ. Mecanismul de degradare a proteinelor musculare indus de un factor de cachectică a cancerului. Br J Cancer. 1998; 78: 850-6.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
43. Yano CL, Ventrucci G, Field WN, Tisdale MJ, Gomes-Marcondes MCC. Schimbări metabolice și morfologice induse de factorul de inducere a proteolizei de la șobolani purtători de tumori Walker în miotubele C2C12. BMC Cancer. 2008; 8: 24.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
44. Janzer A, NJ germană, Gonzalez-Herrera KN, Asara JM, Haigis MC, Struhl K. Metformin și ciclul acidului tricarboxilic de fenformină epuizată și intermediarii glicolitici în timpul transformării celulelor și NTP în celule stem canceroase. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2014; 111: 10574-9.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
45. Hammoudi N, Ahmed KBR, Garcia-Prieto C, Huang P. Alterarea metabolică a celulelor canceroase și implicațiile terapeutice. Chin J Cancer. 2011; 30: 508-25.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar
46. Phan LM, Yeung S-CJ, Lee MH. Reprogramarea metabolică a cancerului: importanța, trăsăturile principale și potențialele pentru terapiile precise împotriva cancerului vizate.Cancer Biol Med. 2014; 11: 1-19.PubMedPubMed CentralGoogle Scholar
47. Pollak M. Aplicații potențiale pentru biguanide în oncologie. J Clin Invest. 2013; 123: 3693-700.Vizualizați articolulPubMedPubMed CentralGoogle Scholar