Abstract
Mecanismul prin care cancerul mediază atrofia musculară a fost delimitat în ultimele 3 decenii și include un rol proeminent al citokinelor derivate din tumori, cum ar fi IL-6, TNFa și IL-1. Aceste citokine interacționează cu receptorii lor concomitenți pe mușchi pentru a activa factorul de transcripție în aval NF-kB și pentru a induce proteoliza sarcomerului. Experimental, inhibarea semnalizării NF-κB previne în mare parte pierderea musculară indusă de cancer, indicând rolul său proeminent în atrofia musculară.Resveratrolul, un fitoalexin natural găsit în pielea strugurilor, sa dovedit recent că inhibă NF-κB în celulele canceroase, ceea ce ne-a determinat să presupunem că ar putea avea un rol protector în casexia cancerului.Prin urmare, am investigat dacă resveratrolul adminsitrat pe cale orala zilnic ar putea proteja împotriva pierderii mușchilor scheletici și a atrofiei cardiace într-un model de șoarece stabilit. Se demonstrează că resveratrolul inhibă atrofia mușchilor scheletici și cardiacă indusă de tumorile adenocarcinom C26 prin inhibarea activității NF-kB (p65) în mușchiul scheletic și inima . Aceste studii demonstrează pentru prima dată utilitatea terapiei cu resveratrol oral pentru a oferi beneficii clinice în atrofia indusă de cancer prin inhibarea NF-kB în mușchi. Aceste descoperiri pot fi aplicate în tratamentul bolilor cu patofiziologie paralelă, cum ar fi distrofia musculară și insuficiența cardiacă.
Introducere
Casexia de cancer este un sindrom de risipire care afectează până la 80% dintre pacienții cu cancer cu boală avansată 1 – 3 . În timp ce cașexia cancerului este estimată a fi cauza morții la mai mult de 20% din toți pacienții cu cancer, morbiditatea și prăbușirea calității vieții afectează aproape toți pacienții 2 , 4 , 5 .Din punct de vedere clinic, manifestările de cașexie a cancerului sunt bine stabilite și includ pierderea masei musculare scheletice și a țesutului adipos, anorexie, astenie și anemie, cu modificări considerabile ale metabolismului lipidic, carbohidrat și proteic 2 , 5 , 6 . Pacienții rămân într-o stare hipermetabolică pe măsură ce sarcina tumorală crește, datorită producției tumorale a citokinelor pro-inflamatorii catabolice 5
Casexia de cancer este o tulburare metabolică complexă care diminuează masa corporală slabă ca răspuns la creșterea citokinelor inflamatorii eliberate de tumori, incluzând TNFa, IL1 și IL-6 7 , 8 . Aceste citokine derivate din tumori interacționează cu receptorii lor pe mușchi striat pentru a activa factorul de transcripție NF-κB pentru a spori atrofia musculară prin creșterea degradării sarcomerelor 9-12 .Degradarea și proteoliza accelerată a proteinei din aparatul contractil este mediată de sistemul proteazomic ubiquitin, incluzând ligazele ubiquitin specifice în mușchi, cum ar fi inelul muscular deget-1 (MuRF1) 7 ,13 . Inflamația citokinică activată de NF-kB este centrală în atrofia musculară găsită într-o serie de boli, incluzând distrofia musculară, insuficiența cardiacă, sepsisul și cancerul 14-16 . Inhibarea farmacologică și genetică a NF-kB previne pierderea musculară dependentă de ubiquitină 10 , 17 și poate conduce la reținerea masei musculare, a forței și poate favoriza regenerarea musculară 18-20 . În consecință, inhibarea activității NF-kB are un potențial enorm pentru prevenirea și tratamentul atrofiei musculare.
Resveratrolul, un fitoalexin natural găsit în pielea strugurilor, s-a dovedit recent că are efecte benefice asupra unei varietăți de procese ale bolii, incluzând carcinomul hepatocelular 21 și boala neurodegenerativă22. Activitatea resveratrolului în aceste boli a fost datorată, în parte, capacității sale de a inhiba translocarea și acumularea nucleară a NF-kB. Aceasta face acest lucru prin inhibarea primară a kinazei IkB (IKK), a cărei activare este necesară pentru activitatea NF-kB. În studiul de față, testăm ipoteza că tratamentul cu resveratrol inhibă cașexia indusă de cancer prin inhibarea NF-kB pentru a proteja împotriva atrofiei cardiace induse de cancer in vivo .
Materiale si metode
Linii de celule
Celulele adenocarcinom C-26 transplantabile s-au menținut așa cum s-a descris anterior 23 , 24
Animale și implantarea tumorilor
96 de șoareci CD2F1 de sex feminin, în vârstă de 45 până la 70 de zile (greutate de 19 până la 22 de grame), au fost obținute de la Charles River Laboratories (Wilmington, MA) și divizate aleatoriu în patru grupe: 1) șoareci martor, 2) șoareci martor tratați cu resveratrol 100 mg / kg, 200 mg / kg sau 500 mg / kg), 3) șoareci purtători de tumori și 4) șoareci purtători de tumori tratați cu resveratrol (100 mg / kg, 200 mg / kg sau 500 mg / kg ). În ziua 0, șoarecii selectați să meargă în grupurile care poartă tumori au fost injectați subcutanat în flancul drept cu 150 pL (aproximativ 750.000 de celule) de celule adenocarcinom C-26.
Tratamentul cu resveratrol
Trans-resveratrolul (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, catalogul # 70675) a fost solubilizat în 1,5% metilceluloză / 0,2% Tween-20 cu agitare viguroasă. Începând din ziua 6, șoarecii au primit tratament oral pe cale orală unică, administrat intragastric, utilizând un ac de 20 g gavage. Șoarecii tratați cu resveratrol au primit tratamentul zilnic cu o singură gavaj de 100 mg / kg, 200 mg / kg sau 500 mg / kg resveratrol, în timp ce martorii au primit un tratament comparabil de 250 μl de vehicul în monoterapie.
Analiza compoziției corpului
Înainte de injectarea tumorală, toate animalele au fost supuse analizei compoziției corporale utilizând ecografice RMN echo-resonanță cantitativă (QMR) (EchoMRI-100, Echo Medical Systems, Houston TX).
Ecocardiografia
Ecocardiografia a fost efectuată pe șoareci conștienți utilizând un sistem de biosimicroscopie cu ultrasunete Visual Sonics Vevo 770, așa cum a fost descris anterior de laboratorul nostru 25 .
Determinarea totală a izolației ARN / determinarea PCR în timp real a expresiei mRNA
ARN-ul total a fost izolat din țesutul înghețat rapid folosind Trizol (Sigma Chemical, St. Louis, MO), cADN realizat utilizând kitul de arhivare cu capacitate mare (Applied Biosystems) de mare capacitate. RT-PCR semi-cantitativ a fost realizat folosind reactivi MJ Research Inc. Thermo Cycler (Waltham, MA) și New England Biolab (Ipswich, MA) folosind primerii detaliați în date suplimentare .
Analiza activității NF-kB
Extractele nucleare au fost izolate din inimă și mușchiul gastrocnemius imediat după recoltare și activitatea NF-kB determinată conform protocolului producătorului (Cayman Chemical, Ann Arbor MI).
Materialele și metodele suplimentare pot fi găsite în secțiunea de date suplimentare .
Rezultate
Resveratrolul nu a evidențiat nici o toxicitate indusă la nivelurile utilizate în acest studiu
Studiile farmacologice care detaliază metabolizarea resveratrolului atât la animale cât și la om au fost efectuate și toate indică absorbția rapidă, distribuția, metabolismul și excreția resveratrolului 26 , 27 . După administrarea orală, distribuția largă a țesuturilor la șobolani a fost observată după 24 de ore și scade semnificativ după 72 de ore. Studiile toxicologice au fost de asemenea completate cu toleranță la doze de până la 700 mg / kg la șobolani 28 fără efecte toxice și la mai multe studii clinice de fază I sunt în curs de administrare la doze orale de până la 100 mg / kg și zi la om 26 , 28 . Prin urmare, am administrat resveratrol pe cale orală la 100-500 mg / kg / zi în studiul de față. Am monitorizat toxicitatea prin histologie și letalitate pe tot parcursul studiului. Nu s-au observat evenimente care să cuprindă administrarea de droguri, incluzând orice toxicitate sau letalitate evidentă cauzată de gavajul oral zilnic de resveratrol 100-500 mg / kg și zi. În plus, nu am observat nicio hepatotoxicitate sau nefrotoxicitate indusă de medicamente în toate dozele de administrare a resveratrolului, așa cum a fost confirmată de un patolog independent, orbit, pe examinarea histologică ( Figura 1 ).
Resveratrolul protejează împotriva pierderii de greutate indusă de adenocarcinom C26 la șoareci
Am testat capacitatea resveratrolului de a preveni atrofia indusă de cancerul scheletului și a mușchilor cardiace în modelul soarecilor cu adenocarcinom C26 29 descris anterior de laboratorul nostru 24 . Celulele adenocarcinom C26 cultivate au fost injectate în flancul din spate unde se dezvoltă într-o tumoare și induc pierderea musculară la șoareci CD2F1 în decurs de 2 săptămâni. În studiul prezent, tumorile au fost palpabile în ziua 6 după inoculare la șoarecii de subset care purtau tumori. În ziua 17, la finalizarea studiului, nu au existat diferențe semnificative în greutatea tumorii în rândul tuturor șoarecilor purtători de tumori ( Figura 1A ). purtători de Tumori țesut au avut o pierdere medie în greutate de 8,8 ± 1,7% față de greutățile lor inițiale, în timp ce șoarecii de control au câștigat 2,1 ± 1,8% în perioada experimentală ( Figura 1B ), în ciuda tuturor grupurilor care au un consum echivalent de hrană ( Figura 1C ).
În contrast, șoarecii provocați cu tumori și tratați cu 200 mg / kg de resveratrol au avut greutate similară cu grupul martor. Șoarecii tratați cu 500 mg / kg și provocați cu tumora și-au menținut greutatea în comparație cu șoarecii purtători de tumori ( Figura 1B ).
Șoarecii cu tumori tratați cu 100 mg / kg de resveratrol nu au fost protejați împotriva cașexiei induse de tumori, pierzând 4,6 ± 2,9% din greutatea corporală față de valoarea inițială.
Aceste constatări demonstrează că resveratrolul în doze> / = 200 mg / kg protejează împotriva pierderii de greutate induse de tumori la acest model de șoarece.
Greutatea tumorală finală și consumul mediu de alimente
(A) Nu au existat diferențe semnificative în greutatea tumorilor în grupurile care poartă tumori la toate greutățile tumorale și în subgrupul de tumori mai mari de 0,56 g la momentul recoltării utilizând testele t neparate. ( B) S-au observat schimbări semnificative în scăderea în greutate a carcasei la șoarecii purtători de tumori netratate comparativ cu șoarecii martor, șoarecii martor care au primit resveratrol la toate dozele și șoarecii purtători de tumori care au primit resveratrol la dozele de 200 mg / kg și 500 mg / kg. Greutatea carcasei a fost determinată prin scăderea greutății tumorii față de greutatea corporală. Greutatea totală a carcaselor a fost analizată și reprezentată de variația procentuală față de valoarea inițială în rândul tuturor grupurilor.
De asemenea, nu s-au observat diferențe semnificative în consumul mediu de alimente (C) per șoarece pe zi. n / s = nu a fost detectată nici o semnificație ## = p <0,0001, # = p <0,001, ** = p <0,01, * = p <0,05. Pentru (A) N = 24 (Tumor), N = 8 (Tumor + R100), N = 7 (Tumor + R200), N = 8 (Tumor + R500).Pentru (B) și (C) N = 24 (Tumor), N = 8 (Tumor + R100), N = 7 (Tumor + R200), N = 8 (Tumor + R500).
Pentru a delimita dacă resveratrolul a avut vreun efect independent asupra masei musculare, șoarecii de control fără tumori au fost tratați cu 100-500 mg / kg în paralel cu șoarecii tratați cu tumora. Am constatat că șoarecii de control non-tumorali tratați numai cu resveratrol au prezentat greutăți corporale egale cu șoarecii de control la doze mai mici (100 mg / kg, 200 mg / kg). La cea mai mare doză testată (500 mg / kg), șoarecii au pierdut greutatea în comparație cu controalele corespunzătoare vârstei ( Figura 1B ). Aceste rezultate arată că 500 mg / kg de resveratrol poate determina o scădere în greutate în absența cașexiei, în timp ce nivelurile mai scăzute (100-200 mg / kg) nu afectează greutatea corporală.
Niciuna dintre dozele de resveratrol testate nu determină o creștere a masei musculare, sugerând că efectele protectoare ale resveratrolului nu s-au datorat creșterilor independente ale masei musculare.
Resveratrolul protejează împotriva pierderii de carne slabă indusă de cașexie și pierderea masei grase
Casexia de cancer se caracterizează prin pierderea atât a masei musculare scheletice, cât și a țesutului adipos rezultat din modificări ale metabolismului proteinelor și lipidelor. 2 , 5 , 6 Următoarele au determinat compoziția corporală a șoarecilor provocați cu tumori în prezența sau absența resveratrolului prin analiza compoziției corpului RMN pentru a determina masa corporală slabă (LBM) și masa de grăsime (FM). Am identificat faptul că resveratrolul de 200 și 500 mg / kg protejează în mod semnificativ împotriva pierderii induse de tumoare a compoziției LBM și FM la șoarecii purtători de tumori ( figura 2A și 2B ). Comparativ cu martorii, șoarecii purtători de tumori netratați au pierdut 5,3% LBM (16,1 ± 0,3 față de 17,1 ± 0,1 g), comparativ cu șoarecii purtători de tumori tratați cu resveratrol, care au fost complet protejați (LBM (200 mg / kg) = 17,4 ± 0,19 g ; LBM (500 mg / kg) = 17,3 ± 0,3 g). Șoarecii purtători de tumori netratați au pierdut 33,3% din FM limitat, comparativ cu șoarecii de control (1,80 ± 0,15 față de 3,1 ± 0,10 g).Tumorile din șobolan tratate cu 200 și 500 mg / kg au fost protejate în mod semnificativ (2,7 ± 0,36 g și 2,4 ± 0,17 g, respectiv). Tratamentul cu resveratrol administrat șoarecilor de control fără tumori nu a afectat LBM sau FM. Deoarece resveratrolul nu a cauzat creșteri ale masei corporale totale (inclusiv LBM și FM) în absența tumorii, aceste studii indică faptul că protecția resveratrolului împotriva pierderii de greutate indusă de tumori nu se datorează capacității sale de a mări greutatea musculară, LBM sau FM .
Compoziția finală a corpului în rândul șoarecilor care nu poartă tumori și care poartă tumori
Întreaga compoziție a corpului de șoarece a fost determinată și prezentată pentru a arăta masa finală în grame în rândul tuturor grupurilor.
(A) S-a observat o pierdere semnificativă a masei musculare slabe la șoarecii purtători de tumoare netratată comparativ cu șoarecii martor, șoarecii martor care au primit resveratrol la toate dozele și șoarecii purtători de tumori care au primit resveratrol la nivelurile de 200 mg / kg și 500 mg / kg.
(B)Compozițiile în masă de grăsimi au fost comparate între aceleași subseturi cu o pierdere semnificativă de masă de grăsime prezentată în grupul care poartă un tumoră netratată. Grupurile care poartă tumori care primesc resveratrol au prezentat răspunsuri semnificative prin menținerea unei cantități mai mari de grăsimi în grupurile de 200 mg / kg și 500 mg / kg. Grupurile de control netratate și tratate au fost, de asemenea, semnificativ mai mari în compoziția masei de grăsime comparativ cu purtătorul de tumoare netratat. p <0,0001, # = p <0,001, ** = p <0,01, p = 0,05. Pentru (A) și (B) N = 24 (Tumor), N = 8 (Tumor + R100), N = 8 (Tumor + R200), N = 8 (Tumor + R500). Pentru (C) N = 17 (Tumor), N = 6 (Tumor + R100), N = 6 (Tumor + R200), N = 7 (Tumor + R500).
Resveratrol inhibă gastrocnemius indus de tumori și atrofie cardiacă
Cvadricepsul izolat și inima au fost colectate și cântărite imediat după recoltare. Tumorile cvadricepsice ale șoarecelui au o greutate semnificativ mai mică (~ 23%) decât mușchiul cvadriceps corespunzător de la șoarecii de control ( Figura 3A ).muchi quadriceps izolat de la șoarecii de control tratați cu resveratrol 100 mg / kg, 200 mg / kg și 500 mg / kg nu a fost semnificativ diferit față de șoarecii martor ( Figura 3A ).Dimpotrivă, mușchii cvadriceps de la șoarecii cu tumoare provocată tratați cu resveratrol 200 mg / kg și 500 mg / kg au fost semnificativ mai mari (16,6 ± 6,5%, respectiv 10,3 ± 4,9%) decât șoarecii cu tumori netratate ( Figura 3A )
doze > = 200 mg / kg de resveratrola protejat împotriva atrofiei mușchilor scheletici indusă de tumori. soarecii purtători de tumori au demonstrat atrofie semnificativă la nivelul membrelor posterioare, așa cum reiese din pierderea de masă de 12,2% comparativ cu martorii care nu poartă tumori ( Figura 3B ). Pentru a determina un efect mai general asupra mușchilor scheletici, am cântărit, de asemenea, masa membrelor din spate. Masa musculară a membrelor din spate a fost păstrată la animalele tratate cu resveratrol (200 și 500 mg / kg), evidențiate prin diferențe semnificative la șoarecii tratați cu tumori având o masă mai mare de 12,4 ± 5,7% și, respectiv, 9,2 ± 4,3% față de cei netratați tumoare provocate de soareci. Tratamentul cu resveratrol la șoarecii de control nu diferă semnificativ de șoarecii de control la toate cele trei doze testate.
Greutăți finale în rândul șoarecilor care nu poartă tumori și care poartă tumori
(A) Quadricepsul a fost analizat individual și s-a arătat o pierdere semnificativă în greutate în grupul purtător al tumorii netratate în comparație cu controlul, controalele tratate la toate dozele, precum și grupurile cu tumori tratate la dozele de 200 și 500 mg / kg. Grupul purtător al tumorilor tratate cu 100 mg / kg nu a fost semnificativ diferit în greutatea cvadricepsului din grupul care purta tumora netratată.
(B) Grupurile purtătoare de tumori care au primit resveratrol au prezentat răspunsuri semnificative prin menținerea greutăților din spate comparabile cu cele de control în grupurile de 200 mg / kg și 500 mg / kg. Grupurile de control netratate și tratate au fost, de asemenea, semnificativ mai mari la greutățile din spate, comparativ cu șoarecii purtători de tumori netratați. S-au comparat greutățile din spate între aceleași subgrupuri cu pierderi semnificative de greutate prezentate în grupul purtător al tumorii netratate.
(C) S-au observat scăderi semnificative ale greutății inimii la șoarecii purtători de tumori netratate comparativ cu șoarecii martor, șoarecii martor care au primit resveratrol la toate dozele și șoarecii purtători de tumori care au primit resveratrol la dozele de 200 mg / kg și 500 mg / kg. Schimbarea greutății inimii printre șoarecii care nu poartă tumori și care poartă tumori. Inimi individuale au fost cântărite și sunt reprezentate grafic aici pentru a arăta greutatea inimii ca procent din greutatea medie a inimii de control în rândul tuturor grupurilor. p <0,0001, # = p <0,001, ** = p <0,01, p = 0,05. Pentru controlul N = 8 (Control + R100), N = 8 (Control + R200), N = 8 (Control + R500) = 6 (Tumor + R100), N = 6 (Tumor + R200), N = 7 (Tumor + R500).
soarecii purtători de tumori au prezentat o pierdere semnificativă a greutății totale a inimii în comparație cu șoarecii de control. Tratamentul cu 200 și 500 mg / kg a fost protector împotriva acestei pierderi de greutate totală a inimii de 8,6% identificată după 17 zile de sarcină tumorală ( Figura 3C ).
Tratamentul șoarecilor de control cu 100 mg / kg, 200 mg / kg, 500 mg / kg de resveratrol nu a afectat greutatea totală a inimii ( Figura 3C ).
Pentru a caracteriza în continuare efectele resveratrolului asupra inimii, am efectuat ecocardiografia trans-toracică in vivo pe șoareci conștienți din control, provocată de tumori cu și fără resveratrol 500 mg / kg ( Figura 4A, 4B , Tabelul 1 ). Am identificat faptul că 17 zile de sarcină tumorală a determinat o scădere a peretelui anterior și posterior al ventriculului stâng, reflectând atrofia cardiacă identificată prin scăderea raportului greutate corporală / greutate corporală și grosimea relativă a peretelui ( Figura 4 ). În primul nostru set de studii, șoarecii care au provocat tumora și care au fost analizați prin ecocardiografie au pierdut aproximativ 8,8% din greutatea corporală după 17 zile de tumoare ( Figura 1B ). Cu toate acestea, în studiile noastre de ecocardiografie, au pierdut doar 6,8% (= 21,8-20,4 / 21,8) (tumora vs. control, Tabelul 1 ). Aceasta se poate datora dimensiunii eșantionului și variației dimensiunii tumorii pe care am văzut-o la șoarecii individuali. Tratamentul șoarecilor provocați de tumori cu resveratrol 500 mg / kg a împiedicat complet scăderea grosimii peretelui anterior și posterior ( Figura 4A, 4B , Tabelul 1 ). Tratamentul șoarecilor de control cu resveratrol nu a afectat grosimea peretelui VS de bază sau greutatea inimii ( Figura 4A , Tabelul 1 ), ceea ce sugerează că protecția resveratrolului adusa inimii nu a fost o creștere a masei musculare indusă de medicament, dar mai probabil datorită unei inhibiții a semnalizării căile care mediate atrofia cardiacă.
Resveratrolul protejează împotriva atrofiei cardiace induse
(A) Ecocardiografia conștientă a ventriculului stâng a identificat scăderi semnificative ale grosimii peretelui anterior și posterior în diastol, greutatea inimii față de greutatea corporală (HW / BW) și grosimea peretelui relativ, care nu au fost identificate când 500 mg / kg / zi s-a administrat resveratrol. (B) Înregistrări reprezentative M-mode din imaginile utilizate în analiza (A). A fost efectuată o analiză ANOVA cu o singură cale pentru a determina semnificația, urmată de o comparație între perechi de Holm-Sidak și semnificație între grupuri. * P <0,05. BW, greutatea corporală, greutatea corporală, greutatea inimii; RWT = LVPW; d / s + LVAntW; d / s / LVEDD sau LVEDS; Valoarea LV (index) = [1,055 * ((ExLVD; d) 3 – (LVEDD; d) 3 ). N = 4 pe grup.
tabelul 1
Ecocardiografia transtoracică la tratamentul neanestetizat pentru tumoare, tumoră sau tumoră plus resveratrol la șoareci maturi la vârsta de 16 zile după implantarea tumorii (± SE)
A fost efectuat un ANOVA cu o singură cale pentru a determina semnificația.
| Control N = 8 |
tumoare N = 4 |
Tumor + 500R N = 4 |
Control + 500R N = 4 |
|
|---|---|---|---|---|
| Greutatea corporală (g) | 21,8 ± 0,4 | 20,4 ± 1,1 | 21,6 ± 0,8 | 20,6 ± 0,4 |
| HR (bpm) | 651 ± 9 | 617 ± 27 | 640 ± 13 | 659 ± 13 |
| LVEDD (mm) | 2,63 ± 0,09 | 2,95 ± 0,08 * | 2,82 ± 0,13 | 2,50 ± 0,07 |
| LVESD (mm) | 1,11 ± 0,05 | 1,35 ± 0,07 | 1,19 ± 0,10 | 1,08 ± 0,06 |
| LV% EF | 88,97 ± 0,46 | 85,78 ± 2,78 | 88,64 ± 1,86 | 88,20 ± 0,94 |
| LV Vol; d (ml) | 25,9 ± 2,2 | 33,8 ± 2,2 | 30,6 ± 3,5 | 22,8 ± 1,5 |
| LV Vol; s (ml) | 2,9 ± 0,3 | 4,7 ± 0,7 | 3,5 ± 0,8 | 1,7 ± 1,5 |
BW, greutate corporală; LV, ventriculul stâng; HR, ritm cardiac; LVEDD, dimensiunea diastolică la capătul LV;LVESD, dimensiunea sistolică a capătului LV; LV EF% = [(LV Vol; d-LV Vol; s / LV Vol; d) * 100]; d, volumul LV în diastol; Volumul LV Vol; s, Volumul LV în sistol; LV Post W.
Resveratrolul inhibă activitatea factorului de transcripție NF-κB în mușchii scheletici indusă de tumori și atrofia inimii
Tumora de adenocarcinom C-26 induce cașexia prin eliberarea de TNFa, IL-1, IL-6, care interacționează cu receptorii lor concomitenți pe mușchi pentru a activa factorul de transcripție în aval NF-κB30-34, pentru a induce cașexia și atrofia musculară. Studii recente au demonstrat experimental rolul dominant al NF-kB în atrofia musculară 18-20 , 35 , 36 și capacitatea resveratrolului de a inhiba NF-κB în celulele canceroase 37. Prin urmare, am investigat dacă inhibarea resveratrolului de atrofie indusă de tumori și atrofia inimii s-a datorat în parte inhibării sale de NF-kB ( Figura 5 ). Am identificat activitatea NF-κB (subunitatea p65) legată de activitatea nucleară semnificativ crescută în gastrocnemiusul și inima indusă de tumoare și complet inversată la șoarecii tratați cu cele mai ridicate niveluri de resveratrol (200 mg / kg și 500 mg / kg) ( Figura 5A , 5B ). Gastrocnemiusul muscular de la șoareci purtători de tumori netratate a avut o activitate medie NF-kB mai mare cu 30,5% comparativ cu șoarecii martor ( Figura 5A ). S-a observat o scădere semnificativă a activității NF-kB (p65) la șoarecii purtători de tumori, cărora li s-au administrat resveratrol 200 și 500 mg / kg (scăzut cu 39% și, respectiv, 51%) ( Figura 5A ). Șoarecii de control tratați au avut, de asemenea, o scădere semnificativă a activității NF-kB (p65) după tratamentul cu doze de 200 și 500 mg / kg (scăzând 34% și, respectiv, 41%) comparativ cu șoarecii fără tumori provocați de tumoare, indicând că resveratrolul a scăzut NF endogen -kB indusă de tumoare în mușchii scheletici.
Activitatea nucleară a factorului-kappa B (p65)
(A) Extracțiile nucleare pe mușchiul gastrocnemius au fost analizate în vederea activității ADN-ului legat de p65. S-a observat o creștere semnificativă a activității la șoarecii purtători de tumori netratați în comparație cu martorul. Tumorile purtătoare de tumori tratate cu resveratrol au prezentat o scădere semnificativă a activității NF-kB la doze de 200 mg / kg și 500 mg / kg. De asemenea, în grupul tratat fără tumori tratat, activitatea NF-kB a fost semnificativ scăzută și comparabilă cu controlul cu administrarea de resveratrol la dozele de 200 mg / kg și 500 mg / kg.
(B) Grupurile purtătoare de tumori care au primit 200 mg / kg și 500 mg / kg resveratrol au prezentat o inhibare semnificativă a activității NF-kB indusă de tumoare.
(C) Șoarecii purtători de tumori care au primit 200 mg / kg și 500 mg / kg resveratrol au avut o inhibare a expresiei MuRF1 indusă de tumoare.expresia mRNA a fost măsurată și descrisă aici ca normalizată la controalele GAPDH. # = p <0,001, ** = p <0,01, * = p <0,05. Pentru (A) și (B): N = 12 (Control); N = 4 (Tumor + R200), N = 4 (Control + R100), N = 4 (Control + R200) ). Pentru (C): N = 4 (Control), N = 3 (Control + R100), N = 3 (Control + R200) Tumor + R100), N = 3 (Control + R200), N = 3 (Control + R500).
Analiza inimii a arătat că provocarea tumorală a indus o creștere de 19% a activității NF-kB comparativ cu inimile de control ( Figura 5B ). Tratamentul șoarecilor purtători de tumori cu resveratrol 200 și 500 mg / kg a redus semnificativ activitatea NF-kB (p65) comparativ cu șoarecii cu tumoare provocată (21,6% și, respectiv, 31,2%) ( Figura 5B ). Tratamentul cu resveratrol 200 și 500 mg / kg a determinat o reducere semnificativă a activității NF-kB (p65) la șoarecii martor (18,7% și, respectiv, 33,8%) comparativ cu șoarecii fără tumori provocați de tumori. Studii recente au demonstrat că inducerea NF-kB a ligazelor ubiquitin E3 reglează atrofia musculară scheletică 10 , 11 . Mai mult, laboratorul nostru a determinat rolul critic al atrofiei cardiace ubiquitin ligase finger-1 (MuRF1) în atrofia cardiacă 25 . Mai exact, am identificat faptul că șoarecii care nu au prezentat MuRF1 nu au putut, în esență, să se atrofie ca răspuns la dexametazonă 25 . Aceasta contrastează cu mușchiul scheletic, unde atât MuRF1, cât și Atrogin-1 joacă un rol parțial în inhibarea atrofiei musculare scheletice 13 . Am urmărit în continuare investigația noastră asupra modului în care inhibarea resveratrolului de NF-kB poate afecta expresia MuRF1 cardiacă in vivo.
Resveratrol inhibă expresia mRNA MuRF1 cardiacă
Afectarea tumorală a indus expresia mRNA MuRF1 în inimă în mod semnificativ (~ 20%) după 17 zile de tumoare ( Figura 5C ). În timp ce tratamentul cu resveratrol nu a afectat expresia MuRF1 la animalele de control, rezveratrolul de 200 și 500 mg / kg a inhibat semnificativ MuRF1 indus de tumoare comparativ cu provocarea tumorii în monoterapie (~ 25% și, respectiv, 75%), atingând niveluri de mRNA ale MuRF1 semnificativ mai mici care au fost găsite la animalele de control ( figura 5C ). Deoarece MuRF1 joacă un rol esențial în atrofia cardiacă in vivo 25 și MuRF1 este reglat în parte de către NF-κB 10,11 , aceste constatări sugerează un mecanism prin care resveratrolul inhibă atrofia cardiacă indusă de tumori prin inhibarea indusă de NF-κB Expresia MuRF1 in vivo.
Discuţie
Modelul C26-adenocarcinom al cașexiei de cancer a fost utilizat în ultimele 3 decenii pentru cercetarea istoricului natural al carcinoamelor și a terapiei antitumorale, așa cum a fost recent revizuită de Aulino și colab., 2010 29 . Aproximativ 190 de lucrări pot fi găsite prin căutarea în PubMed pentru cancerul C26, multe dintre ele concentrându-se pe Cachexia 29 indusă de C26. Modelul C26-adenocarcinom a fost stabilit în 1975 într-un efort de a crea modele care ar putea fi utilizate pentru a testa biologic și chemo-terapii38.Acesta poate fi stabilit la șoareci nud și SCID, precum și șoareci de tip sălbatic, sugerând că limfocitele joacă un rol mic, dacă este cazul, în fiziopatologia progresiei tumorale 31 . Mecanismul predominant prin care linia celulară de adenocarcinom C26 induce cașexia este prin eliberarea citokinelor inflamatorii 31 , paralel cu mecanismul prin care cancerul provoacă cașexie la om 8 .
Studiile inițiale ale modelului de șoarece cu C26-adenocarcinom, așa cum a fost utilizat în studiul prezent, au identificat un rol proeminent al IL-6 în inducerea atrofiei musculare. În aceste studii, inhibarea IL-6 utilizând reactivi specifici citokinelor a prevenit atrofia musculară indusă la șoarecii purtători de adenocarcinom C26. Studiile suplimentare au arătat că IL-6 nu a fost singurul mecanism pentru inducerea cașexiei musculare 34 , 39 . De asemenea, s-a descoperit că celulele de adenocarcinom C26 secretă TNFa, IL-1 și IL-6 in vivo, împreună cu factorii de cașexie identificați care induc atrofia mușchilor scheletici in vivo 31 , 33 . Aceste citokine proinflamatorii se leagă de receptorii lor congenitali găsiți pe mușchiul și inima scheletului, pentru a activa factorul de transcripție NF-κB40, care mediază efectele lor din aval.Activarea NF-kB este esențială pentru procesul de atrofie a mușchiului striat. Acest lucru a fost dovedit convingător prin utilizarea complecșilor NF-kB inhibitori negativi dominanți (IKK), care inhibă în mod eficient NF-kB. Supraexpresia unei proteine de fuziune IKKα / β-EGFP negativă dominantă, care inhibă atrofia indusă de NF-κB în mod semnificativ inhibată până la 70% in vivo 17 . Alte studii au identificat, de asemenea, că inhibarea farmacologică sau genetică a IKK / NF-κB inhibă în mod asemănător pierderea musculară dependentă de ubiquitină (proteoliza) 10 . În aceste studii, inhibarea NF-kB a inhibat expresia ligandului ubiquitin MuRF1, una dintre cele două ligase ubiquitin care sunt necesare pentru apariția atrofiei mușchilor scheletici10.
Mediatorii mediator de inflamare, cum ar fi TNFa, sunt inductori puternici ai liganței ubiquitin MuRF1 13 .Studiile recente au arătat că expresia MuRF1 este reglată de factorul de transcripție NF-kB10 , 41 , care este activat de un număr de citokine proinflamatorii, incluzând TNFa. În mod similar, tumora de adenocarcinom C26 la șoareci induce catabolismul proteinei prin inducerea ligandului ubiquitin MuRF1 42. Încărcarea C26 induce o pierdere specifică a componentelor sarcomerice de filament groase, dar nu subțiri 24 și modifică expresia izoformei 43 a miozinei, în concordanță cu acțiunile lui MuRF1 44 . Complexul de distrofină este scăzut la șoarecii cu azotocarcinom C26, un fenomen esențial pentru degradarea musculară 42 .Acest model a permis demonstrarea rolului celulelor stem în mușchii scheletici în timpul cașexiei 45 , 46.
În timp ce MuRF1 joacă doar un rol parțial în medierea atrofiei mușchilor scheletici in vivo 13 , laboratorul nostru a identificat recent că activitatea MuRF1 este necesară pentru a induce orice atrofie cardiacă 25 . În mod specific, am identificat faptul că atrofia semnificativă indusă de dexametazonă indusă în inimile de tip sălbatic este în esență absentă la șoareci MuRF1 – / 25 . Prin urmare, am concentrat studiile noastre actuale asupra expresiei MuRF1 a ligazei ubiquitin în inimă. Am presupus că inhibarea resveratrolului de NF-κB cardiac ar reduce expresia MuRF1 cardiacă, reprezentând un mecanism prin care atrofia cardiacă este inhibată în modelul de șoarece de cașexie indus de C26-adenocarcinom. De fapt, am identificat faptul că resveratrolul a inhibat expresia MuRF1 crescută în tumoră in vivo (Figura 5C ). Prin urmare, concluziile noastre constau în prevenirea consecventă a resveratrolului de atrofie cardiacă datorată, în parte, inhibării MuRF1, posibil prin inhibarea lui NF-kB.toate acestea, MuRF1 este reglementatde alți factoritranscripție cum ar fi transcrierea FOXO factori de 47 – 49 , deci este posibil ca resveratrolul inhiba MuRF1 prin alte cai decât NF-kB mecanisme în inimă. Constatarile din prezentul studiu demonstreaza ca resveratrolul protejeaza impotriva atrofiei cardiace induse de inima prin inhibarea NF-kB si MuRF1, sugerand unul sau mai multe mecanisme prin care este cardioprotectiva.
Casexia la pacienții cu cancer uman prezintă pierderi de mușchi, adesea cu pierderea de grăsime asociată cu anorexia, inflamația și rezistența la insulină 50 . Studiile anterioare au demonstrat că cașexia indusă de C26-adenocarcinom induce o pierdere atât a mușchiului muscular, cât și a grăsimii, așa cum am identificat în studiul de față 51 , 52 . Detaliile privind modul în care cașexia determină pierderea de grăsime nu a fost complet delimitată, dar creșterea expresiei lipazei sensibile la hormoni este un efect descendent al factorilor secretați de tumori 50 . Deși este posibil ca citokinele inflamatorii și NF-κB să poată mediaze acest lucru în mușchi, nu este suficient să se ajungă la aceste căi complexe de semnalizare în adipocite în prezent pentru a susține această ipoteză 53 .
Unul dintre punctele forte ale studiului actual este că resveratrolul nu a afectat dimensiunea tumorilor adenocarcinom C26, permițându-ne să determinăm eficacitatea resveratrolului în special la nivelul mușchilor și inimii scheletice. Cu toate acestea, este important de remarcat faptul că resveratrolul a fost raportat pentru a inhiba creșterea tumorii, incluzând mai multe celule de mielom (linie de celule IM-9), celule HeLa (carcinom de col uterin) și celule K-562 (leucemie mieloidă cronică) 37 , 54 , 55 . De fapt, eficacitatea inhibării NF-kB de către resveratrol pentru a proteja împotriva pierderii mușchilor scheletici indusă de tumoarea MAC16 (utilizând 1 mg / kg / zi) într-un studiu anterior efectuat de Wyke și colab. 56ar putea fi atribuită inhibării sale de creștere tumorală în sine, făcând studiul prezent unic din punct de vedere mecanicist. Abilitatea resveratrolului de a inhiba creșterea tumorală în sine poate fi foarte benefică pentru pacienții cu cașexie. Împreună cu studiul nostru prezent, aceste constatări indică faptul că resveratrolul protejează împotriva cașexiei cauzate de cancer prin două mecanisme distincte: 1) prin inhibarea directă a creșterii tumorale, determinând moartea celulelor rezultând într-o reducere a eliberării totale a citokinei; și 2) prin inhibarea semnalizării NF-kB determinată de citokine la nivelul mușchiului și inimii scheletice. Deoarece resveratrolul nu afectează tumora de adenocarcinom C26 în studiul prezent, resveratrolul poate fi chiar mai puternic decât rezultatele studiului prezent demonstrează.
Contribuția complicațiilor cardiace la cachexia cancerului la om nu a fost studiată pe scară largă. Cu toate acestea, mulți dintre mediatorii inflamatorii au descoperit cafexia se găsesc în insuficiența cardiacă și cauzează direct disfuncție cardiacă, incluzând IL-6, IL-1 și TNFa. Cel mai bine studiat este TNFα, care poate provoca insuficiență cardiacă și a fost implicată în patofiziologia unui număr de boli cardiace 7 . Acest lucru sugerează că implicarea cardiacă poate fi frecventă în cazexia cardiacă, în special în cazul unei boli severe. În mod experimental, a fost demonstrat ca cașexia induce insuficiența cardiacă, perturba structura miocardică și modifică compoziția proteinelor contractile la modelele de șoarece 43 , 57. Nu am identificat disfuncția sistolică brută prin ecocardiografie în studiul de față. Cu toate acestea, tumorile mai mari care se formează pe perioade mai lungi pot să fi condus la disfuncție cardiacă în modelul nostru.
În studiul de față, demonstrăm pentru prima dată că resveratrolul inhibă direct atrofia mușchilor scheletici și cardiacă la doze orale de 200-500 mg / kg / zi într-un model de șoarece de cașexie indusă de tumori și de atrofie cardiacă fără nici o toxicitate aparentă lasoarece Un studiu recent realizat de Busquets, et al. a constatat că resveratrolul nu a împiedicat pierderea de mușchi scheletici indusă de cancer, utilizând un model de șobolan cu hepatom de ascites Yoshida AH-130 (tratat cu resveratrol 1 mg / kg / zi) sau cu șoareci purtători ai carcinomului pulmonar Lewis (la 5 și 25 mg / kg / zi resveratrol intraperitoneal) 58 . De asemenea, sobolanilor li sa administrat resveratrol oral (3 mg / kg / zi) în combinație cu ulei de pește intragastric 58. Rețineți că în cadrul modelului intragastric s-au utilizat doze semnificativ mai mici comparativ cu studiul nostru prezent (100-500 mg / kg și zi). Incapacitatea resveratrolului de a proteja împotriva pierderii masei musculare scheletice sau a pierderii de greutate corporală în rozătoarele purtătoare de tumori poate fi, prin urmare, datorată dozelor reduse de resveratrol utilizate în acest studiu anterior. În concordanță cu această ipoteză, utilizarea noastră de 100 mg / kg și zi prin gavaj oral nu a avut niciun efect asupra pierderii musculare, în timp ce o doză de cel puțin 200 mg / kg / zi a fost necesară pentru a proteja din nou cazhexia indusă de tumori. Doza efectivă în studiul actual de șoarece este de aproximativ 3 ori mai mare decât doza testată la om fără toxicitate. În studiul clinic de fază I, o singură doză de 5 g / zi a fost administrată persoanelor fără toxicitate evidentă. 26La o persoană de 70 kg, această doză ar fi de aproximativ 71 mg / kg / zi (5000 mg / 70 kg) sau aproximativ 2,8 ori mai mică decât doza efectivă minimă găsită în studiile actuale (200 mg / kg / zi vs. 71 mg / kg / zi).
Efectele expunerii pe termen lung a resveratrolului în contextul tratării cașexiei cancerului în modelul prezent nu sunt cunoscute. Totuși, trebuie subliniat faptul că șoarecii care au primit 500 mg / kg / zi ( Figura 1B ) au pierdut greutatea în prezența sau absența tumorii, în timp ce șoarecii care au primit doze mai mici nu au făcut-o. Deoarece aceste mici, dar semnificative modificări au fost observate când s-au administrat 500 mg / kg / zi într-o perioadă scurtă de timp (11 zile), studiile viitoare ar trebui să fie atenți la reacțiile adverse potențiale cu terapie cu resveratrol pe cale orală (adică pierderea în greutate) la doze de 500 mg / kg / zi. Acest lucru ar fi deosebit de important în studiile pe termen lung care durează mai mult de 11 zile, ceea ce este probabil modul în care acest medicament va fi utilizat pentru a trata cachexia la pacienți.
Terapiile actuale pentru cașexie includ terapia modală unică sau combinațiile de agenți progestative, glucocorticoizi, inhibitori selectivi ai COX-2 sau medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) cum ar fi aspirina sau indometacinul. Au fost dezvoltate noi tratamente pentru a inhiba într-o anumită măsură citokinele sau NF-κB. Acestea includ progestine cu doză mare 59 , acid eicosapentaenoic (EPA) 60 , beta-hidroxi-β-metilbutirat (HMB) 61 , talidomidă 62 și AINS 63 . Cu toate acestea, acești agenți au efecte secundare adverse și rezultatele au fost variabile și marginale în inversarea cașexiei clinic. Resveratrolul este utilizat în prezent într-o varietate de boli umane, incluzând carcinomul hepatocelular 21și boala neurodegenerativă 22 fără toxicitate marcată 7 . Prin urmare, poate avea o aplicare în cazexia (inclusiv mușchiul scheletic și atrofia cardiacă) și, în general, la insuficiența cardiacă într-o varietate de contexte ale bolii umane, deși acest lucru nu a fost testat direct în prezent.
Material suplimentar
Supp Figura 1
Figura 1:
Examinarea histologică a țesuturilor hepatice și a rinichilor a fost efectuată la mărirea de 20X pentru a căuta semne de toxicitate la medicament. (A) La momentul sacrificării, au fost recoltate ficat și probele histologice preparate în mod standard așa cum este descris în secțiunea metode. Parenchimul hepatic normal a fost observat cu citoplasma uniformă între toate grupurile așa cum se vede în proba de control. (B) Nu s-a detectat nici o toxicitate medicamentoasă în ficat din orice grupuri tratate cu resveratrol, așa cum s-a observat din histologia mouse-ului tratat cu resveratrol cu tumora de 500 mg / kg. (C, D) Nu s-a detectat nici o dovadă de pierdere de hepatocite, inflamație sau steatoză în nici un grup la orice doză. Analiza histologică a rinichilor a evidențiat glomeruli, tubuli și interstițiu normali, fără nici o dovadă de necroză tubulară acută, glomeruloscleroză,sau inflamația interstițială, așa cum s-a demonstrat la un șoarece de control (C), precum și la un șoarece purtătoare de tumori (D) tratate cu resveratrol de 500 mg / kg. N = 4 șoareci pe grup au fost analizate histologic (Control, Control + 100R, Control + 200R, Control + 500R, Tumor, Tumor + 100R, Tumor + 200R, Tumor + 500R). Un șoarece reprezentativ din control și Tumor + 500R este prezentat în figură.
Supp Materiale și metode
Recunoasteri
Toate lucrările au fost efectuate la Universitatea Carolina de Nord din Chapel Hill, SUA
Acordarea sprijinului acordat
SS a fost susținută de Universitatea din Carolina de Nord, Departamentul de ORL / Chirurgia capului și a gâtului. Aceasta lucrare a fost sustinuta de catre Universitatea din Carolina de Nord Programul de Grant Stiinta Transferului (la MC), American Heart Association Development Scientist Grant (la MW), precum si Institutul National Heart, Lung si Blood acorda R01HL104129 (la MW).
Abrevieri nestandardizate
| NF-kB | factorul de amplificare a lanțului kappa-lanț-factor de lumină a celulelor B activate |
| IKK | IkB kinaza |
| MAC | adenocarcinomul murin |
| LBM | masa corporală |
| FM | masa grasa |
| MuRF1 | mușchi inelul inimii-1 |
| UPS | sistemul ubiquitin proteazom |
Note de subsol
Conflictul de interese
SS, MC, KM, LW, XY, JR, DG, MW nu declară conflicte de interese.
TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice 
resveratrol e mai bun decat curcumina in casexie http://www.greenmedinfo.com/article/both-curcumin-and-resveratrol-show-promise-anti-cachexia-agents-whereas-resver