Salvarea efectelor secundare de 2-deoxiglucoză prin dieta cetogenică/keto

Abstract

Metabolismul Cancerului este caracterizat prin consumul excesiv de glucoză prin intermediul glicolizei aerobe. Nu a apărut până în prezent nici o terapie eficientă care să exploateze această trăsătură de cancer, parțial datorită efectelor secundare substanțiale ale medicamentelor investigate.

În acest studiu am examinat efectele secundare ale unei combinații de dietă cetogenică izocalorică (KD) cu inhibitor de glicoliză 2-deoxiglucoză (2-DG).

Două grupe de opt șoareci niti atimici au fost alimentați fie cu o dietă standard (SD), fie cu  KD caloric nerestricționata, cu un raport de 4 g grăsimi la 1 g proteină / carbohidrat.2-DG a fost investigat în doze uzuale de 0,5 până la 4 g / kg și până la 8 g / kg. Cetoza a fost obținută sub KD (corpuri cetone: SD 0,5 ± 0,14 mmol / L, KD 1,38 ± 0,28 mmol / L, p <0,01). Aplicarea intraperitoneală de 4 g / kg de 2-DG a determinat o creștere semnificativă a glicemiei, care nu a fost împiedicată de KD. Sedarea după tratamentul cu 2-DG a fost observată și un test comportamental al mișcării spontane a arătat că KD a redus sedarea cu 2-DG ( p <0,001). O creștere a dozei de 2-DG până la 8 g / kg a fost letală pentru 50% dintre șoareci din SD și pentru 0% dintre șoarecii din grupul KD ( p<0,01). O combinație pe termen lung de KD și o doză orală de 1 sau 2 g 2-DG / kg a fost bine tolerată. În concluzie, KD reduce efectele sedative ale 2-DG și crește dramatic doza maximă tolerată de 2-DG. Este posibilă o combinație continuă de terapie cu KD și anti-glicolitice. Aceasta este, după cunoștințele noastre, prima demonstrație a toleranței crescute la inhibarea glicolizei de către KD.

1. Introducere

O caracteristică-cheie a tumorilor maligne și, de asemenea, o caracteristică a cancerului este o schimbare a metabolismului [ 1 ], de exemplu, glioblastoamele (GB), cea mai frecventă tumoare malignă la nivelul creierului la adulți, iar alte tipuri de cancer afișează glicoliză ridicată chiar și în prezența oxigenului (glicoliza aerobă). Acest efect a fost descris pentru prima dată de Otto Warburg [ 2 ]. Dependența de glucoză a tumorilor maligne este de asemenea baza 18 de tomografie cu emisie de pozitroni F-fluorodeoxi-glucoză (FDG-PET) pentru diagnosticul și stadializarea tumorii. Explicațiile potențiale ale acestei utilizări ineficiente din punct de vedere energetic a glucozei în celulele canceroase ar putea fi cerințe metabolice care se extind dincolo de producția de ATP și includ necesitatea unor precursori pentru a genera biomasă [ 3 ]. Metabolismul modificat al cancerului ar putea expune un călcâi al lui Ahille țintit ca o abordare terapeutică selectivă. Chiar dacă glicoliza aerobă a fost descoperită cu aproape un secol în urmă, de atunci nu s-a stabilit niciun tratament specific. La cunoștințele autorului, prima încercare de a inhiba direct glicoliza la pacienții cu un medicament chimioterapeutic a fost 2-deoxiglucoza (2-DG) în 1958 [ 4 ]. 2-DG este un analog structural cu glucoza, care diferă de glucoză numai prin absența unui atom de oxigen la poziția C2. Glicoliza este blocată după fosforilarea intracelulară a 2-DG de hexokinază ( Figura 1 ), ceea ce duce la epuizarea ATP și la activarea proteinei kinazei activate AMP (AMPK) [ 5 , 6 , 7 ]. Efectul 2-DG este crescut în hipoxie, fenomen comun în GB [ 8 ]. Mai mult, 2-DG induce angajamentul neuronal al celulelor tumorale [ 9 ], inhibă HIF-1α [ 10 ], precum și glicozilarea N-legată [ 11 ] și sensibilizează celulele tumorale la radioterapie și chimioterapie [ 12 ]. În ciuda acestor efecte promițătoare in vitro, 2-DG ca monoterapie nu a demonstrat un efect antitumoral semnificativ în multe experimente in vivo la șoareci și pacienți, iar 2-DG a fost stabilit ca un instrument de laborator, dar nu ca un medicament împotriva cancerului. Un motiv plauzibil major pentru eșecul de până acum al 2-DG in vivo ar putea fi o dozare insuficientă. 2-DG este eficient dacă raportul 2-DG / glucoză variază între 0,5 / 1 și 1/1 sau chiar depășește nivelurile de glucoză6 ]. Studiile la pacienți au evidențiat simptome clinice ale hipoglicemiei care limitează doza la 250 mg / kg pe cale orală în asociere cu radioterapia [ 13 ] sau 63 mg / kg pe cale orală atunci când sunt combinate cu docetaxel [ 14 ]. Dozele tipice utilizate la șoareci au fost cuprinse între 0,5 g / kg și 2 g / kg, administrate de trei ori pe săptămână sau o dată pe zi. Diferite doze letale 50% (LD 50 ) la șoareci au fost raportate în funcție de modul de aplicare și sunt 2,5 g / kg pentru administrare intravenoasă, 4,5 g / kg pentru administrare intraperitoneală și 5 g / kg pentru administrare subcutanată (BALB / cAn X Hibrizi DBA / 2J F1 sau șoareci DBA / 2J) [ 15 ]. În plus, LD50 depinde atât de rozătoare cât și de tulpina utilizată pentru experiment, de exemplu, 3,85 g / kg (șoareci masculi BALB / c, intraperitoneal) [ 16 ] și 8 g / kg (șobolani masculi elvețieni, ) [ 17 ]. În ciuda simptomelor clinice ale hipoglicemiei, analiza serică prezintă hiperglicemie reactivă după aplicarea 2-DG, eventual antagonizând calitățile citotoxice [ 18 ].Hiperglicemia este mediată de eliberarea catecolaminelor [ 19 ] și poate fi antagonizată, de exemplu, de dihidroergotamină sau propranolol20 ]. Pentru a spori efectul antitumoral al 2-DG, ar putea fi necesară reducerea hiperglicemiei reactive și, astfel, transformarea raportului în favoarea 2-DG.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație, etc. Numele obiectului este ijms-19-02462-g001.jpg

Schema de efecte metabolice mediate de 2-deoxiglucoză (2-DG). 2-deoxiglucoza (2-DG) inhibă glicoliza prin blocarea hexokinazei și a fosfohexoizomerazei. Acizii grași și corpurile cetone, de exemplu p-hidroxibutirat, intră în calea metabolică în aval de acest bloc și permit astfel ciclul acidului citric și fosforilarea oxidativă.

 

Țesuturile netransformate pot utiliza diferite surse metabolice pentru ATP, în timp ce metabolismul celulelor gliomului este mai puțin flexibil [ 21 ]. Am presupus că precondiționarea țesuturilor netransformate, în special a celulelor neuronale cu surse de energie alternative, ar putea reduce simptomele clinice ale inhibării utilizării glucozei celulare și ar permite doze mai mari de 2-DG. Dieta ketogenică (KD) are potențialul de a realiza ambele sarcini. KD clasic este o dieta bogată în grăsimi și carbohidrați cu conținut scăzut de carbohidrați crescând nivelul seric al cetonelor și scăzând consumul de glucoză din creier. Grupul nostru a arătat recent că dieta ketogenica KD este sigura în șoareci și în cazul persoanelor cu glioblastom21 , 22 ]. Scopul acestui studiu a fost de a determina efectele secundare ale unei terapii combinate anti-glicolitice cu 2-DG și KD caloric-nerestricționata.

2. Rezultatele

2.1. Efectele 2-DG asupra consumului de glucoză și semnalizarea AMP-kinazei în celulele glioblastomului uman

Pentru a confirma efectele mediate de 2-DG asupra metabolismului glucozei, am tratat celulele glioblastomului LNT-229 uman cu 2-DG. Consumul de glucoză și producția de lactat au fost reduse în prezența a 2-DGFigura 2 A). În plus, 2-DG a activat calea de semnalizare AMPK sensibilă la lipsa de nutrienți centrală, evidențiată de o creștere atât a AMPK fosforilat cât și a acetil-CoA carboxilazei țintă de fosforilare (ACC) în prezența 2-DG ( Figura 2 B).

Un fișier extern care deține o imagine, ilustrație, etc. Numele obiectului este ijms-19-02462-g002.jpg

Efecte mediate de 2-deoxiglucoză asupra consumului de glucoză și semnalării AMP-kinazei. A ) Celulele glioblastomice LNT-229 umane au fost incubate în mediu Eagle modificat Dulbecco fără DME (DMEM) conținând glucoză 2 mM în prezența sau absența suplimentară a 2-DG timp de 6 ore, așa cum s-a indicat.Consumul de glucoză și producția de lactat s-au măsurat în supernatant ( n = 3, deviația medie + medie, ** p<0,01, testul t Student). B ) Celulele LNT-229 au fost incubate ca în ( A ), cu concentrații diferite de 2-DG, așa cum s-a indicat. Lizatele celulare au fost analizate prin imunoblot cu anticorpi pentru P-AMPK, acetil-CoA carboxilază țintă de fosforilare (P-ACC) și actină.

2.2. Modificările metabolice induse de dieta cetogenică la șoarecii amimi (Foxn1nu)

Într-un prim experiment, două grupe de opt șoareci au fost hrăniți fie cu o dietă standard (SD), fie cu una ketogenica KD caloric nerestricționata, pentru a stabili efectele asupra cetozelor și a glucozei din sânge. După o săptămână, corpurile de cetone din sânge au prezentat o medie de 1,38 ± 0,28 mmol / l în grupul KD, comparativ cu 0,5 ± 0,14 mmol / L în grupul SD ( p <0,01) ( Figura 3 A). Acest lucru a fost în concordanță cu rezultatele noastre anterioare [ 21 ]. Prima măsurare a glicemiei inițiale după o săptămână a dietei a fost mai mare în KD decât în ​​grupul SD (153 ± 18 mg / dl față de 131 ± 14 mg / dl, p = 0,03) ( Figura 3 B).Următoarele măsurători ale glicemiei inițiale nu au prezentat diferențe pe parcursul experimentelor. postul de noapte a fost adăugat la KD în studiile clinice. Într-un experiment separat, postul peste noapte, în plus față de KD, a crescut în continuare nivelurile corpurilor cetone (linia de bază: 0,7 ± 0,1 față de 1,9 ± 0,2 mmol / L, p <0,01). Combinația dintre KD și postul de repaus peste noapte a condus la o reducere a nivelurilor de glucoză din sânge, cu valori mai scăzute în grupul KD (KD + postul 90 ± 30 mg / dl, SD 121 ± 15 mg / dl, p <0,01). Postul nu a influențat răspunsurile metabolice după administrarea 2-DG (adică o creștere a glicemiei). Prin urmare, au fost făcute și alte experimente fără post.

Un fișier extern care deține o imagine, ilustrație etc. Numele obiectului este ijms-19-02462-g003.jpg

Efectele unei diete ketogenice (KD) asupra corpurilor cetone sanguine și asupra nivelurilor de glucoză. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă normală, fie cu o dietă cetogenică. A ) După o săptămână, corpurile cetone din sânge au prezentat o medie de 1,38 ± 0,28 mmol / L în grupul KD comparativ cu 0,5 ± 0,14 mmol / L în grupul standard de dietă ( n = 8, deviație medie + standard , ** p <0,01, t- test al elevului). B ) În același timp, glicemia a fost mai mare în KD decât în ​​grupul SD (153 ± 18 mg / dl față de 131 ± 14 mg / dl, n = 8, deviația medie + deviația standard, p = 0,03 , Testul elevului). Măsurarea valorilor glicemiei inițiale în cursul timpului nu a arătat niciodată o diferență în glicemia dintre cele două grupuri din nou.

2.3. Modularea hiperglicemiei induse de 2-deoxiglucoză prin dieta cetogenică

Pentru a reproduce toxicitatea acută a 2-DG în dozele mici și stabilite, am administrat doze de 2-DG începând de la 0,5 g / kg, cu o creștere ulterioară de până la 4 g / kg prin injecție intraperitoneală în cohorte de opt șoareci. În cohorta, 4 g / kg 2-DG nu a fost letal pentru nici unul dintre șoareci. Glicemia din sânge a fost măsurată după 3 și 6 ore, iar corpurile cetone după 6 ore. Am detectat o creștere semnificativă a numărului de corpuri cetone în comparație cu măsurarea liniei de bază în grupul SD ( p <0,01), în timp ce o creștere suplimentară a grupului KD nu a fost semnificativăp = 0,13) ( Figura 4 A). Nivelurile de glucoză din sânge au atins punctul maxim după 3 ore și au fost ridicate după 3 ore și 6 ore în grupul SD. În grupul KD, a existat o creștere similară după 3 ore, totuși, după 6 ore, nivelurile au revenit deja la valoarea inițială ( Figura 4 B).

Un fișier extern care deține o imagine, ilustrație, etc. Numele obiectului este ijms-19-02462-g004.jpg

Efectele 2-deoxiglucozelor asupra corpurilor cetone sange și a nivelurilor de glucoză. A ) Șoarecii au fost hrăniți fie cu regim alimentar normal, fie cu regim alimentar ketogenic. După injectarea intraperitoneală de 4 g 2-DG, corpurile de sânge cetone s-au determinat după 6 ore ( n = 8, medie + deviație standard, nesemnificativă (Ns) p > 0,05, ** p <0,01. B ) Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă normală, fie cu o dietă cetogenică. După injectarea intraperitoneală de 4 g 2-DG, glucoza din sânge a fost determinată după 3 și 6 ore ( n = 8, deviația medie + standard, Ns p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, Test).

2.4. Salvarea constrângerilor mișcării / comportamentului mediată de 2-deoxiglucoză prin dieta cetogenică

În același timp, au fost efectuate teste comportamentale pentru a evalua simptomele clinice, care s-au manifestat în primul rând ca sedare și mișcare redusă. Un test de mișcare spontană în spațiu deschis [ 23 ] ( Figura 5 A) a arătat că șoarecii din grupul KD au fost semnificativ mai puțin sedați după 3 ore ( n = 8, p<0,001) și s-au recuperat complet după 6 ore. Grupul hrănit cu SD a prezentat sedare susținută chiar la 6 ore după injectarea 2-DG ( Figura 5 B). O comparație a celor două grupe de tratament a fost de asemenea efectuată utilizând mersul cu fascicul, totuși echilibrarea pe un baston cu diametrul de 6 mm sa dovedit a fi prea dificilă chiar și pentru șoarecii ușor sedați și rezultatele nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (datele nu sunt prezentate).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele de obiect este ijms-19-02462-g005.jpg

Evaluarea comportamentului mouse-ului după tratamentul cu 2-deoxiglucoe. A ) Comportamentul a fost evaluat semi-cantitativ. Șoarecii au fost plasați în mijlocul unui cub transparent cu o lungime de 30 cm pentru o singură minut și mișcarea a fost înregistrată pentru o analiză ulterioară. B ) Șoarecii au fost hrăniți fie cu regim alimentar normal, fie cu regim alimentar ketogenic. După injectarea intraperitoneală de 4 g / kg 2-DG, nivelul sedării ca efect secundar principal al 2-DG a fost examinat prin evaluarea standardizată a comportamentului de explorare. Șoarecii care au alimentat dieta cetogenică au fost mai puțin sedați și recuperați mai repede.

2.5. Dietă cetogenică mărește doza maximă tolerantă de 2-deoxiglucoză

Am studiat în continuare doza maximă tolerabilă de 2-DG. Deoarece toți șoarecii au tolerat o doză de 4 g / kg, am crescut cu 2-DG treptat până la 8 g / kg (administrare prin injecție intraperitoneală) [ 17 ]. După injectarea a 8 g / kg, 50% din șoarecii hrăniți cu SD au murit, în timp ce niciun șoarece din grupul KD nu a murit ( n = 8, test Chi pătrat, p <0,01)Figura 6 ). Toți șoarecii, indiferent de dietă, au prezentat o sedare pronunțată timp de până la 6 ore. Șoarecii supraviețuitori s-au recuperat pe deplin și nu au prezentat un deficit neurologic sau comportament persistent. Măsurarea glicemiei după o oră a indicat o creștere de la 124 ± 14 mg / dl până la 358 ± 3,4 mg / dl în grupul hrănit cu SD și de la 138 ± 25 mg / dl până la 342 ± 43 mg / dl în Șoareci hrăniți cu KD.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele de obiect este ijms-19-02462-g006.jpg

Mouse toleranță la 2-deoxiglucoză în funcție de dietă. Șoarecii au fost hrăniți fie cu dietă normală, fie cu regim alimentar cetogen. După injectarea intraperitoneală de 8 g 2-DG, 50% dintre șoarecii care au fost hrăniți cu dieta standard au murit, în timp ce nici unul care a fost hrănit cu dieta KD NU a murit. Toți șoarecii supraviețuitori au prezentat o sedare inițială marcată și s-au recuperat fără un deficit neurologic permanent.

2.6. O terapie combinată continuă anti-glicoliticaeste fezabilă

Pentru a studia fezabilitatea unei terapii combinate antiglicolitice combinate, șoarecii au fost randomizați în grupuri de patru șoareci și au fost hrăniți fie cu SD, caloric-nerestricționata KD, KD cu 1 g / kg 2-DG per gavaj oral (trei / săptămână) sau KD cu 2 g / kg 2-DG suplimentar (trei ori/ săptămână). Corpurile cetone după o săptămână au fost medii la 1,2 ± 0,18 mmol / l în grupurile KD, comparativ cu 0,4 ± 0,19 mmol / L în grupul SD. Nivelul corpurilor cetone nu s-a schimbat odată cu creșterea duratei dietei. Nu a existat o diferență semnificativă când s-a adăugat 2-DG ( p = 0,14). Sedarea s-a manifestat cu mișcare redusă de aproximativ 15 până la 30 de minute după aplicarea 2-DG. Toți șoarecii au fost recuperați într-o perioadă de 3 ore. În afara acestor efecte acute, combinația dintre KD și 2-DG a fost bine tolerată și nu am observat nicio modificare a comportamentului general. Peste o lună, a fost detectată o ușoară creștere nesemnificativă a greutății corporale în grupurile ketogenice ( p = 0,06) ( Figura 7 A, B).

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este ijms-19-02462-g007.jpg

Efecte asupra greutății șoarecilor de 2-deoxiglucoză și a dietei ketogenice. Șoarecii au fost randomizați în grupuri de câte patru șoareci și au fost hrăniți fie cu o dietă standard, cu o dietă ketogenică caloric-nerestricționată (KD), KD cu 1 g / kg 2-DG per gavaj oral (trei / săptămână), fie cu 2 g suplimentar / kg 2-DG (trei / săptămână). Combinația dintre KD și 2-DG a fost bine tolerată și nu am observat nicio modificare a comportamentului general. A ) Mai mult de o lună, a fost detectată o ușoară creștere nesemnificativă a greutății corporale totale în grupurile ketogenice ( p = 0,06, t -testul Studentului). B ) Modificarea greutății corporale a șoarecilor față de începutul intervenției dietetice ( n = 4, medie + SD).

3. Discuție

Limitările dozelor datorate toxicității sunt probabil un motiv pentru lipsa eficacității terapiilor antiglicolitice. Pentru a exploata pe deplin potențialul abordărilor antiglicolitice în celulele canceroase dependente de glucoză, o doză maximă și selectivitatea vor fi esențiale. Într-un sistem model cu celule de glioblastom LNT-229, 2-DG a redus consumul de glucoză și a declanșat semnalarea căii AMPK sensibile la privarea nutrienților ( Figura 2 ). În experimentele cu șoarece, o KD isocalorica a crescut toleranța pentru 2-DG, cel mai probabil printr-o adaptare metabolică la combustibilii alternativi distincti de glucoză.Precondiționarea KD a determinat o îmbunătățire a testelor funcționale și a ratei mortalității reduse la escaladarea dozei de 2-DG. KD nu a reușit să prevină hiperglicemia reactivă după injectarea a 2-DG.Horton și colegii au pretratat șoarecii cu 0,1 mg propranolol pentru a preveni hiperglicemia mediată de eliberarea catecolaminelor, înainte de administrarea a 3 g / kg 2-DG20 ]. În ciuda prevenirii creșterii nivelului de glucoză din sânge, ei au raportat încă o sedare marcantă a animalelor și chiar moartea. De aceea, toxicitatea / letalitatea acută a 2-DG pare să nu fie mediată de creșterea excesivă a nivelurilor de glucoză din sânge. Acest lucru este în concordanță cu rezultatele noastre. Putem postula că blocajul intracelular de glicoliză (care duce la hipoglicemia intracelulară și lipsa de energie tranzitorie) în neuroni este responsabil pentru efectele secundare sedative, iar moartea este cel mai probabil rezultatul unei sedații de comatoză, fără reflexe suficiente ale creierului, și nu de la o comă hiperglicemică, mediată.Sensibilitatea neuronilor la inhibarea glicolitică poate fi redusă prin precondiționarea corpurilor cetone ca sursă alternativă de energie pe care neuronii o pot atinge ușor21 ]. Un exemplu remarcabil al acestei capacități a neuronilor de a se baza pe corpurile cetone este sindromul de rare de transport al glucozelor de tip 1 (GLUT1). Datorită unei mutații în gena SLC2A1, GLUT 1 lipsește, provocând o întârziere severă de dezvoltare, dizabilitate intelectuală și alte simptome neurologice [ 24 ]. Tratamentul constă într-o dietă KD sau una Atkins modificată , care furnizează o sursă alternativă de energie [ 25 ]. Din cunoștințele noastre, prezentăm aici primul studiu care demonstrează o reducere a efectelor secundare ale unui inhibitor al glicolizei prin precondiționarea cu un KD. Am folosit 2-DG ca cel mai vechi medicament anti-glicolitic.Chiar dacă o terapie care vizează glicoliză este o abordare promițătoare și inovatoare pentru tratamentul cancerului, efectele secundare severe ale inhibiției de glicoliză limitează explorarea potențială în studii. De exemplu, un studiu care a utilizat dicloracetat DCA ca inhibitor de glicoliză a trebuit să fie oprit după ce aproape toți participanții au dezvoltat o polineuropatie toxică [ 26 ]. În combinație cu dieta ketogenica KD, reapariția inhibitorilor de glicoliză pentru a trata cancerul la om ar putea fi fezabilă.

În acest sens, următoarea etapă pentru evaluarea eficienței antitumorale a combinației KD și 2-DG ar trebui să fie testată în modelele adecvate de tumori de șoarece. Marsh și colab. a raportat un efect sinergic promițător al 2-DG, în combinație cu KD27 ]. În timp ce am folosit o dieta KD nerestricționata, izocalorica, cu doze mari de 2-DG, Marsh și colab. a utilizat o dietă calorică restrânsă (20% din greutate) cu o doză mică de 25 mg / kg 2-DG. În timp ce o dietă limitată calorică continuă este tolerată la rozătoare, acest lucru nu va fi probabil la pacienții cu boli terminale. O dietă limitată caloric ar determina o pierdere cronică în greutate și ar putea slăbi un grup deja fragil de pacienți vârstnici în cea mai mare parte. KD isocalorica este bine tolerata de pacienții cu cancer [ 22 , 28 ] și ar putea provoca un stres cronic al celulelor tumorale.Aplicarea ciclică a unor cantități mari de 2-DG ar putea provoca un efect antitumoral suplimentar acut și ar putea împiedica adaptarea celulelor tumorale, așa cum a propus Seyfried și colab. 29 ]. O tumoare model, în cazul în care terapia KD și antiglicolitice poate avea potențial, este glioblastomul GB, cea mai frecventă tumoare malignă cerebrală la adulți [ 30 ]. GB se caracterizează prin hipoxie, care poate duce la rezistența la medicamente chimioterapeutice, împreună cu adaptarea metabolică a celulelor tumorale [ 31 ]. Mai multe studii clinice au evaluat bevacizumabul, un anticorp umanizat, împotriva factorului de creștere vascular endotelial (VEGF), pentru a spori hipoxia prin blocarea neoangiogenezei și, astfel, uciderea celulelor tumorale [ 32 ]. Cu toate acestea, fiecare studiu nu a reușit să arate un beneficiu în supraviețuirea globală [ 33 , 34 ]. Dezvoltarea unui fenotip mai glicolitic ca mecanism de evacuare a fost prezentată în celulele tumorale tratate cu bevacizumab [ 35 ]. Grupul nostru a raportat că într-un model xenograft de șoarece orthotopic, gliomul cu fosforilarea oxidativă afectată a fost rezistent la tratamentul cu bevacizumab și tratamentul cu 2-DG a dus la sensibilitate restabilită la bevacizumab  [ 36 ]. Prin urmare, antagonizarea glicolizei și a neoangiogenezei ar putea fi un concept terapeutic promițător.

4. Materiale și metode

4.1. Reactivi, linii celulare și condiții de cultură

2-DG a fost achiziționată de la Cayman Chemical (Biomol, Hamburg, Germania). Celulele LNT-229 au fost un cadou bun de la Dr. N de Tribolet (Lausanne, Elveția) [ 37 ] și au fost cultivate în mediu de vultur modificat Dulbecco (DMEM) (4,5 g / l, corespunzând la 24,975 mM glucoză) conținând 10% (100 ml / ml penicilină și 100 pg / ml streptomicină (Life Technologies, Karlsruhe, Germania) la 37 ° C într-un incubator de cultură celulară (Binder, Tuttlingen, Germania) sub o atmosferă de CO2 (5%). Experimentele au fost efectuate în DMEM fără ser, cu 2 mM de glucoză și un timp de incubare de 6 ore.

4.2. Măsurarea glucozei și a lactatului

Supernatantul fără celule a fost colectat și concentrațiile de glucoză și lactat au fost măsurate utilizând analizorul biochimic Hitachi 917 [ 37 ].

4.3. Prepararea lizatului și analiza imunoblotului

Procedura a fost efectuată, după cum sa descris anterior, în urma unui protocol standard de imunoblotare [ 38 ]. După incubare, celulele LNT-229 au fost spălate cu soluție salină tamponată cu gheață fosfat (PBS) și peletizate. Lizatele au fost preparate folosind un tampon de liză, P, cu adăugarea de 1% Halt ™ protează și un inhibitor de fosfatază inhibitor de unică folosință (Thermo Fisher Scientific, Hamburg, Germania), diluat într-un tampon Laemmli și supus gelului de dodecil sulfat de poliacrilamidă de sodiu electroforeză (SDS-PAGE). Ulterior, proteinele au fost blotate la membrane de nitroceluloză (0,45 pm, GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Membranele s-au sonificat cu anticorpi la p-ACC (Ser79) (1: 1000; # 3661 Cell Signaling Technology (P) -AMPK (Thr172) (1: 1000; 2531 Cell Signaling Technology, Danvers, , Danvers, MA, SUA) și actin (# sc-1616, 1: 2000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA). Anticorpii secundari anti-iepure și anti-capră au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology. Chimiluminiscența îmbunătățită a fost utilizată pentru detectare [ 37 ].

4.4. animale

La toate experimentele pe animale s-au folosit șoareci fiziopatogeni nudi de șase săptămâni (Harlan, Indianapolis, IN, SUA). Reglementările locale au fost respectate și aprobarea a fost obținută de la autoritățile guvernamentale locale (Regierungspräsidium Darmstadt, numărul de aprobare FK / 1038).

4.5. Intervențiile dietetice

Toate lucrările pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul național pentru instituțiile de sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și standardele instituționale. Șoarecii au fost menținuți în grupuri de maximum patru animale per cușcă, într-un mediu fără patogen. În ziua 0 a experimentului, animalele au fost randomizate în două grupe de dietă, un SD bogat în carbohidrați față de un KD isocaloric.SD conține 45% carbohidrați, 41% proteine ​​și 14% grăsimi (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germania).KD a fost KetoCal 4: 1, copt sub formă de prăjituri (Nutricia GmbH, Erlangen, Germania). Conținutul dietelor a fost descris mai devreme [ 21 ].

4.6. Măsurarea corpurilor ketone și a glucozei 

Ketoza a fost măsurată cel puțin o dată pe săptămână cu Precision Xceed, test strip FreeStyle Precision Beta-Ketone (Abbott Diabetes Care Ltd., Witney, Marea Britanie), începând cu o săptămână după randomizare. Nivelul glucozei din sânge a fost măsurat utilizând Accu-Check Performa, banda de testare Accu-Check Inform II (Roche).

4.7. Evaluare comportamentală

Comportamentul a fost evaluat semi-cantitativ, așa cum a fost stabilit de un grup de cercetare al instalației noastre [ 23 ]. Șoarecii au fost plasați într-un cadru experimental timp de un minut și un videoclip a fost înregistrat pentru o analiză ulterioară. Șoarecii nu fuseseră instruiți înainte.

Testul cu fascicul de fascicul: Am plasat șoarecii cu atenție pe o bară de lemn (cu diametrul de 6 mm, lungimea de 50 cm), la 20 cm deasupra solului, până când au ajuns la o aderență fermă. Următorul scor a fost folosit: scorul 1-mouse-ul este puternic sedat și nu se poate ține pe bar; Scorul 2-mouse-ul este sedat, poate ține pe bar pentru un minut, dar nu se mișcă; Scorul 3-mouse explorează pe bară, dar pare ușor sedat și nu ajunge la capătul fasciculului; și scorul 4-mouse-ul se mișcă liber pe bara și ajunge la capătul barei.

Activitatea de mișcare spontană: Șoarecii au fost plasați în mijlocul unui cub transparent de lungime de 30 cm. Următorul scor a fost folosit: 1-mouse-ul este puternic sedat și nu se mișcă; 2-mouse-ul este sedat, arată puțin de explorare pe loc, dar nu se mișcă în nici o direcție; 3 mouse-ul explorează cubul, apare ușor sedat și de obicei nu ajunge la limita cubului; și mouse-ul 4 se mișcă liber în cub și atinge o limită cel puțin o dată.

4.8. Analize statistice

Testele T- test și chi pătrat au fost efectuate în Microsoft Excel pentru analiză statistică.

Logo-ul ijms

Link to Publisher's site
Int J Mol Sci . 2018 Aug; 19 (8): 2462.
Publicat online 2018 Aug 20 doi: 10.3390 / ijms19082462
PMCID: PMC6121440
PMID: 30127309
Salvarea efectelor secundare de 2-deoxiglucoză prin dieta cetogenică/keto
Martin Voss , 1, 2, 3, * Nadja I. Lorenz , 1, 2, 3 Anna-Luisa Luger , 1, 2, 3 Joachim P. Steinbach , 1, 2, 3, 4Johannes Rieger , 5 și Michael W. Ronellenfitsch 1, 2, 3, 4

Recunoasteri

Institutul de Neurooncologie Senckenberg este sprijinit de Fundația Senckenberg și Fundația Hertie. JPS este „profesor de Neurooncologie”, Hertie.

Contribuțiile autorului

MV, NIL, A.-LL, JPS, JR și MWR au conceput și proiectat experimentele; MV, NIL, A.-LL și MWR au efectuat experimentele; MV, NIL, JPS, JR și MWR au analizat datele; MV, JPS, JR și MWR au scris articolul.

Finanțarea

A.-LL a primit finanțare din partea FFF în cadrul „Patenschaftsmodell” și a unei burse în cadrul programului „Clinical Scientist” de la colegiul de cercetare Else Kröner (EKF). MWR a primit o bursă de la Universitatea Cancer Center Frankfurt (UCT) și finanțare de la Frankfurt Research Funding (FFF) „Clinician Scientist Program”.

Conflicte de interes

Autorii nu declară nici un conflict de interese.

Referințe

1. Hanahan D., Weinberg RA Semne de cancer: următoarea generație. Cell. 2011; 144 : 646-674. doi: 10.1016 / j.cell.2011.02.013. PubMed ] [ CrossRef ]
2. Warburg O., Posener K., Negelein E. Über den Stoffwechsel der Carcinomzelle. Biochem. Zeitschr.1924; 152 : 309-344. doi: 10.1007 / BF01726151. CrossRef ]
3. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB Înțelegerea efectului Warburg: Cerințele metabolice ale proliferării celulare. Ştiinţă. 2009; 324 : 1029-1033. doi: 10.1126 / science.1160809.Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
4. Landau BR, Laszlo J., Stengle J., Burk D. Anumite efecte metabolice și farmacologice la pacienții cu cancer cărora li s-au administrat infuzii de 2-deoxi- d- glucoză. J. Natl. Cancer Inst. 1958; 21 : 485-494. PubMed ]
5. Wick AN, Drury DR, Nakada HI, Wolfe JB Localizarea blocului metabolic primar produs de 2-deoxiglucoza. J. Biol. Chem. 1957; 224 : 963-969. PubMed ]
6. Woodward GE, Hudson MT Efectul 2- dezoxi – d- glucozelor asupra glicolizei și respirației tumorale și a țesuturilor normale. Cancer Res. 1954; 14 : 599-605. PubMed ]
7. Mukherjee P., Mulrooney TJ, Marsh J., Blair D., Chiles TC, Seyfried TN Efectele diferențiate ale stresului energetic asupra fosforilării AMPK și apoptozei în tumora cerebrală experimentală și creierul normal. Mol. Cancer. 2008; 7 : 37. doi: 10.1186 / 1476-4598-7-37. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
8. Maher JC, Krishan A., Lampidis TJ Inhibarea ciclului celular și citotoxicitatea indusă de 2-deoxi- d-glucoză în celulele tumorale tratate în condiții hipoxice și aerobe. Cancer Chemother. Pharmacol. 2004; 53: 116-122. doi: 10.1007 / s00280-003-0724-7. PubMed ] [ CrossRef ]
9. Pistollato F., Abbadi S., Rampazzo E., Viola G., Della Puppa A., Cavallini L., Frasson C., Persano L., Panchision DM, Basso G. Hypoxia și succinatul antagonizează efectele 2-deoxiglucose asupra glioblastom. Biochem. Pharmacol. 2010; 80 : 1517-1527. doi: 10.1016 / j.bcp.2010.08.003. PubMed ] [ CrossRef ]
10. Staab A., Loffler J., Said HM, Katzer A., ​​Beyer M., Polat B., Einsele H., Flentje M., Vordermark D. Modularea metabolismului glucozei inhibă acumularea hipoxică a factorului-1a indus hipoxic (HIF-1α) Strahlenther. Onkol. 2007; 183 : 366-373. doi: 10.1007 / s00066-007-1649-6. PubMed ] [ CrossRef ]
11. Kurtoglu M., Gao N., Shang J., Maher JC, Lehrman MA, Wangpaichitr M., Savaraj N., Lane AN, Lampidis TJ Sub normoxia, 2-deoxi- d- glucoza provoacă moartea celulelor în tipuri de tumori selectate nu prin inhibarea glicolizei ci prin interferarea cu glicozilarea N-legată. Mol. Cancerul. 2007; 6 : 3049-3058. doi: 10.1158 / 1535-7163.MCT-07-0310. PubMed ] [ CrossRef ]
12. Dwarakanath BS, Singh D., Banerji AK, Sarin R., Venkataramana NK, Jalali R., Vishwanath PN, Mohanti BK, Tripathi RP, Kalia VK și colab. Studii clinice pentru îmbunătățirea radioterapiei cu 2-deoxi- d- glucoză: starea actuală și perspectivele viitoare. J. Cancer Res. Ther. 2009; 5 (Suppl. S1): S21-S26. doi: 10.4103 / 0973-1482.55136. PubMed ] [ CrossRef ]
13. Singh D., Banerji AK, Dwarakanath BS, Tripathi RP, Gupta JP, Mathew TL, Ravindranath T., Jain V. Optimizarea radioterapiei cancerului cu studii de escaladare a dozei de 2-deoxi- d- glucoză la pacienții cu glioblastom multiform. Strahlenther. Onkol. 2005; 181 : 507-514. doi: 10.1007 / s00066-005-1320-z. PubMed ] [ CrossRef ]
14. Raez LE, Papadopoulos K., Ricart AD, Chiorean EG, Dipaola RS, Stein MN, Rocha Lima CM, Schlesselman JJ, Tolba K., Langmuir VK și colab. Un studiu de fază I de escaladare a dozei de 2-deoxi- d-glucoză administrat singur sau combinat cu docetaxel la pacienții cu tumori solide avansate. Cancer Chemother. Pharmacol. 2013; 71 : 523-530. doi: 10.1007 / s00280-012-2045-1. PubMed ] [ CrossRef ]
15. Laszlo J., Humphreys SR, Goldin A. Efectele analogilor de glucoză (2-deoxi- d- glucoză, 2-deoxi- d-galactoză) asupra tumorilor experimentale. J. Natl. Cancer Inst. 1960; 24 : 267-281. PubMed ]
16. Gridley DS, Nutter RL, Mantik DW, Slater JM Hipertermie și radiații in vivo: Efectul 2-deoxi- d-glucozelor. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1985; 11 : 567-574. doi: 10.1016 / 0360-3016 (85) 90189-0. PubMed ] [ CrossRef ]
17. Vijayaraghavan R., Kumar D., Dube SN, Singh R., Pandey KS, Bag BC, Kaushik MP, Sekhar K., Dwarakanath BS, toxicitate Ravindranath T. acută și efecte cardio – respirator de 2-deoxi- d – glucoză: un sensibilizator radio promițător. Biomed. Environ. Sci. 2006; 19 : 96-103. PubMed ]
18. Mohanti BK, Rath GK, Anantha N., Kannan V., Das BS, Chandramouli BA, Banerjee AK, Das S., Jena A., Ravichandran R., și colab. Îmbunătățirea radioterapiei cancerului cu 2-deoxi- d- glucoză: studiile clinice de fază I / II efectuate pe gliomul cerebral uman. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1996; 35 : 103-111. doi: 10.1016 / S0360-3016 (96) 85017-6. PubMed ] [ CrossRef ]
19. Brodows RG, Pi-Sunyer FX, Campbell RG Controlul neuronal al evenimentelor de contra-reglementare în timpul glucopeniei la om. J. Clin. Investig. 1973; 52 : 1841-1844. doi: 10.1172 / JCI107366.Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
20. Horton RW, Meldrum BS, Bachelard HS Efectele metabolice enzimatice și cerebrale ale 2-deoxi- d-glucozelor. J. Neurochem. 1973; 21 : 507-520. doi: 10.1111 / j.1471-4159.1973.tb05996.x. PubMed ] [ CrossRef ]
21. Maurer GD, Brucker DP, Bahr O., Harter PN, Hattingen E., Walenta S., Mueller-Klieser W., Steinbach JP, Rieger J. Utilizarea diferențiată a corpurilor cetone prin liniile celulare neuroni și gliom: regim alimentar ketogenic ca terapie gliom experimentală. BMC Cancer. 2011; 11 : 315 doi: 10.1186 / 1471-2407-11-315. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
22. Rieger J., Bahr O., Maurer GD, Hattingen E., Franz K., Brucker D., Walenta S., Kammerer U., Coy JF, Weller M., și colab. ERGO: Un studiu pilot privind dieta ketogenică în glioblastomul recidivant. Int. J. Oncol. 2014; 44 : 1843-1852. doi: 10.3892 / ijo.2014.2382. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef]
23. Bohmann F., Mirceska A., Pfeilschifter J., Lindhoff-Last E., Steinmetz H., Foerch C., Pfeilschifter W. Nici o influență a anticoagulării dabigatran asupra transformării hemoragice într-un model experimental de accident vascular cerebral ischemic. Plus unu. 2012; 7 : e40804 doi: 10.1371 / journal.pone.0040804.Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
24. Wang D., Pascual JM, De Vivo D. Sindrom de deficiență a transporterului de glucoză tip 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Stephens K., Amemiya A., editori. GeneReviews ® . Universitatea din Washington; Seattle, WA, SUA: 1993.
25. Fujii T., Ito Y., Takahashi S., Shimono K., Natsume J., Yanagihara K., Oguni H. Rezultatele dietelor ketogenice în sindromul de deficit GLUT1 în Japonia: Un sondaj la nivel național. Brain Dev. 2016; 38 : 628-637. doi: 10.1016 / j.braindev.2016.01.002. PubMed ] [ CrossRef ]
26. Kaufmann P., Engelstad K., Wei Y., Jhung S., Sano MC, Shungu DC, Millar WS, Hong X., Gooch CL, Mao X., și colab. Dichloroacetat provoacă neuropatie toxică în MELAS: Un studiu clinic randomizat, controlat. Neurologie. 2006; 66 : 324-330. doi: 10.1212 / 01.tral.0000196641.05913.27. PubMed ] [ CrossRef ]
27. Marsh J., Mukherjee P., Seyfried TN Sinergia medicamentoasă / dieta pentru administrarea astrocitomului malign la șoareci: 2-deoxi- d- glucoză și dieta ketogenică restricționată. Nutr. Metab. 2008;5 : 33. doi: 10.1186 / 1743-7075-5-33. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
28. Champ CE, Palmer JD, Volek JS, Werner-Wasik M., Andrews DW, Evans JJ, Glass J., Kim L., Shi W. Direcționarea metabolismului cu o dietă ketogenică în timpul tratamentului cu glioblastom multiform. J. Neurooncol. 2014; 117 : 125-131. doi: 10.1007 / s11060-014-1362-0. PubMed ] [ CrossRef ]
29. Seyfried TN, Yu G., Maroon JC, D’Agostino DP Presiunea-puls: O nouă strategie terapeutică pentru gestionarea metabolică a cancerului. Nutr. Metab. 2017; 14 : 19. doi: 10.1186 / s12986-017-0178-2.Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
30. Ostrom QT, Gittleman H., Liao P., Rouse C., Chen Y., Dowling J., Wolinsky Y., Kruchko C., Barnholtz-Sloan J. Raport statistic CBTRUS: Tumorile primare ale creierului și ale sistemului nervos central diagnosticate în Statele Unite în perioada 2007-2011. Neuro Oncol. 2014; 16 (Suppl. S4): iv1-iv63. doi: 10.1093 / neuonc / nou223. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
31. Harrison L., Blackwell K. Hipoxia și anemia: factori în sensibilitate redusă la radioterapie și chimioterapie? Oncolog. 2004; 9 (Suppl. S5): 31-40. doi: 10.1634 / theoncologist.9-90005-31. PubMed ] [ CrossRef ]
32. Hundsberger T., Reardon DA, Wen PY Inhibitorii de angiogeneză în abordarea glioblastomului recurent. Expert Rev. Anticancer Ther. 2017; 17 : 507-515. doi: 10.1080 / 14737140.2017.1322903. PubMed ] [ CrossRef ]
33. Wick W., Gorlia T., Bendszus M., Taphoorn M., Sahm F., Harting I., Brandes AA, Taal W., Domont J., Idbaih A., și colab. Lomustină și Bevacizumab în glioblastom progresiv. N. Engl. J. Med. 2017; 377 : 1954-1963. doi: 10.1056 / NEJMoa1707358. PubMed ] [ CrossRef ]
34. Chinot OL, Wick W., Mason W., Henriksson R., Saran F., Nishikawa R., Carpentier AF, Hoang-Xuan K., Kavan P., Cernea D., et al. Bevacizumab plus radioterapie-temozolomidă pentru glioblastomul nou diagnosticat. N. Engl. J. Med. 2014; 370 : 709-722. doi: 10.1056 / NEJMoa1308345. PubMed ] [ CrossRef ]
35. Curtarello M., Zulato E., Nardo G., Valtorta S., Guzzo G., Rossi E., Esposito G., Msaki A., Pasto A., Rasola A., și colab. Terapia vizată de VEGF modulează în mod stabil fenotipul glicolitic al celulelor tumorale. Cancer Res. 2015; 75 : 120-133. doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-13-2037. PubMed ] [ CrossRef]
36. Eriksson JA, Wanka C., Burger MC, Urban H., Hartel I., von Renesse J., Harter PN, Mittelbronn M., Steinbach JP, Rieger J. Suprimarea fosforilării oxidative conferă rezistență la bevacizumab în gliom experimental. J. Neurochem. 2018; 144 : 421-430. doi: 10.1111 / jnc.14264. PubMed ] [ CrossRef ]
37. Thiepold AL, Lorenz NI, Foltyn M., Engel AL, Dive I., Urban H., Heller S., Bruns I., Hofmann U., Drose S., și colab. Ținta de mamifere a activării complexului de rapamicină 1 sensibilizează celulele gliomului uman la moartea celulară indusă de hipoxie. Creier. 2017; 140 : 2623-2638. doi: 10.1093 / creier / awx196. PubMed ] [ CrossRef ]
38. Ronellenfitsch MW, Brucker DP, Burger MC, Wolking S., Tritschler F., Rieger J., Wick W., Weller M., Steinbach JP Antagonismul țintei mamifere a rapamicinei mediază selectiv efectele metabolice ale inhibiției receptorului factorului de creștere epidermal și protejează celulele gliomului malign uman de moartea celulară indusă de hipoxie. Creier. 2009; 132 : 1509-1522. doi: 10.1093 / creier / awp093. PubMed ] [ CrossRef ]

Articolele din Jurnalul Internațional de Științe Moleculare sunt oferite aici prin amabilitatea Institutului Multidisciplinar de Editură Digitală (MDPI)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6121440/

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.