Creșterea și metastaza cancerului pancreatic inhibat de ascorbat parenteral cu doză mare: mecanisme și un studiu de fază I / IIa

Abstract

Cancerul pancreatic este printre cele mai letale tipuri de cancer cu tratamente slab tolerate. Există un interes tot mai mare în utilizarea de doze mari de ascorbat intravenos (IVC) în tratarea parțială a acestei boli din cauza toxicității sale scăzute. IVC ocolește barierele de biodisponibilitate ale ingestiei orale, asigură concentrații farmacologice în țesuturi și prezintă efecte citotoxice selective în celulele canceroase prin formarea de peroxid. Aici, am dezvăluit în continuare mecanismele sale anti-pancreatice ale cancerului și am efectuat un studiu de fază I / IIa pentru a investiga interacțiunea farmacocinetică dintre IVC și gemcitabină. Ascorbatul farmacologic a indus moartea celulelor în celulele cancerului pancreatic cu medii mutaționale diverse. Ascorbatul farmacologic a epuizat NAD + celular preferențial în celulele canceroase față de celulele normale,ducând la epuizarea ATP și la creșterea robustă a acetilării α-tubulinei în celulele canceroase. În timp ce epuizarea ATP a dus la moartea celulelor, tubulina supraacetilată a dus la inhibarea motilității și a mitozei. Colagenul a crescut, iar tranziția epitelială-mezenchimală a celulelor canceroase (EMT) a fost inhibată, însoțită de inhibarea metastazelor. IVC a fost sigur la pacienți și a arătat posibilitatea de a prelungi supraviețuirea pacientului. Nu a existat nicio interferență în farmacocinetica gemcitabinei prin administrarea IVC. Luate împreună, aceste date au dezvăluit un mecanism multi-țintire al acțiunii anti-cancer a ascorbatului farmacologic, cu toxicitate minimă, și au oferit îndrumări pentru proiectarea unor studii definitive mai mari care să testeze eficacitatea IVC în tratamentul cancerului pancreatic avansat.tubulina supraacetilată a dus la inhibarea motilității și a mitozei. Colagenul a crescut, iar tranziția epitelială-mezenchimală a celulelor canceroase (EMT) a fost inhibată, însoțită de inhibarea metastazelor. IVC a fost sigur la pacienți și a arătat posibilitatea de a prelungi supraviețuirea pacientului.

Luate împreună, aceste date au dezvăluit un mecanism multi-țintire al acțiunii anti-cancer a ascorbatului farmacologic, cu toxicitate minimă, și au oferit îndrumări pentru proiectarea unor studii definitive mai mari care să testeze eficacitatea IVC în tratamentul cancerului pancreatic avansat.Mergi la:

Introducere

În timp ce progresele în terapiile moleculare și țintite au îmbunătățit mult supraviețuirea pacienților cu multe tipuri de cancer, rezultatele tratamentului pentru cancerul pancreatic nu s-au schimbat semnificativ în ultimii 30 de ani. Cancerul pancreatic rămâne cel mai fatal tip de cancer, cu o supraviețuire la 5 ani mai mică de 8% 1 . Dacă nu este tratată, speranța medie de viață este de 3½ luni după diagnostic. Monoterapia cu gemcitabină a fost standardul de îngrijire pentru mai mult de 15 ani 2 . Cu toate acestea, produce o durată medie de supraviețuire globală (OS) de numai 6-7 luni, cu impact redus asupra SG a pacienților cu boală local avansată sau metastatică, care cuprind majoritatea cazurilor 3 . Regimuri combinate recent dezvoltate, cum ar fi FOLFIRINOX 4sau gemcitabina plus nab-paclitaxel 5 au prelungit OS median la 8,5-13 luni, dar cu o sarcină toxică semnificativă adăugată. Numeroase încercări au fost făcute pentru a imbunatati terapii sistemice, dar acestea nu au reușit fie pentru a imbunatati eficacitatea sau adăugate efecte secundare toxice semnificative 6 – 8 .

Recent, a existat un interes crescut în utilizarea ascorbatului intravenos cu doze mari (IVC) ca terapie adjuvantă cu chimioterapie standard 9 . IVC este sigur și fără efecte secundare toxice obișnuite, care însoțesc adesea chimioterapiile. Un studiu de fază I realizat de Hoffer și colab . 10 pacienți tratați cu 24 de pacienți cu cancer terminal au descoperit că IVC dozată la 1,5 g / kg de 3 ori pe săptămână nu prezintă toxicitate semnificativă și, în mod neașteptat, 2 pacienți au avut o boală stabilă. Grupul nostru a raportat un studiu pilot care trata pacienții cu cancer ovarian în stadiul III-IV 9 randomizați la chimioterapia standard cu paclitaxel / carboplatină sau chimioterapia standard plus IVC (75-100 g / perfuzie, de 2 ori pe săptămână timp de 1 an). Tratamentul cu IVC a scăzut substanțial toxicitățile chemo-asociate 9. Timpul mediu pentru progresia bolii / recăderea a fost prelungit cu 8,75 luni în grupul ascorbat + chemio comparativ cu grupul cu chimioterapie, deși studiul nu a fost alimentat statistic pentru a detecta eficacitatea 9 . Două studii mici la pacienții cu cancer pancreatic au fost raportate recent de Monti și colab . 11 și Cullen și colab . 12 ambele folosind IVC (50-100 g / perfuzie de 2-3 ori pe săptămână) împreună cu gemcitabină sau gemcitabină plus inhibitorul EGFR, erlotinib. În ambele studii, IVC nu a crescut nicio toxicitate pentru chimioterapie. În studiul lui Monti, 8 din 9 pacienți au avut contracție tumorală după doar 8 săptămâni de tratament 11. În studiul lui Cullen, în ciuda dimensiunilor sale foarte mici, supraviețuirea generală a fost aproape dublată comparativ cu controalele istorice 12 . O tolerabilitate bună similară a fost raportată la pacienții cu cancer pulmonar cu celule mici (NSCLC) și pacienții cu glioblastom multiform (GBM) 13 . Un studiu mecanicist recent a arătat că ascorbatul a avut efecte citotoxice preferențiale împotriva celulelor canceroase ale colonului mutate KRAS și BRAF 14 . Deoarece mai mult de 90% din cancerele pancreatice adăpostesc mutații KRAS 15 , există un mare potențial de a utiliza IVC ca tratament cu nivel scăzut de toxicitate pentru cancerul pancreatic.

In contrast cu ingestia orala de vitamina C, IVC șuntează fiziologic „control strict“ de concentrații sistemice și atinge concentrații farmacologice de 16 – 18 ani . Concentrațiile farmacologice de ascorbat (Asc) generează peroxid de hidrogen, care prin reacția Haber-Weiss și chimia Fenton induc daune oxidative 9 , 19 – 21 . Citotoxicitatea indusă de ascorbat este aparent selectivă pentru diferite tipuri de celule, cu o toxicitate mai mare față de celulele canceroase față de celulele normale 22. Multe laboratoare au demonstrat la xenogrefele de rozătoare că Asc a redus rata de creștere a diferitelor tumori agresive fără a provoca efecte adverse, cum ar fi cancerul pancreatic, glioblastomul, cancerul ovarian, cancerul de prostată, hepatomul, cancerul de colon, sarcomul, leucemia, mezoteliomul, cancerul de sân și neuroblastom 19 – 21 , 23 – 27 . Studiul nostru anterior, utilizând un panou de 7 linii celulare de cancer pancreatic, a arătat că Asc a sensibilizat toate aceste celule de cancer pancreatic la tratamentul cu gemcitabină, în ciuda mediului lor genetic diferit 28. În acest studiu am investigat mecanismele Asc în inhibarea creșterii cancerului pancreatic și a metastazelor, am evaluat siguranța la adăugarea IVC la chimioterapia cu gemcitabină și am evaluat farmacocinetica pentru a determina dacă există interacțiune medicament-medicament atunci când se administrează concomitent IVC și gemcitabină.Mergi la:

Rezultate

Mecanisme de ascorbat farmacologic care scad viabilitatea celulelor cancerului pancreatic și metastaza

Un grup de 8 linii celulare de cancer pancreatic uman și 1 linie celulară de cancer pancreatic murin au fost expuse la până la 20 mM de ascorbat, care sunt concentrații relevante clinic 19 . Aceste celule adăpostesc diferite combinații de alternanțe genetice, care sunt cele mai frecvent observate la pacienții cu cancer pancreatic, incluzând starea mutațională diferită a KRAS și P53 (Tabelul  S1 ). Viabilitatea în toate celulele canceroase testate a scăzut semnificativ la 24 până la 48 de ore după tratament, în ciuda mediului lor genetic diferit. Pentru toate liniile celulare de cancer pancreatic testate, valorile IC50 au fost sub 5 mM (fig. 1A). În schimb, tratamentul ascorbatului de 20 mM influențează doar viabilitatea minimă a unei celule epiteliale ductale pancreatice non-tumorigene hTERT-HPEN și fibroblaste (WI-38). Adăugarea de catalază, o enzimă care degradează specific de peroxid de hidrogen (H 2 O 2 ), inversat complet moartea celulară indusă de ascorbat în celulele canceroase (Fig. 1A). Pentru a evalua inhibarea pe termen lung a celulelor canceroase, a fost evaluată capacitatea de formare a coloniilor celulelor din agar moale. Ascorbatul la 5 mM a scăzut semnificativ procentul de formare a coloniilor în toate celulele canceroase testate (Fig. 1B). Din nou, catalaza a inversat complet efectul inhibitor al ascorbatului farmacologic. Aceste date confirmă concluziile din studiile anterioare că concentrațiile ridicate de Ascorbat induse selectiv moartea celulelor in celulele canceroase comparativ cu celulele normale, prin H 2 O 2 Formarea 20 , 21 . Dată fiind promiscuitatea H 2 O 2 ca promedicament pentru specii reactive de oxigen (ROS), iar sensibilitatea celulelor la ascorbatului în ciuda o varietate de mutatii, am presupus că ascorbatul farmacologică ar viza cai multiple intr – o celula de cancer. Întrucât datele clinice sugerează că doze mari de Ascorbat intravenoasă are toxicitate minimă 9 – de 12, vizarea mai multor căi pentru tratamentul cancerului este avantajoasă din cauza potențialelor sinergii.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_17568_Fig1_HTML.jpg

figura 1

Ascorbatul a inhibat creșterea cancerului pancreatic și metastaza in vitro . ( A ) Răspunsurile la doză ale celulelor canceroase pancreatice și ale celulelor normale la ascorbat. Celulele au fost expuse la 0-20 mM ascorbat și viabilitatea celulară a fost detectată la 24 de ore prin teste MTT. + pisică, preincubare cu 600 U / ml catalază. Datele reprezintă media ± SD a 3 experimente realizate fiecare în triplu exemplar. ( B ) Formarea coloniilor de celule canceroase pancreatice sub tratament cu ascorbat. Celulele au fost expuse la 5 mM de ascorbat și coloniile au fost numărate la 21-28 de zile. Datele arată% din colonii în raport cu controlul netratat (medie ± SD de ≥3 replici). ( C ) Testele de invazie Matrigel pentru migrația și invazia celulelor cancerului pancreatic. Celulele PANC-1 au fost însămânțate la 1 x 10 4celule / inserție și au fost expuse la ascorbat 1 AscM (Asc). Migrația celulară (fără Matrigel) și invazia (cu Matrigel) au fost detectate la 24 de ore. Graficul cu bare arată numărul mediu de celule migrate / invadate pe câmp. Datele reprezintă ≥ 3 experimente realizate fiecare în trei exemplare. (D) qRT-PCR pentru modificări ale markerilor EMT. Celulele PANC-1 au fost tratate cu 1,5 mM Asc timp de 24 de ore. Datele au fost normalizate la ARNr 18s și apoi comparate cu celulele PANC-1 de control pentru schimbarea pliurilor. Datele reprezintă media ± SD a 2–6 experimente independente. ( E) Western blot în celulele PANC-1 care arată expresia E-cadherinei (E-Cad), vimentinei (Vim) și Snail după tratamentul cu ascorbat. Vinculin era un control de încărcare. Panoul din stânga prezintă pete reprezentative. Graficul cu bare arată densitatea relativă a benzii normalizată la vinculină, analizată prin imaginea J. ( F ) qRT-PCR pentru expresia mMP-2 a MMP-2 în celulele PANC-1 tratate cu ascorbat timp de 24 de ore. Datele reprezintă media ± SD a 3 experimente independente. ( G ) Test de zimografie pe gelatină pentru activitatea enzimatică a MMP-2 după tratamentul cu ascorbat. După tratamentul cu ascorbat, s-au utilizat lizat celular pentru izolarea ARN, transcrierea inversă și qRT-PCR. Mediul supernatant a fost utilizat pentru detectarea activității MMP-2 utilizând zimografie pe gelatină. Datele reprezintă media ± SD a 3 experimente independente.

Interesant, la o concentrație sub-citotoxică de 1 mM, ascorbatul a fost capabil să inhibe migrația și invazia celulelor PANC-1 prin camerele Boyden acoperite cu Matrigel (Fig. 1C), fără a influența viabilitatea celulelor (Fig. S1). Deoarece sa sugerat că tranziția epitelială-mezenchimală a celulelor canceroase (EMT) este etapa inițială a diseminării celulelor canceroase și a metastazei 29 , am examinat mai întâi dacă tratamentul cu ascorbat a influențat caracteristicile EMT ale celulelor canceroase pancreatice. În celulele PANC-1 tratate cu concentrații sub-citotoxice de Asc (1-1,5 mM), expresia E-cadherinei a fost crescută așa cum se arată atât prin RT-PCR, cât și prin Western blot (Fig. 1D, E). În mod consecvent, Snail, un factor major de transcripție EMT, a fost scăzut, iar markerii mezenchimali Vimentin și N-cadherin au fost, de asemenea, scăzuți (Fig. 1D, E). Modelul general în modificările markerilor EMT a indicat atenuarea EMT. Rezultate similare au fost observate într-o altă linie celulară de cancer pancreatic MIA PaCa2 (Fig. S2). În mod remarcabil, mARN-urile colagenilor au fost crescute dramatic în celulele PANC-1 tratate cu Asc (Fig. 1D). În același timp, mARN-urile metaloproteinazelor cu matrice multiplă (MMP) au fost scăzute (Fig. 1D). Am examinat în continuare MMP-2 ca reprezentant 30 . Tratamentul cu Asc a redus doza de expresie a MMP-2 în mod dependent în celulele PANC-1 în 24 de ore de tratament (Fig. 1F). Activitatea gelatinolitică a MMP-2 secretat a scăzut, de asemenea, doza în mod dependent de Asc în mediul supernatant al celulelor PANC-1 (Fig. 1G). Aceste date au indicat faptul că, chiar și la concentrații sub-citotoxice, ascorbatul a exercitat acțiuni în inhibarea migrației și invaziei celulelor cancerului pancreatic.

Deoarece ascorbatul farmacologic a fost sinergic cu paclitaxel 9 și paclitaxel stabilizează microtubulii, am investigat dacă ascorbatul farmacologic ar putea acționa în mod similar, prin acetilarea tubulinei și prin aceasta interferând cu catabolismul său specific în celulele canceroase. Acetilarea α-tubulină robustă a fost găsită în celulele PANC-1 și BxPC-3 tratate cu Asc la concentrații sub-citotoxice și citotoxice (1,25-2,5 mM), în mod dependent de doză (Fig. 2A, B). În schimb, Asc a crescut doar α-tubulina acetilată în celula epitelială ductală pancreatică necanceroasă hTERT-HPEN. H 2 O 2 de tratament mimată efectele Asc, în timp ce catalaza eradicat complet acetilare α-tubulinei indusă de Asc (Fig. 2B). Aceste date indică faptul că mecanismul de acțiune Asc în stabilizarea α-tubulinei este dependentă de H extracelular 2 O 2 generat de Ascorbat farmacologică 21 . Studiile anterioare au raportat deteriorarea ADN-ului și activarea ulterioară a PARP în celulele canceroase tratate cu Asc 9 . Deoarece PARP activat utilizează NAD + ca substrat 20 , 31 , am emis ipoteza că NAD + este scăzut prin tratamentul cu Asc. Într-adevăr, nivelurile de NAD + au scăzut semnificativ în celulele PANC-1 și BxPC-3 în raport cu concentrațiile de Asc, în decurs de 4 ore de la expunere când nu a avut loc moartea celulară (Fig. 2C). Scăderea NAD + a cauzat epuizarea ATP în celulele PANC-1 și BxPC-3 (Fig. 2D), care este legată de moartea celulară ulterioară și de inhibarea proliferării. În celulele hTERT-HPEN necanceroase, concentrațiile de ascorbat de 1,25-2,5 mM nu au avut efecte asupra nivelului de NAD +, doar concentrația de 5 mM a cauzat scăderea NAD +, iar scăderea a fost mai subtilă în comparație cu cea din celulele canceroase (Fig. . 2C). Nu a existat nicio scădere a nivelului de ATP celular în celulele hTERT-HPEN (Fig. 2D). Selectivitatea efectelor Asc poate fi explicată prin două motive: 1) replicarea activă face ca ADN-ul celulelor canceroase să fie mai susceptibil la stresul oxidativ 32 și astfel NAD + are o cerere mai mare de PARP în celulele canceroase; 2) efectul Warburg 9 , 33 a arătat că celulele canceroase depind mai mult de glicoliză pentru producerea de ATP, care este ineficientă în comparație cu calea normală de fosforilare oxidativă. Prin urmare, epuizarea NAD + a indus efecte catastrofale asupra producției de ATP a celulelor canceroase, menținând în același timp celulele normale.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_17568_Fig2_HTML.jpg

Figura 2

Ascorbatul a epuizat NAD + în celulele cancerului pancreatic și a îmbunătățit acetilarea tubulinei. ( A ) Analiza Western blot a α-tubulinei acetilate în celulele cancerului pancreatic (BxPC-3 și PANC-1) și a unei linii de celule epiteliale ductale pancreatice necanceroase imortalizate hTERT-HPNE. Celulele au fost tratate timp de 4 ore. ( B ) Imunofluorescență cu microscopie confocală care arată α-tubulină acetilată în celule tratate cu ascorbat (Asc) 2,5 mM sau peroxid de hidrogen (H 2 O 2 ) 500 µM timp de 4 ore. Asc + Cat, co-tratament cu ascorbat și 600 U / ml catalază timp de 4 ore. Nucleii celulelor au fost contracolorați în albastru cu hoechst33342 (2 mg / ml). ( C ) Modificări ale NAD + și ( D) ATP în celulele PANC-1, BxPC-3 și hTERT-HPNE tratate cu Asc timp de 4 ore. NAD + și ATP au fost detectate prin analiză HPLC-UV și normalizate la conținutul de proteine. Datele reprezintă media ± SD a 2-4 experimente independente. ( E ) Suplimentarea nivelurilor de NAD + celulare PANC-1 protejate cu NAD + cu tratament Asc. ( F ) Western blot care arată acetilarea tubulinei a fost prevenită cu suplimentarea NAD +. ( G ) ATP în PANC-1 a fost protejat cu suplimentarea NAD +. ( H) Formarea coloniilor a fost protejată cu suplimentarea NAD +. Celulele PANC-1 au fost pre-incubate cu NAD + timp de 30 de minute și apoi tratate cu Asc și însămânțate într-un agar moale cu 2 straturi pentru formarea coloniei. Coloniile au fost numărate după 21 de zile de incubație. NAD +, acetilarea tubulinei și ATP au fost detectate la 4 ore de tratament. Datele reprezintă media ± SD a ≥3 experimente independente.

În plus, deoarece NAD + este un co-factor esențial pentru enzima Sirt-2 34 a tubulin deacetilzării , scăderea NAD + a inhibat activitatea Sirt-2 și a dus la creșterea acetilării α-tubulinei, chiar și atunci când nu a existat nicio modificare în Sirt- 2 niveluri de proteine ​​cu tratament Asc (Fig. S2A). Ca dovadă, în celulele PANC-1, suplimentarea NAD + la mediul de cultură celulară a salvat scăderea NAD + cauzată de o concentrație citotoxică de 5 mM Asc (Fig. 2E) inversând astfel acetilarea α-tubulinei mediată de Asc într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2F). ATP celular a fost, de asemenea, salvat (Fig. 2G). Deoarece ATP a fost protejat și excesul de acetilare a tubulinei a fost prevenit, viabilitatea celulară măsurată prin formarea coloniei a fost restabilită la valorile de control (Fig. 2H).

Deoarece acetilarea α-tubulinei se află sub controlul echilibrat al acetil transferazelor (α-TAT) și deacetilazelor (Sirt-2 și HDAC6) 35 , am examinat și α-TAT și HDAC6. Nu s-a găsit nicio modificare în α-TAT cu tratamentul cu ascorbat, în timp ce scăderea expresiei HDAC6 s-a găsit atât în ​​celulele PANC-1 cât și în celulele BxPC-3 tratate cu Asc (Fig. S2A). Cu toate acestea, supraexprimarea HDAC6 în celulele PANC-1 doar a inversat ușor acetilarea α-tubulinei (Fig. S2B) și nu a influențat moartea celulelor indusă de Asc (Fig. S2C). Deși datele de aici nu pot exclude contribuția HDAC6 și a-TAT, un rol major al Sirt-2 este probabil deoarece suplimentarea NAD + a salvat complet acetilarea α-tubulinului indusă de Asc și moartea celulară.

A-tubulina acetilată este asociată cu microtubuli stabili 36 . Aici, am găsit o supra-stabilizare a microtubulilor indusă de tratamentul cu Asc. La patru ore după tratamentul cu Asc, a existat o îmbogățire a fracțiilor cu greutate moleculară ridicată a α-tubulinei acetilate, indicând polimerizarea microtubulilor, imitând efectul paclitaxelului (Fig. 3A). Deoarece se știe că temperatura rece determină depolimerizarea tubulinei 37 , lizatele celulare au fost puse pe gheață (4 ° C), iar polimerizarea tubulinei indusă de Asc s-a găsit stabilă în timp (Fig. 3B). Gradul de acetilare a-tubulin a fost invers corelat cu viabilitatea celulelor cancerului pancreatic după tratamentul cu Asc (PANC-1, r = -0.98287 și BxPC-3, r = -0.88609, prin testul Pears) (Fig. 3C).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_17568_Fig3_HTML.jpg

Figura 3

Ascorbați tubulina polimerizată supra-stabilizată prin creșterea acetilării tubulinei. ( A ) Polimerizarea tubulinei detectată de PAGE nativă în celulele PANC-1 și BxPC-3. După 4 ore de tratament cu Asc sau paclitaxel, celulele au fost lizate în tampon RIPA și supuse PAGE nativ. Acetilarea a-tubulinei a fost confirmată prin SDS PAGE și western blot așa cum se arată în panourile de jos. MW, greutate moleculară în kDa. ( B ) Test de depolimerizare a microtubulilor indus la rece în celulele cancerului pancreatic PANC-1 și BxPC-3. După tratamentul cu Asc pentru 4 h, lizatele celulare au fost expuse fie la 37 ° C, fie au stat pe gheață (4 ° C) pentru timpul indicat și au fost apoi supuse PAGE-ului nativ. ( C) Corelația dintre acetilarea tubulinei și moartea celulară indusă de ascorbat. Toate rezultatele sunt reprezentative ale ≥3 experimente independente.

Inhibarea creșterii cancerului pancreatic și a metastazei de către ascorbat farmacologic într-un model de șoarece

Mecanismele multiple ale acțiunilor Asc în celulele cancerului pancreatic au sugerat că inhibarea creșterii tumorale și a metastazelor ar putea să apară in vivo . Am explorat această posibilitate utilizând un model de cancer pancreatic ortotopic la șoarece. Celulele PANC-1 care exprimă luciferază au fost injectate ortopopic în pancreasul șoarecilor goi. După ce s-a detectat formarea tumorii prin imagistică, șoarecii au fost grupați și tratați cu doze intraperitoneale (IP) de ascorbat (Asc) la 4 g / kg greutate corporală / zi timp de 45 de zile (echivalent cu 1,3 g / kg / zi prin injecție intravenoasă) 20, sau gemcitabină (Gem, 40 mg / kg la fiecare 3 zile, IP), sau combinația de Asc și Gem. Imagistica animalelor vii a arătat că tratamentul cu gemcitabină nu a inhibat creșterea tumorii. În schimb, tratamentul cu Asc singur a redus semnificativ progresul tumorii longitudinal (Fig. 4A, B). Combinația de gemcitabină și ascorbat (Gem + Asc) a obținut o inhibare semnificativă a creșterii tumorii în comparație cu grupurile martor și cu grupuri Gem singure, dar nu a fost diferită în comparație cu grupul singur cu Asc. La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost eutanasiați și s-a detectat greutatea totală a tumorii, iar metastazele vizibile din abdomen au fost examinate prin necropsie brută. O scădere semnificativă a greutății medii a tumorii a fost constatată la grupurile tratate cu Asc și cu grupele tratate cu Gem + Asc, comparativ cu martorii (Fig. 4C). Numărul de metastaze la fiecare șoarece a scăzut semnificativ în grupul Asc și în grupul Gem + Asc, comparativ cu martorii (Fig. 4D). Cu toate acestea, tratamentul Gem singur nu a avut efecte atât asupra greutății tumorii, cât și asupra metastazelor, iar tratamentul Gem + Asc nu a prezentat efecte superioare comparativ cu tratamentul Asc singur.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_17568_Fig4_HTML.jpg

Deschideți într-o fereastră separatăFigura 4

Ascorbatul a inhibat creșterea cancerului pancreatic și metastaza in vivo . ( A ) Imagini bioluminescente ale șoarecilor care poartă xenogrefe pancreatice ortotopice tratate cu ascorbat (Asc), gemcitabină (Gem) sau combinația Asc + Gem. Ziua 0 a indicat începutul tratamentului, care a fost la 2 săptămâni după injecția ortotopică de luciferază, exprimând celulele PANC-1-Leu în pancreasul de șoarece. Ziua 45 a fost sfârșitul experimentului. Asc, tratament cu ascorbat în doză intraperitoneală de 4 g / kg / zi. Gem, gemcitabină la doza intraperitoneală de 40 mg / kg / săptămână. Șoarecii martor (Ctrl) au fost tratați cu soluție salină care avea aceeași osmolaritate ca și injecțiile cu ascorbat. ( B sarcina tumorii) Total per șoarece prin imagistica a fost cuantificată ca fotoni / sec / cm 2 (media ± SEM). (C ) Greutatea totală a tumorii (medie ± SEM) și ( D ) numărul de leziuni metastatice la fiecare șoarece, determinat prin necropsie în ziua 45. ( E ) Analiza imunohistochimică a antigenului nuclear celular proliferant (PCNA) cu probe tumorale fixate în formalină. Graficul cu bare (dreapta) reprezintă numărul mediu de celule PCNA pozitive pe câmp. Au fost analizate 15 câmpuri din 3 tumori diferite din fiecare grup. ( F ) Analiza histologică a mitozei pe felii tumorale colorate cu H&E. Graficul cu bare (dreapta) arată indicele mitotic, care a fost numărul mediu de mitoze din 4 câmpuri separate. Au fost examinate tumori de la 4 șoareci din fiecare grup. ( G) Colorarea tricromului Masson pentru conținutul de colagen în țesuturile tumorale. Colagenul a fost colorat în albastru și citoplasma roz. Graficul cu bare reprezintă media ± SD a% colagenului de zonă / secțiune transversală. Au fost analizate 15 câmpuri din 3 tumori diferite din fiecare grup. ( H ) colorare H&E pentru analiza desmoplasiei în țesuturile tumorale de șoarece. Graficul cu bare arată desmoplasia reprezentată ca% din suprafață conține răspuns desmoplastic. Au fost examinate tumori de la 4 șoareci din fiecare grup (medie ± SD). ( I ) Colorarea cu tricrom a lui Masson pentru colagen și fibroza ficatului de la șoareci martori și tratați cu ascorbat. Nu s-a observat colagen sau fibroză. ( J) Detectarea qRT-PCR a 24 de tipuri de transcrieri de colagen în probe de tumori de șoarece. Cinci tumori din fiecare grup au fost detectate în duplicate. Bara prezintă modificări ale pliurilor în comparație cu șoarecii de control în Media ± SD. * P <0,05; ** P <0,01; și *** P <0,001. ( K ) Western blot în probe de tumori de șoarece care prezintă modificări în CK-19 și Snail. Vinculin a fost utilizat ca control al încărcării. ( L ) Imunohistochimie în probe de tumori de șoarece care prezintă acetilare a-tubulină. Graficul cu bare reprezintă media ± SD a% suprafeței de colorare pozitivă pentru α-tubulină acetilată pe secțiune transversală. Au fost analizate 11-17 câmpuri din 3 tumori diferite din fiecare grup. ( M ) O schemă simplificată care prezintă mecanisme de ascorbat care inhibă creșterea cancerului pancreatic și metastaza.

Analiza imunohistochimică pe probe tumorale a arătat că antigenul nuclear celular proliferant (PCNA), un indicator al proliferării celulare, a scăzut substanțial în tumorile tratate cu Asc (Fig. 4E). Indicele mitotic a scăzut, de asemenea, semnificativ în grupul tratat cu Asc, după cum a fost analizat prin colorarea hematoxilinei și a eozinei (colorarea H&E) (Fig. 4F). Creșteri masive ale conținutului de colagen au fost găsite în stroma tumorală a șoarecilor tratați cu Asc (Fig. 4G). RT-PCR a detectat creșterea semnificativă a sintezei multiple de colagen în tumorile de șoareci cu tratament cu Asc (7 transcripții ale genei colagenului au fost reglate în sus în grupul Asc, 6 în grupul Gem și 14 în grupul Gem + Asc) (Fig. 4J). Având în vedere toate transcrierile, expresia genei colagenului în grupul Asc și în grupul Gem + Asc a avut o creștere semnificativă față de grupul martor (P = 0,001 și respectiv 0,00003); gemcitabina singură nu a crescut expresia genei colagenului (P = 0,08); iar grupul Gem + Asc a avut o creștere semnificativă față de grupul Gem (P = 0,05). În consecință, desmoplasia în stroma tumorală a fost semnificativ îmbunătățită la șoarecii tratați cu Asc (Fig. 4H). Nu s-a găsit o astfel de creștere a colagenului sau a fibrozei la ficatul șoarecilor tratați cu Asc (Fig. 4I). De asemenea, în concordanță cu datele celulare, scăderea melcului a fost constatată în tumorile de șoarece tratate cu ascorbat (Fig. 4K), iar molecula epitelială CK-19 a arătat creșteri robuste ale probelor tumorale de la șoareci tratați cu Asc (Fig. 4K). Acetilarea α-tubulinei a fost semnificativ crescută în tumorile șoarecilor tratați cu Asc și în șoarecii tratați cu Gem + Asc, în timp ce tratamentul Gem nu a influențat acetilarea α-tubulinei (Fig. 4L).

Luate împreună, aceste date in vitro și in vivo au indicat faptul că ascorbatul farmacologic a inhibat creșterea cancerului pancreatic și metastaza printr-un mecanism pro-oxidativ, a indus ulterior epuizarea NAD + / ATP selectiv în celulele canceroase și a dus la inhibarea proliferării celulare și inducerea celulei. moarte. Depleția NAD + a cauzat, de asemenea, afectarea activității Sirt-2, a dus la dezechilibru al acetilării α-tubulinei și ulterior a inhibat mitoza și metastaza. Tratamentul farmacologic cu ascorbat a modificat stroma tumorii prin îmbunătățirea producției de colagen. EMT a fost inhibat, cu mecanisme demne de investigații suplimentare. Aceste mecanisme multiple ale ascorbatului farmacologic funcționează împreună și duc la inhibarea creșterii tumorii și a metastazelor în tumora pancreatică (Fig. 4M).

Siguranța și răspunsul tumoral al IVC la pacienții cu cancer pancreatic

Am efectuat un studiu de fază I / IIa pentru a investiga siguranța și interacțiunea farmacocinetică la pacienții cu cancer pancreatic care utilizează IVC în combinație cu gemcitabină. Șapte participanți au fost înscriși inițial și, atunci când siguranța a fost confirmată, au fost înscriși încă 7 participanți (Tabelul  S2a, b ). Doisprezece dintre cei 14 subiecți înscriși au finalizat evaluarea farmacocinetică de fază I compusă din farmacocinetica IVC și gemcitabină fiecare ca medicamente unice, urmată de măsurarea farmacocinetică a IVC combinată cu gemcitabina (Tabelul  S3 ). Acești 12 pacienți au intrat în faza IIa și au primit ascorbat intravenos (IVC) de 3 ori săptămânal la dozele stabilite și în asociere cu gemcitabină în doza și programul stabilite de medicul oncolog curant (Tabelul  S4). Tratamentul a continuat până la progresia tumorii sau retragerea pacientului din alte motive (Tabelul  S2b ).

Dintre cei 12 participanți au finalizat tratamentul de fază IIa, 50% (6/12) au supraviețuit peste 1 an, iar 8,3% (1/12) au supraviețuit mai mult de 2 ani după diagnostic. Supraviețuirea mediană globală (OS) a fost de 15,1 luni (fig. 5A). Șase pacienți au prezentat progresia bolii pe baza criteriilor RECIST și au fost eliminați din studiu (dintre acești șase: 5 au avut tratament înainte de înscriere, 1 fără pretratament); 1 m-am retras voluntar din motive personale; și 4 au fost retrase pe baza unor probleme medicale care nu au legătură cu progresia bolii și 1 s-a retras deoarece răspunsul la tratament a făcut ca participantul să fie eligibil pentru operație. Supraviețuirea mediană fără progresie (SFP) a fost de 3 luni.Figura 5

Supraviețuirea globală (OS) și supraviețuirea fără progresie (SFP) a celor 12 participanți care au finalizat studiul de fază IIa. Liniile punctate au arătat supraviețuirea globală mediană.

Un participant (# 8) a avut un răspuns tumoral remarcabil la regimul de tratament. Înainte de înscriere, participantul a avut carcinom ductal pancreatic în stadiul III, nu a reușit tratamentul cu FOLFIRINOX și a fost în progresie a bolii. Pacientul nu a fost eligibil pentru operație din cauza îngrijorării că masa tumorii implică o artă pancreatică mezenterică (Fig. S3A). După înscrierea în studiu, participantul a primit în total 70 de doze de IVC (64 de doze de 100 de grame / perfuzie în faza II și 6 doze de 25-75 g / perfuzie în faza I) și gemcitabină (715 mg / m 2) pentru 9 cicluri. Imagistica a arătat stabilizarea / restrângerea tumorii și îmbunătățirea aspectului marginilor care au devenit mai distincte (Fig. S3A). Pacientul a fost apoi determinat adecvat pentru rezecție chirurgicală. Tumora rezecată a fost examinată prin analiză patologică. În concordanță cu datele noastre preclinice, niveluri ridicate de conținut de colagen au fost găsite în stroma tumorii, comparativ cu probele de carcinom ductal pancreatic de la pacienții netratați, tratați cu FOLFIRINOX sau tratați cu gemcitabină (Fig. S3B).

Evenimentele adverse semnificative de gradul 3 sau mai mare (SAE) sunt prezentate în tabel 1și niciunul nu a fost considerat secundar terapiei de investigație. Evenimentele adverse multiple de gradul 1 și 2 s-au dovedit a fi obișnuite în cursul terapiei convenționale și s-au rezolvat fără progres la gradul 3 sau mai mult. Evenimentele adverse atribuibile IVC au fost greață și sete de gradul 1. Nu s-a constatat că alte evenimente adverse sunt legate de IVC.

tabelul 1

Evenimente adverse semnificative (SAE) la gradul 3 sau mai mult pentru toți cei 14 participanți.

IDEvenimente adverse semnificativeStare preexistentăRezoluţieRecenzie DSMB
1Grad 3 gastro-intestinal: defecțiune a stentului biliar care necesită spitalizaredadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
2Fără SAE
3Fără SAE
4Fără SAE
5Fără SAE
6Fără SAE
7Cardiovascular de gradul 3: cu presiune toracică, tahicardie, dispnee și furnicături ale brațului stângdadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
7Pulmonar de gradul 3: dispneedadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
8Sistemul urinar de gradul 3: Sepsis bacterii gram negative din ITUdadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
9Gradul 3 Musculo-scheletice: fractură de șold din cădere, cu reparații chirurgicale ulterioare și reabilitareNudaNu are legătură cu medicamentul de studiu
10Grad 3 gastro-intestinal: defecțiune a stentului biliar care necesită spitalizaredadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
10Cardiovascular de gradul 3: bloc cardiac de gradul IIIdadaNu are legătură cu medicamentul de studiu
10Cardiovascular de gradul 5: infarct miocardic cu edem pulmonar severdaNuNu are legătură cu medicamentul de studiu
11Gradul 5 gastrointestinal: debut acut, dureri abdominale severe la domiciliu, cu administrarea de doze crescânde de opioide; a devenit obținut și nu a putut fi resuscitat de EMTdaNuNu are legătură cu medicamentul de studiu
12Fără SAE
13Neurologic de gradul 3: eveniment cerebrovasculardaNuNu are legătură cu medicamentul de studiu
14Fără SAE

Deschideți într-o fereastră separată

Efectul IVC asupra farmacocineticii Gemcitabinei

Parametrii farmacocinetici ai unui participant individual pentru gemcitabină, principalul său metabolit dFdU și ascorbat au fost evaluați pentru cei 12 participanți, prin administrarea fiecăruia dintre IVC și gemcitabină singuri și apoi în combinație (Tabelele  S3 , S4 ). Farmacocinetica gemcitabinei a fost așa cum era de așteptat, cu un timp de înjumătățire (t ½) de 15-20 minute, reflectând dezaminarea rapidă a metabolitului său primar dFdU, care are un t ½ mai lung de ~ 12 ore. Cmax și ASC ale gemcitabinei au fost, de asemenea, comparabile cu rapoartele din literatură 38 (Fig. 6A – C). Nu a existat nicio diferență pentru Cmax și ASC între valorile obținute când gemcitabina a fost administrată de ea însăși (Gem) și când a urmat IVC (Gem + IVC), fie ne-normalizată (Tabelul  S5 ), fie normalizată la doza de gemcitabină (adică Cmax / D și AUC / D) (Fig. 6A, B). Doar T ½ de gemcitabină a fost scurtată cu 9% (P = 0,003) atunci când a fost combinată cu IVC (Fig. 6C). Deoarece gemcitabina este metabolizată rapid în dFdU, este puțin probabil ca această scădere a t ½ (de la 0,28 h la 0,25 h) să fie semnificativă din punct de vedere clinic și trebuie luată în considerare farmacocinetica dFdU. Pentru dFdU, valorile pentru t ½, Cmax și ASC au fost toate comparabile cu parametrii farmacocinetici raportați anterior 38 și nu au prezentat nicio diferență atunci când gemcitabina a fost administrată cu ascorbat (Fig. 6D – F).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_17568_Fig6_HTML.jpg

Figura 6

Parametrii farmacocinetici ai gemcitabinei, dFdU și ascorbatului atunci când IVC și gemcitabina au fost folosite singure sau în combinație. Au fost prezentate Cmax, AUC și t ½ de gemcitabină ( A – C ), dFdU ( D – F ) și ascorbat ( G – I ). Cmax și ASC au fost normalizate la doză. Graficele liniare arată parametrii obținuți pentru fiecare subiect din administrarea unui singur medicament (stânga) și administrarea combinată (dreapta). Graficele de cutie indică mediana și percentilele 5, 25, 75 și 95 pentru toți pacienții și valorile periferice.

Am determinat în continuare farmacocinetica IVC atunci când este utilizată singură sau în combinație cu gemcitabină (Fig. 6G – I). Cmax nu a fost modificat. Atât t ½ cât și ASC, cu toate acestea, au fost afectate de gemcitabină. T ½ a scăzut cu 25% și ASC a scăzut cu 20% pentru ascorbat atunci când a fost utilizat cu gemcitabină.

În general, aceste date au indicat în mod clar că nu a avut loc nicio modificare semnificativă a dispoziției gemcitabinei legate de utilizarea IVC, cu toate acestea, a fost observată o creștere mică a clearance-ului ascorbatului atunci când a fost administrat concomitent cu gemcitabină.Mergi la:

Discuţie

Studiile anterioare indică faptul că formarea de peroxid de hidrogen (H 2 O 2 ) conduce acțiunile ascorbatului farmacologic împotriva celulelor canceroase 19 – 21 . În urma acestui mecanism, studiile au arătat că catalaza și / sau alte enzime antioxidante din celule contribuie în mod important la sensibilitatea celulei la ascorbat farmacologic, așa cum sunt trans-metale care sporesc formarea ROS 13 , 24 , 39 , 40 . Se propune ca aceste mecanisme să facă celulele canceroase mai sensibile decât celulele normale, deoarece în aceste studii s-a constatat că celulele canceroase au o capacitate scăzută de metabolizare a H 2 O 2sau capacitatea crescută de a forma ROS. Un studiu recent a sugerat că o creștere a superoxid intracelulare și H 2 O 2 in celulele canceroase pot perturba metabolismul de ioni și spori ciclismul redox intracelular de ascorbat de ioni de fier care contribuie la toxicitate selectivă și chimio-radio sensibilizare 13 . Cu toate acestea, sensibilitatea la tratamentul cu ascorbat farmacologic pare să implice mai multe componente celulare și căi funcționale pe lângă capacitatea de metabolizare a H 2 O 14 , 20 , 41 – 43. Ceea ce este evident este că formarea de peroxid, mediată de ascorbat farmacologic, este esențială pentru moartea celulară. O înțelegere aprofundată trebuie să se formeze încă asupra mecanismelor celulare / moleculare ale acțiunii ascorbatului farmacologic. Postulăm că ROS induse de Asc au mecanisme multiple de acțiune asupra celulelor. În concordanță cu această ipoteză, se sugerează mulți factori importanți în determinarea destinului celulelor canceroase după expunerea la ascorbat farmacologic, cum ar fi factorul indus de hipoxie (HIF) 44 , starea KRAS / BRAF 14 , starea P53 45 , repararea ADN 42 , glucoza și / sau transportoare de ascorbat 46. Am arătat în studii anterioare că ROS generat de Asc induce deteriorarea ADN-ului și epuizarea ATP, provocând activarea AMPK în aval și inhibarea mTOR 9 . Aici sunt descrise mai multe răspunsuri celulare care nu au fost elucidate înainte. În aval până la deteriorarea ADN-ului indusă de H 2 O 9 , NAD + celular scade ca efect al activării PARP 47 . Scăderea NAD + declanșează efecte diferite în celulele cancerului pancreatic față de celulele normale. În primul rând, ATP în celulele cancerului pancreatic scade și duce la moartea celulelor, în timp ce celulele normale își mențin nivelul de ATP. Acest fenomen are o rădăcină în metabolismul glucozei neregulat în celulele canceroase, cunoscut sub numele de Efectul Warburg 33 , 48 , 49, ceea ce face celulele canceroase mai puțin eficiente în producția de ATP decât celulele normale, deoarece acestea depind de o proporție mai mare de glicoliză pentru ATP, în timp ce celulele normale depind mai mult de fosforilarea oxidativă. În al doilea rând, lipsa NAD + inhibă activitatea Sirt-2 și induce acetilarea tubulinei, care la rândul său perturbă dinamica microtubulilor. Acest lucru influențează celulele canceroase care sunt supuse activ mitozei și migrației. Mai mult, ascorbatul farmacologic a inhibat EMT, un proces important care contribuie la metastaza cancerului. Mecanismele inhibiției EMT induse de Asc merită o investigație suplimentară. În cele din urmă, ascorbatul farmacologic a îmbunătățit sinteza colagenului în stroma tumorii. În ciuda rapoartelor controversate despre efectul colagenului crescut în progresia tumorii 50 – 54, colagenul crescut prin tratament farmacologic cu ascorbat este asociat cu restricția invaziei tumorale în experimentul nostru pe animale și în descrierea pacientului.

Direcționarea mai multor căi de celule canceroase fără a afecta celulele normale ar putea reduce toxicitățile și probabilitatea apariției rezistenței, ambele fiind probleme grave în chimioterapiile cancerului. Datele de aici arată efecte multi-targeting ale ascorbatului farmacologic care favorizează moartea / inhibarea celulelor canceroase în raport cu celulele normale. Astfel, sensibilitatea celulară la ascorbat farmacologic nu este probabil să fie determinată de o singură cale 43. Pentru un cancer care are eterogenitate complicată, cum ar fi cancerul pancreatic, acțiunile multi-targeting ale ascorbatului sunt avantajoase, deoarece dacă inhibarea unei ținte este incompletă sau în cele din urmă eșuează din cauza mutațiilor, efectele tratamentului ar putea fi exercitate prin alte căi. O problemă potențială pentru agenții multi-targeting sunt toxicitățile colaterale / multiple. Cu toate acestea, ascorbatul farmacologic este sigur, cu puține evenimente adverse la animale și oameni 55 . Combinarea acestui agent unic cu chimioterapia curentă a primei linii sau radioterapia poate duce la efecte sinergice suplimentare în tratarea tumorilor.

FDA a aprobat recent adăugarea nab-paclitaxelului la gemcitabină (Nabpax + Gem) pentru tratamentul cancerului pancreatic avansat 5 . Într-un studiu de fază III, Nabpax + Gem a îmbunătățit supraviețuirea mediană globală (OS) la 8,5 luni comparativ cu 6,7 luni cu gemcitabină. Supraviețuirea la un an a fost de 35% și supraviețuirea la 2 ani a fost de 9%, creșteri semnificative comparativ cu 22% și 4% la gemcitabină. Câteva studii de fază II mai mici, cu 11-30 de pacienți, au obținut 12-13,5 luni OS median cu Nabpax + Gem 56 – 59 . Cu toate acestea, Nabpax + Gem a crescut neutropenia, oboseala și neuropatia de gradul 3 sau mai mare 5. Studiul nostru de fază I / IIa cu date la 12 pacienți a arătat un SO median încurajator de 15,1 luni prin adăugarea unei doze mari de ascorbat intravenos la gemcitabină (IVC + Gem). Supraviețuirea la 1 an a fost de 50%, iar la 2 ani a fost de 8,3%. Ne dăm seama că acest proces nu poate fi comparat cu procesul de fază III folosind Nabpax + Gem. Studiul nostru a avut un design cu un singur braț, dimensiune mică a eșantionului, un amestec de pacienți tratați anterior și pacienți netratați și un amestec de PDAC avansat local (4 participanți, 33%) și PDAC metastatic (8 participanți, 67%) la înscriere. Rezultatele noastre sunt de acord cu un alt studiu publicat care utilizează un tratament similar pentru IVC + Gem 12, în care 9 subiecți cu cancer pancreatic în stadiul IV dovedit cu biopsie au fost tratați cu IVC de două ori pe săptămână și gemcitabină co-curentă, cu scopul de a stabili tolerabilitatea și siguranța IVC. Doza și durata tratamentului IVC au fost similare atât în ​​studiul raportat, cât și în studiul nostru: escaladarea de la 15 g la nivelul vizat de ascorbat plasmatic de ~ 350 mg / dL (variind de la 50 la 125 g / perfuzie de ascorbat). Durata tratamentului a fost de 69-555 de zile. Dintre cei 9 pacienți au finalizat tratamentul, 6 au menținut sau au îmbunătățit starea de performanță. Supraviețuirea globală a atins 13 ± 2 luni, similar cu cele 15,1 luni din studiul nostru. În special, pacientul din studiul nostru care a devenit eligibil pentru rezecție a avut boală metastatică în stadiul III la înscriere și nu a reușit FOLFIRINOX.

Am observat un amestec de boală stabilă, răspuns parțial și progresie a bolii în cursul studiului nostru. Deși criteriile RECIST 60 au fost utilizate pentru a evalua răspunsurile tumorale, răspunsul general nu a fost selectat pentru a fi discutat atunci când studiul a fost proiectat. Cu accent pe analiza farmacocinetică de fază I a ascorbatului cu gemcitabină și intenția de a se înscrie pe baza participanților necesari pentru a determina acel efect, este puțin probabil să fie capabil să evalueze în mod adecvat răspunsul în aceste numere limitate. De asemenea, studiul nostru nu a observat o supraviețuire îmbunătățită fără progresie (SFP), comparativ cu gemcitabina sau Nabpax + Gem 5. Cu excepția dimensiunii reduse a eșantionului, lipsa îmbunătățirii PFS ar putea fi secundară ratei ridicate a abandonului școlar și a procentului ridicat de pacienți pre-tratați. Opt din cei doisprezece (67%) pacienți au eșuat în tratamentele anterioare și au avut o boală progresivă în momentul înscrierii. Șase pacienți (50%) au prezentat progresia bolii în timpul studiului. Un pacient a avut răspuns tumoral și a fost eliminat din studiu pentru rezecția chirurgicală a tumorii, 4 au renunțat din cauza problemelor medicale fără legătură și 1 a renunțat din motive personale. Acești pacienți eliminați sau renunțați nu au avut neapărat progresul bolii în timpul procesului, dar retragerile lor au fost luate în considerare ca timp pentru progresul la calcularea PFS, provocând o subestimare a PFS pentru acest studiu. Un studiu mai mare, mai definitiv, de fază II / III este necesar pentru a detecta eficacitatea și beneficiile IVC.

Independent de promisiunile privind eficacitatea tratamentului, un avantaj evident pentru utilizarea IVC în tratamentul cancerului este toxicitatea scăzută, care este acum demonstrată în mod repetat în mai mult de 10 studii clinice recente 61. Din nou, IVC nu a adăugat efecte adverse semnificative (SAE) la chimioterapia cu gemcitabină. IVC nu modifică Cmax și ASC ale gemcitabinei, ci a scurtat timpul de înjumătățire al gemcitabinei (T1 / 2) cu 4 minute, ceea ce a fost semnificativ statistic. Cu toate acestea, întrucât gemcitabina T1 / 2 are doar 16,7 minute și este metabolizată rapid în dFdU, care are un timp de înjumătățire mult mai lung de 12 ore, evaluarea timpului de înjumătățire dFdU este mai semnificativ clinic. IVC nu modifică timpul de înjumătățire al dFdU și nici nu modifică Cmax sau ASC ale dFdU. Se poate concluziona că IVC nu influențează farmacocinetica gemcitabinei în nici un mod semnificativ clinic. Aceste date sunt primele care descriu în detaliu că ascorbatul nu modifică parametrii farmacocinetici ai unui agent chimioterapeutic standard.Mergi la:

Metode

Etapa clinică de fază I / IIa

Un studiu prospectiv de fază I / IIa a fost efectuat la Universitatea din Kansas Medical Center (KUMC) Cancer Center și KU Integrative Medicine Clinic din Kansas City, Kansas. Comitetul de evaluare instituțională KUMC a aprobat protocolul și tuturor participanților li s-a acordat consimțământul scris în scris. Supravegherea a fost asigurată de Centrul pentru Evaluare și Cercetare a Medicamentului din cadrul Administrației pentru Alimente și Medicamente din SUA, Divizia de Produse Medicamentoase Oncologice, cu o misiune de investigare a medicamentului nou pentru ascorbat injectabil. Procesul a fost înregistrat cu http://www.ClinicalTrials.gov pe 24 th , 2011 și li se atribuie un identificator NCT01364805 . Toate metodele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante.

Supravegherea independentă a siguranței și monitorizării datelor a fost asigurată de Comitetul KUMC Cancer Center Data and Monitoring (DSMB). Obiectivul principal a fost evaluarea siguranței combinând doze mari de ascorbat IV (IVC) cu chimioterapie cu gemcitabină în tratamentul cancerului pancreatic local avansat sau metastatic care nu este eligibil pentru rezecție chirurgicală. Obiectivul secundar a fost de a determina dacă a existat interacțiune medicament-medicament în ceea ce privește farmacocinetica. Pacienții cu cancer pancreatic nerezecabil sau metastatic nou diagnosticat care au refuzat chimioterapia combinată sau pacienții care au progresat pe un tratament care nu conține gemcitabină au fost eligibili pentru screening ulterior, necesitându-i să fie ambulatori cu statutul de performanță de la 0 la 2 al Grupului oncologic cooperativ estic (ECOG); au statutul normal de glucoză-6-fosfat dehidrogenază (G6PD);au funcție renală, hepatică și hematologică adecvată; să poată primi chimioterapie pe durata prescrisă; și nu utilizați produse din tutun.

Șapte subiecți au fost înscriși inițial și atunci când siguranța a fost confirmată, au fost înscriși 7 participanți suplimentari pentru a totaliza 14 participanți. Toți participanții au primit chimioterapie cu gemcitabină în conformitate cu standardul de îngrijire și toate dozele au fost administrate în Centrul de Cancer KUMC sub îndrumarea medicului oncolog tratant cu supraveghere de către co-investigator oncolog. Doza injectabilă de acid ascorbic (Mylan, Inc. anterior Bioniche Pharma) a fost stabilită prin creșterea dozei așa cum este descris în altă parte 9 (Tabelul  S3 ).

Pentru faza I, după creșterea dozei de IVC, a fost efectuată evaluarea farmacocinetică a ascorbatului singur, urmată de evaluarea farmacocinetică a gemcitabinei și a metabolitului său 2-fluoro-2′-deoxiuridină (dFdU), apoi IVC și gemcitabină au fost combinate în aceeași zi. și a fost efectuată evaluarea farmacocinetică (Tabelul  S3 ). În acest timp, au fost colectate date de siguranță. Apoi, subiecții au intrat în faza IIa și au primit IVC 3 × săptămânal în asociere cu doza și programul stabilit de gemcitabină, până la progresia tumorii determinată de criteriile de evaluare a răspunsului în tumorile solide (RECIST) sau retragerea din alte motive. Toate evenimentele nepotrivite au fost evaluate, utilizând criteriile terminologice comune pentru Institutul Național al Cancerului (NCI) pentru evenimente adverse versiunea 4.

Datele farmacocinetice au fost colectate pe o perioadă de 24 de ore și au fost caracterizate la 12 subiecți. Probele seriale din extracțiile de sânge au fost procesate în decurs de 30 de minute de la achiziție, iar plasma a fost depozitată la -80 ° C până când a fost analizată. Dozele de gemcitabină și ascorbatul au fost 1000 mg / m 2 și 100 g, respectiv, cu câțiva subiecți au primit doze reduse, determinat prin tratarea oncolog (tabelul  S4 ). Compensarea pentru dozele reduse a fost încorporată prin utilizarea transformării normalizării dozei pentru valorile Cmax și ASC.

Model de șoarece ortotopic pentru cancer pancreatic

Toate procedurile au urmat protocolul animal aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Kansas Medical Center. Celulele PANC-1 au fost transfectate cu gena luciferazei care exprimă lentivirus și au fost selectate celule de expresie stabilă (PANC-1-Luc). Șoarecilor femele Ncr nu / nu la vârsta de 4-6 săptămâni li s-a efectuat o mică laparotomie subcostală în timpul anesteziei, cu 2 × 10 5Celulele PANC-1-Luc injectate în coada pancreasului. Șoarecii au fost imaginați la o săptămână după implantarea celulelor pentru a monitoriza formarea tumorii. Pentru imagine, fiecărui șoarece i s-au administrat 150 mg / kg D-luciferină prin injecție intraperitoneală. Animalele au fost scanate folosind un sistem de imagistică IVIS (Waltham, MA). Șoarecii au fost grupați pentru a face sarcina tumorală inițială uniformă (n = 8 per grup) și apoi au fost tratați cu injecție intraperitoneală de ascorbat (Asc, 4 g / kg pe zi), sau gemcitabină (Gem, 40 mg / kg la fiecare 3 zile) , sau combinația Asc și Gem. Grupul martor a fost tratat cu ser fiziologic cu osmolaritate echivalentă cu soluția de ascorbat. Șoarecii au fost imaginați longitudinal. Tratamentul a durat 45 de zile. La necropsie, sarcina tumorală totală a fost ponderată, leziunile metastatice din abdomen au fost examinate prin necropsie brută. Probele de țesut au fost fixate în formaldehidă,sau congelate la fața locului pe gheață uscată și stocate la -80 ° C pentru analize suplimentare.

metode de analiză

Concentrațiile de gemcitabină și 2-fluor-2′-deoxiuridină (dFdU) au fost detectate folosind un test UPLC-MS / MS 38 validat complet . Concentrațiile de ascorbat au fost detectate folosind o metodă stabilită utilizând HPLC cuplată cu detectarea electrochimică 62 . Cmax, AUC și t ½ au fost calculate utilizând software-ul Phoenix WinNonlin® v. 6.4.

Analiza culturii și viabilității celulare

hTERT-HPEN (celule epiteliale ductale pancreatice umane imortalizate) a fost furnizat de Dr. Shrikant Anant de la Universitatea din Kansas Cancer Center (Kansas City, KS). L3.6 a fost furnizat de Dr. Liang Xu la Universitatea din Kansas (Lawrence, KS). Pan02 a fost donat de dr. Anthony Sandler la Children’s Medical Medical Center (Washington DC). Toate celelalte linii celulare au fost obținute din colecția American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Toate celulele au fost cultivate în mediu recomandat suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 100 unități / ml penicilină / streptomicină la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Tratamentele au fost efectuate la o confluență de ~ 70% pentru toate celulele (aproximativ 0-0,4 nmoli / celulă de ascorbat). Testul MTT (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromură) a fost utilizat pentru a determina viabilitatea celulară.Cristalul de formazan a fost dizolvat în DMSO și culoarea măsurată la 570 nm.

Supraviețuirea celulară pe termen mai lung a fost măsurată folosind testul formării coloniilor într-un sistem de agar moale cu 2 straturi, cu stratul superior conținând 0,5% și stratul inferior conținând 0,75% agar. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri la 1.000 până la 2.500 de celule pe godeu (aproximativ 2-5 nmoli / celulă de ascorbat). Ascorbat, catalază sau NAD + au fost adăugați în momentul însămânțării. Coloniile au fost colorate cu cristal violet și numărate după 21-28 de zile.

Transfectarea genelor

Celulele PANC-1 au fost proiectate pentru a supraexprima un pavilion etichetat HDAC6. Plasmida recombinantă pcDNA3.1 + -HDAC6-flag și vectorul gol pcDNA3.1 + au fost achiziționate de la Addgene (Cambridge, MA). Plasmidele au fost transfectate în celulele PANC-1 cu reactiv lipofectamină TM 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY) conform instrucțiunilor producătorului. G418 a fost utilizat pentru selectarea clonelor pozitive. Doza optimă de G418 a fost determinată prin testul MTT (IC 50  = 0,625 mg / ml). La 36 de ore după transfecție, celulele au fost trecute și au fost cultivate în mediu DMEM conținând 10% FBS și 1 mg / ml G418. După 6 zile, G418 a fost redus la 0,5 mg / ml. Clonele rezistente la G418 au fost culese după două săptămâni și apoi extinse. Expresia stabilă a HDAC6 în clone a fost confirmată folosind western blot.

Izolarea ARN, sinteza ADNc și PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din celule folosind reactiv TRIZOL (Invitrogen, Grand Island, NY) sau ARN nucleospinic (Macherey-Nagel, Deer Park, NY) conform protocoalelor producătorilor. Sinteza cNDA a fost realizată cu 1 pg de ARN total utilizând kitul Omniscript RT conform protocolului producătorului (Quiagen, Valencia, CA) și a fost diluată 1: 5 în apă nanopură autoclavată pentru analiză ulterioară. PCR în timp real a fost efectuat utilizând sistemul de detectare Bio-Rad iQ iCycler cu supermix verde iQ SYBR (Bio-Rad Laboratories Ltd, Hercules, CA). Reacțiile au fost efectuate într-un volum total de 10 pl, incluzând 5 pl de supermix 2X iQ SYBR verde, 1 pl primeri la 20 pmol / pl și 1 pl șablon ADNc. Toate reacțiile au fost efectuate în cel puțin trei exemplare pentru fiecare probă. Datele au fost normalizate la 18 S ARNr, sau GAPDH.

Testul invaziei Matrigel

Celulele au fost însămânțate în inserțiile de camere Boyden (BD Biosciences, San Jose, CA) care au fost fie pre-acoperite sau nu acoperite cu matrigel (0,1 mg / ml), la 1 x 10 4 celule per inserție în% FBS 0,5 conținând mediu. Mediul din godeuri conținea 10% FBS ca chimio-atractiv. După 24 ore de incubație, celulele invadate în partea inferioară a membranei au fost fixate cu 4% para formaldehidă timp de 2 minute, permeabilizate cu 100% metanol timp de 20 minute, urmate de colorare cu 0,05% cristal violet timp de 15 minute la 37 ° C . Celulele neinvadente din partea superioară a membranei au fost îndepărtate cu tampon de bumbac. Fotografiile au fost făcute din cinci câmpuri aleatorii pentru fiecare inserție. Au fost numărate celulele din cele cinci câmpuri aleatorii.

Zimografie cu gelatină

Mediile supernatante din cultura de celule PANC-1 au fost supuse electroforezei pe 10% gel SDS poli acril amidă conținând 0,2% gelificare (Sigma, St. Louis, MO). După clătire adecvată în tampon de clătire (1 M Tris pH8,0, 1 M CaCl2, 2,5% Triton X-100), gelul a fost echilibrat timp de 30 min în tampon de incubație (1 M Tris pH8,0, 1 M CaCl2) și apoi incubat în tampon de incubare proaspăt la 37 ° C timp de 16 ore. Gelul a fost colorat cu Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, Hercules, CA) timp de 1-2 ore, și apoi colorat în 10% metanol și 5% acid acetic. Benzile clare corespunzătoare activității MMP au fost analizate prin densitometrie optică prin software ImageJ.

Imunofluorescență și imunohistochimie

Celulele crescute pe plăci cu 96 de godeuri au fost tratate și apoi fixate în 4% paraformaldehidă și blocate în tampon de blocare (1X PBS + 5% ser de capră + 0,3% Triton X-100) la temperatura camerei timp de 1 oră. A-tubulina anti-acetilată (Abcam, diluție 1: 4000 în 1XPBS + 1% BSA + 0,3% triton X-100) a fost incubată la 4 ° C pentru o noapte. Anticorpul secundar conjugat cu făină Alexa 488 (1: 500) a fost incubat timp de 2 ore în întuneric. Nucleii au fost vizualizați cu 1 mg / ml Hoechst33342.

Secțiunile tumorale încorporate în parafină (5 µM grosime) au fost deparafinizate și rehidratate prin incubare în serie în xilen, 100%, 95% etanol și apă. Peroxidul endogen a fost blocat cu 3% peroxid de hidrogen la temperatura camerei timp de 10 minute. Recuperarea antigenului a fost efectuată în tampon de citrat la fierbere timp de 5 min, urmată de o temperatură sub fierbere timp de 10 min. Anticorpul primar anti-PCNA (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) a fost incubat peste noapte la 4 ° C. Anticorpul secundar biotinilat și DAB au fost utilizate pentru a dezvolta pete (kit Vectastain ABC –AP, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Toate secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină.

Colorarea tricromului Masson pentru colagen

Conținutul de colagen în secțiunile tumorale și hepatice a fost detectat utilizând trusa de colorare a tricromului Masson (Sigma, St. Louis, MO), în conformitate cu protocolul producătorului. Citoplasma a fost colorată de culoare roz până la roșu, iar colagenul a fost colorat în albastru.

PAGE nativă, PAGE SDS și western blot

Celulele au fost lizate cu tampon RIPA (25 mM Tris pH 7,6, 150 mM NaCI, 0,5% deoxolat de sodiu, 1% NP-40, suplimentate cu 1 mM DTT și inhibitori de protează), centrifugate și s-a folosit supernatant. Cuantificarea proteinelor a folosit metoda BCA (setul de testare a proteinelor Pierce BCA, Waltham, MA). SDS-PAGE și Western blot au fost efectuate ca rutină. Protocolul PAGE nativ a fost adaptat dintr-o publicație recentă 63. Pe scurt, 10 ug proteină au fost amestecate cu volum egal de 2 × tampon de probă nativă (laboratoare Bio-Rad, Ltd, Hercules, CA) și au fost încărcate pe geluri de 8% poli acrilamidă fără SDS. Electroforeza a fost la 60 V timp de 3,5-4 ore. Proteinele au fost transferate în membrana PVDF pentru o noapte peste 4 ° C. Diluările pentru anticorpii primari au fost anti-α-tubulină, anti-HDAC6 anti-vinculin, (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), α-tubulin anti-acetilat (1: 5000), anti-Sirt-2 ( 1: 500), anti-α-TAT (1: 1000), anti-pavilion (1: 1000) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A fost utilizat un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean policlorală anti-iepure și anti-șoarece (HRP) (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Bloturile au fost stabilite folosind un kit de detectare a chemiluminiscenței (substrat de blocare western Pierce ECL, Thermo Scientific, Rockford, IL).

Statistici

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SYSTAT 11 pentru testul T al elevilor pentru comparație între 2 grupuri și folosind ANOVA cu analiza post-hoc Bonferroni și Holm atunci când comparația implică mai mult de 2 grupuri, cu toate grupurile comparate simultan. O diferență a fost considerată semnificativă la nivelul p <0,05. Analiza de corelație a folosit testele Pears standard. Diferențele dintre parametrii farmacocinetici individuali pentru gemcitabină, dFdU și ascorbat determinate din tratamentul cu un singur agent și din tratamentul combinat au fost evaluate utilizând un test t asociat atunci când seturile de date îndeplineau testul de normalitate Shapiro-Wilk sau folosind testul de rang semnat Wilcoxon când normalitatea nu a fost respectată.

Aprobarea studiului

Studiul clinic a fost aprobat de Comitetul de revizuire instituțională KUMC. Toți participanții au primit acordul informat scris la înscriere. Supravegherea a fost asigurată de către Centrul pentru Evaluarea și Cercetarea Medicamentelor din cadrul Administrației pentru Alimente și Medicamente din SUA, Divizia de Produse Medicamentoase Oncologice, cu o misiune de investigare a medicamentului nou pentru acidul ascorbic injectabil. Procesul a fost înregistrat pe http://www.ClinicalTrials.gov și i sa atribuit un identificator NCT01364805 . Supravegherea independentă a siguranței și monitorizării datelor a fost asigurată de Comitetul de siguranță și monitorizare a datelor din centrul de cancer KUMC (DSMB).

Protocolul animalelor a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Kansas Medical Center.Mergi la:

Material suplimentar electronic

Cifre și tabele suplimentare (1.0M, docx)Mergi la:

Mulțumiri

Mulțumim doctorilor. Shrikant Anant, Liang Xu și Antony Sandler pentru furnizarea de celule utilizate în experimentele noastre. Mulțumim dr. Xiaogang Li și dr. Lavakumar Reddy Aramadhaka de la Kansas Medical Center (KUMC) pentru furnizarea de anticorpi Sirt-2, respectiv anticorp α-tubulin acetilat. Mulțumim Dr. Partha Kasturi de la KUMC pentru ajutor în unele dintre experimente și reactivi. Mulțumiri speciale coordonatorului studiului, Jean Sunega, pentru asistența sa capabilă în toate fazele studiului. Mulțumim Mylan, Inc., fostă Bioniche Pharma, pentru furnizarea de ascorbat injectabil. Lucrarea a fost finanțată printr-o subvenție de la Fundația Memorială Lotte & John Hecht (studiu clinic), subvențiile instituționale ale Societății Americane de Cancer în 2010 (QK84541F) și Grantul pilot al Universității din Kansas Cancer Center 2010. Autorii PCV și ML au fost susținuți de subvenția intramurală DK053212-11 de la NIDDK,NIH.Mergi la:

Contribuțiile autorului

CQ și JD au conceptualizat studiul; CQ, KP, RD, JY, PC, PCV și ML au proiectat și efectuat studiile mecaniciste; CQ, KP, JY și PC au proiectat și efectuat studii pe animale; ZP și AG au efectuat o parte din studiile mecaniciste și analiza datelor; JD și SW au conceput și supervizat studiul clinic; GR și CQ au efectuat analiza farmacocinetică; FF a efectuat analiza patologică; CQ, KP, JD și ML au scris prima schiță a manuscrisului; toți autorii au participat la interpretarea datelor și la modificarea manuscrisului.Mergi la:

Note

Mergi la:

Interese concurente

Autorii declară că nu au interese concurente.Mergi la:

Note de subsol

Material suplimentar electronic

Informații suplimentare însoțesc această lucrare la 10.1038 / s41598-017-17568-8.

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutru în ceea ce privește revendicările jurisdicționale din hărțile publicate și afilierile instituționale.Mergi la:

Informații despre colaboratori

Jeanne A. Drisko, e-mail: ude.cmuk@oksirdj .

Qi Chen, e-mail: ude.cmuk@nehcq .Mergi la:

Referințe

1. Societatea Americană a Cancerului. Fapte și cifre despre cancer 2017 (2017).2. Burris H, III și colab. Îmbunătățiri în supraviețuire și beneficii clinice cu gemcitabina ca terapie de primă linie pentru pacienții cu cancer pancreatic avansat: un studiu randomizat. Jurnalul de Oncologie Clinică. 1997; 15 : 2403. doi: 10.1200 / JCO.1997.15.6.2403. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]3. Renouf D, Moore M. Evoluția terapiei sistemice pentru cancerul pancreatic avansat. Expert Rev. Anticancer Ther. 2010; 10 : 529–540. doi: 10.1586 / era.10.21. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]4. Kim R. FOLFIRINOX: un nou tratament standard pentru cancerul pancreatic avansat? Lancet Oncol. 2011; 12 : 8-9. doi: 10.1016 / S1470-2045 (10) 70237-0. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]5. Von Hoff DD, și colab. Supraviețuirea crescută în cancerul pancreatic cu nab-paclitaxel plus gemcitabină. N Engl J Med. 2013; 369 : 1691–1703. doi: 10.1056 / NEJMoa1304369. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]6. Moore MJ și colab. Erlotinib plus gemcitabină comparativ cu gemcitabină în monoterapie la pacienții cu cancer pancreatic avansat: un studiu de fază III al Institutului Național al Cancerului din Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 2007; 25 : 1960–1966. doi: 10.1200 / JCO.2006.07.9525. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]7. Dahan L, și colab. Combinație 5-fluorouracil, acid folinic și cisplatină (LV5FU2-CDDP) urmată de gemcitabină sau secvența inversă în cancerul pancreatic metastatic: rezultatele finale ale unui studiu strategic randomizat de fază III (FFCD 0301) Intestin. 2010; 59 : 1527–1534. doi: 10.1136 / gut.2010.216135. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]8. Oberstein PE, Saif MW. Tratament de primă linie pentru cancerul pancreatic avansat. Repere din „Simpozionul ASCO pentru cancerul gastrointestinal 2011”. San Francisco, CA, SUA. 20–22 ianuarie 2011. JOP. 2011; 12 : 96–100. [ PubMed ] [ Google Scholar ]9. Ma Y și colab. Ascorbatul parenteral cu doze mari crește chimiosensibilitatea cancerului ovarian și reduce toxicitatea chimioterapiei. Știință medicina tradițională. 2014; 6 : 222ra218. [ PubMed ] [ Google Scholar ]10. Hoffer LJ și colab. Studiu clinic de fază I cu acid ascorbic iv în malignitate avansată. Ann Oncol. 2008; 19 : 1969–1974. doi: 10.1093 / annonc / mdn377. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]11. Monti DA, și colab. Evaluarea fazei I a acidului ascorbic intravenos în combinație cu gemcitabină și erlotinib la pacienții cu cancer pancreatic metastatic. Plus unu. 2012; 7 : e29794. doi: 10.1371 / journal.pone.0029794. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]12. Welsh JL, și colab. Ascorbat farmacologic cu gemcitabină pentru controlul cancerului pancreatic metastatic și ganglionar pozitiv (PACMAN): rezultate dintr-un studiu clinic de fază I. Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 71 : 765–775. doi: 10.1007 / s00280-013-2070-8. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]13. Schoenfeld, JD și colab . O2- și H2O2 mediate de întreruperea metabolizării Fe cauzează sensibilitatea diferențială a NSCLC și a celulelor canceroase GBM la ascorbat farmacologic. Cancer Cell , 10.1016 / j.ccell.2017.02.018 (2017). [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]14. Yun J și colab. Vitamina C ucide selectiv celulele canceroase colorectale mutante KRAS și BRAF prin vizarea GAPDH. Ştiinţă. 2015; 350 : 1391–1396. doi: 10.1126 / science.aaa5004. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]15. Jones S și colab. Căile de semnalizare de bază în cancerele pancreatice umane relevate de analize genomice globale. Ştiinţă. 2008; 321 : 1801–1806. doi: 10.1126 / science.1164368. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]16. Graumlich JF și colab. Modelul farmacocinetic al acidului ascorbic la voluntari sănătoși de sex masculin în timpul epuizării și repletiei. Pharm Res. 1997; 14 : 1133–1139. doi: 10.1023 / A: 1012186203165. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]17. Levine M, și colab. Farmacocinetica vitaminei C la voluntarii sănătoși: dovezi pentru o dietă recomandată. Proc Natl Acad Sci SUA. 1996; 93 : 3704-3709. doi: 10.1073 / pnas.93.8.3704. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]18. Padayatty SJ și colab. Farmacocinetica vitaminei C: implicații pentru administrarea orală și intravenoasă. Ann Intern Med. 2004; 140 : 533-537. doi: 10.7326 / 0003-4819-140-7-200404060-00010. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]19. Chen Q și colab. Dozele farmacologice de ascorbat acționează ca un prooxidant și scad creșterea xenogrefelor tumorale agresive la șoareci. Proc Natl Acad Sci SUA. 2008; 105 : 11105–11109. doi: 10.1073 / pnas.0804226105. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]20. Chen Q și colab. Ascorbatul în concentrații farmacologice generează selectiv radical ascorbat și peroxid de hidrogen în lichidul extracelular in vivo . Proc Natl Acad Sci SUA. 2007; 104 : 8749–8754. doi: 10.1073 / pnas.0702854104. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]21. Chen Q și colab. Concentrațiile farmacologice de acid ascorbic distrug selectiv celulele canceroase: acțiune ca un pro-medicament pentru a furniza peroxid de hidrogen în țesuturi. Proc Natl Acad Sci SUA. 2005; 102 : 13604–13609. doi: 10.1073 / pnas.0506390102. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]22. Parrow NL, Leshin JA, Levine M. Ascorbat parenteral ca tratament terapeutic pentru cancer: o reevaluare bazată pe farmacocinetică. Semnal redox antioxidant. 2013; 19 : 2141-2156. doi: 10.1089 / ars.2013.5372. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]23. Du J și colab. Mecanisme de citotoxicitate indusă de ascorbat în cancerul pancreatic. Clin Cancer Res. 2010; 16 : 509–520. doi: 10.1158 / 1078-0432.CCR-09-1713. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]24. Verrax J, Calderon PB. Concentrațiile farmacologice de ascorbat sunt atinse prin administrare parenterală și prezintă efecte antitumorale. Radic liber Biol Med. 2009; 47 : 32–40. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2009.02.016. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]25. Pollard HB, Levine MA, Eidelman O, Pollard M. Acidul ascorbic farmacologic suprimă creșterea tumorii simgenice și metastazele în cancerul de prostată refractar la hormoni. În Vivo. 2010; 24 : 249–255. [ PubMed ] [ Google Scholar ]26. Takemura Y și colab. Doza mare de acid ascorbic induce moartea celulelor în celulele mezoteliomului. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 394 : 249–253. doi: 10.1016 / j.bbrc.2010.02.012. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]27. Deubzer B și colab. Citotoxicitatea mediată de H (2) O (2) a concentrațiilor farmacologice de ascorbat la celulele neuroblastomului: rolul potențial al lactatului și feritinei. Cell Physiol Biochem. 2010; 25 : 767–774. doi: 10.1159 / 000315098. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]28. Espey MG și colab. Ascorbatul farmacologic se sinergizează cu gemcitabina în modelele preclinice de cancer pancreatic. Radic liber Biol Med. 2011; 50 : 1610–1619. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2011.03.007. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]29. Rhim AD, și colab. EMT și diseminarea preced formarea tumorii pancreatice. Celulă. 2012; 148 : 349–361. doi: 10.1016 / j.cell.2011.11.025. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]30. Ellenrieder V și colab. Rolul MT-MMPs și MMP-2 în progresia cancerului pancreatic. Int J Rac. 2000; 85 : 14–20. doi: 10.1002 / (SICI) 1097-0215 ​​(20000101) 85: 1 <14 :: AID-IJC3> 3.0.CO; 2-O. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]31. Chiarugi A, Moskowitz MA. Biologie celulara. PARP-1 – un autor al morții celulare apoptotice? Ştiinţă. 2002; 297 : 200–201. [ PubMed ] [ Google Scholar ]32. Pero RW și colab. Stresul oxidativ induce deteriorarea ADN-ului și inhibă repararea leziunilor ADN induse de N-acetoxi-2-acetilaminofluorena în leucocitele periferice umane mononucleare. Cancer Res. 1990; 50 : 4619–4625. [ PubMed ] [ Google Scholar ]33. Warburg O, Wind F, Negelein E. Metabolismul tumorilor în corp. J Gen Physiol. 1927; 8 : 519–530. doi: 10.1085 / jgp.8.6.519. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]34. Sauve AA, Youn DY. Sirtuine: NAD (+) – mecanism și reglare deacetilază dependente. Opinia actuală în biologia chimică. 2012; 16 : 535-543. doi: 10.1016 / j.cbpa.2012.10.003. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]35. Perdiz D, Mackeh R, Pous C, Baillet A. Intrările și ieșirile acetilării tubulinei: mai mult decât o simplă modificare post-translațională? Semnalizare celulară. 2011; 23 : 763–771. doi: 10.1016 / j.cellsig.2010.10.014. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]36. Hammond JW, Cai D, Verhey KJ. Modificări ale tubulinei și funcțiile lor celulare. Opinia actuală în biologia celulară. 2008; 20 : 71–76. doi: 10.1016 / j.ceb.2007.11.010. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]37. Kirkland WL, Burton PR. Stabilizarea ciclică mediată de adenozină monofosfat a neurotului celulei neuroblastomului de șoarece microtubuli expuși la temperaturi scăzute. Nat New Biol. 1972; 240 : 205–207. doi: 10.1038 / newbio240205a0. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]38. Marangon E și colab. Determinarea simultană a gemcitabinei și a principalului său metabolit, dFdU, în plasmă la pacienții cu cancer pulmonar avansat cu celule mici, prin cromatografie lichidă de înaltă performanță-spectrometrie de masă tandem. J Spectrom de masă. 2008; 43 : 216–223. doi: 10.1002 / jms.1293. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]39. Doskey CM și colab. Celulele tumorale au capacitatea scăzută de a metaboliza H2O2: Implicații pentru ascorbat farmacologic în terapia cancerului. Biologie redox. 2016; 10 : 274–284. doi: 10.1016 / j.redox.2016.10.010. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]40. Du J, Wagner BA, Buettner GR, Cullen JJ. Rolul fierului labil în toxicitatea ascorbatului farmacologic. Radic liber Biol Med. 2015; 84 : 289–295. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2015.03.033. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]41. Venturelli S și colab. Impactul epigenetic al ascorbatului asupra celulelor melanomului metastatic uman. Frontiere în oncologie. 2014; 4 : 227. doi: 10.3389 / fonc.2014.00227. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]42. Castro ML, McConnell MJ, Herst PM. Radiosensibilizarea prin ascorbat farmacologic în celulele glioblastomului multiform, celulele gliale umane și HUVEC depinde de capacitățile lor de antioxidant și de reparare a ADN-ului și nu este specifică cancerului. Radic liber Biol Med. 2014; 74 : 200–209. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2014.06.022. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]43. Levine M, Violet PC. Date Triumph at C. Cancer Cell. 2017; 31 : 467–469. doi: 10.1016 / j.ccell.2017.03.008. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]44. Sinnberg T și colab. Citotoxicitatea ascorbatului indusă de ROS este atenuată de hipoxie și HIF-1alfa în liniile celulare canceroase NCI60. J Cell Mol Med. 2014; 18 : 530-541. doi: 10.1111 / jcmm.12207. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]45. Kim J și colab. Activitate antitumorală îmbunătățită a vitaminei C prin p53 în celulele canceroase. Radic liber Biol Med. 2012; 53 : 1607–1615. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2012.07.079. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]46. Hong SW, și colab. SVCT-2 în cancerul de sân acționează ca un indicator pentru tratamentul cu L-ascorbat. Oncogene. 2013; 32 : 1508–1517. doi: 10.1038 / onc.2012.176. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]47. Ma E și colab. Ascorbatul farmacologic induce moartea celulelor neuroblastomului prin deteriorarea ADN mediată de peroxidul de hidrogen și reducerea glicolizei celulelor canceroase. Radic liber Biol Med. 2017; 113 : 36–47. doi: 10.1016 / j.freeradbiomed.2017.09.008. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]48. Xu RH și colab. Inhibarea glicolizei în celulele canceroase: o strategie nouă pentru a depăși rezistența la medicamente asociată cu defectul respirator mitocondrial și hipoxia. Cancer Res. 2005; 65 : 613–621. [ PubMed ] [ Google Scholar ]49. Ahmad IM și colab. Mitocondrialul O2 * și H2O2 mediază stresul indus de lipsa de glucoză în celulele canceroase umane. J Biol Chem. 2005; 280 : 4254-4263. doi: 10.1074 / jbc.M411662200. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]50. Karnoub AE și colab. Celulele stem mezenchimale din stroma tumorală promovează metastaza cancerului mamar. Natură. 2007; 449 : 557-563. doi: 10.1038 / nature06188. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]51. Merika EE, Syrigos KN, Saif MW. Desmoplasia în cancerul pancreatic. Putem lupta cu el? Gastroenterol Res Pract. 2012; 2012 : 781765. doi: 10.1155 / 2012/781765. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]52. Bissell MJ, Radisky D. Punerea tumorilor în context. Nat Rev Cancer. 2001; 1 : 46–54. doi: 10.1038 / 35094059. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]53. Dvorak HF. Tumori: răni care nu se vindecă. Asemănări între generarea stromei tumorale și vindecarea rănilor. N Engl J Med. 1986; 315 : 1650–1659. doi: 10.1056 / NEJM198612253152606. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]54. Ozdemir BC, și colab. Epuizarea fibroblastelor asociate carcinomului și fibroza induce imunosupresia și accelerează cancerul pancreasului cu supraviețuire redusă. Celula cancerului. 2014; 25 : 719-734. doi: 10.1016 / j.ccr.2014.04.005. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]55. Chen Q, Polireddy K, Chen P, Dong R. Călătoria neasfaltată a vitaminei C în tratamentul cancerului. Poate J Physiol Pharmacol. 2015; 93 : 1055-1063. doi: 10.1139 / cjpp-2014-0509. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]56. Zhang DS și colab. Studiu de fază I / II al nab-paclitaxelului legat de albumină plus gemcitabină administrat pacienților chinezi cu cancer pancreatic avansat. Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 71 : 1065-1072. doi: 10.1007 / s00280-013-2102-4. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]57. Goldstein, D. și colab . nab-Paclitaxel plus gemcitabină pentru cancerul pancreatic metastatic: supraviețuire pe termen lung dintr-un studiu de fază III. J Natl Cancer Inst 107 , 10.1093 / jnci / dju413 (2015). [ PubMed ]58. Chiorean EG, și colab. CA19-9 scade la 8 săptămâni ca predictor al supraviețuirii globale într-un studiu randomizat de fază III (MPACT) cu nab-paclitaxel săptămânal plus gemcitabină versus gemcitabină singură la pacienții cu cancer pancreatic metastatic. Ann Oncol. 2016; 27 : 654–660. doi: 10.1093 / annonc / mdw006. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]59. Ueno H și colab. Studiu de fază I / II al nab-paclitaxel plus gemcitabină pentru pacienții japonezi naivi cu chimioterapie cu cancer pancreatic metastatic. Cancer Chemother Pharmacol. 2016; 77 : 595-603. doi: 10.1007 / s00280-016-2972-3. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]60. Eisenhauer E și colab. Noi criterii de evaluare a răspunsului în tumorile solide: ghidul RECIST revizuit (versiunea 1.1) Eur J Cancer. 2009; 45 : 288–247. doi: 10.1016 / j.ejca.2008.10.026. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]61. Chen Q, Polireddy K, Chen P, Dong R. Călătoria neasfaltată a vitaminei C în tratamentul cancerului. Poate J Physiol Pharmacol. 2015; 93 : 1-9. doi: 10.1139 / cjpp-2014-0394. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]62. Ma Y și colab. O metodă convenabilă pentru măsurarea concentrațiilor de ascorbat din sânge la pacienții care primesc ascorbat intravenos cu doză mare. Jurnalul Colegiului American de Nutriție. 2013; 32 : 187–193. doi: 10.1080 / 07315724.2013.791167. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]63. Bollu LR și colab. Implicarea palmitatului sintetizat de novo și EGFR mitocondrial în fuziunea mitocondrială a celulelor canceroase indusă de EGF. Ciclul celulei. 2014; 13 : 2415–2430. doi: 10.4161 / cc.29338. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]


Articolele din rapoartele științifice sunt furnizate aici prin amabilitatea Nature Publishing Group

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google

Comentezi folosind contul tău Google. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.