Reprogramarea indusă de radiații a celulelor canceroase de sân

Abstract

Se crede că cancerele de sân sunt organizate ierarhic cu un număr mic de celule stem de cancer de sân (BCSC) capabile să recrească o tumoare, în timp ce descendenții lor nu au această capacitate. Recent, mai multe grupuri au raportat îmbogățirea pentru BCSC atunci când cancerele de sân au fost supuse unui tratament anticancer clasic. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza acestei îmbogățiri sunt incomplet înțelese. Folosind non-BCSC-uri sortate din mostre de pacienți, am descoperit că radiațiile ionizante au reprogramat celulele diferențiate de cancer de sân în BCSC-uri induse (iBCSC). iBCSC-urile au arătat o formare crescută a mamosferei, o tumorigenitate crescută și au exprimat aceleași gene legate de tulpina ca și BCSC-urile din probele neiradiate. Reprogramarea a avut loc într-o subpopulație poliploidă de celule, a coincis cu reexprimarea factorilor de transcripție Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4,

Concluzionăm că radiațiile pot induce un fenotip BCSC în celulele canceroase de sân diferențiate și că acest mecanism contribuie la creșterea numărului de BCSC observat după tratamentul anticancer clasic.

Celule stem. Manuscris de autor; disponibil în PMC 2013 1 mai.

Publicat în forma finală editată ca:

Celule stem. 2012 mai; 30(5): 833–844.

doi:  10.1002/stem.1058

PMCID: PMC3413333

NIHMSID: NIHMS392738PMID: 

22489015

Chann Lagadec , 

Erina Vlashi , 

Lorenza Della Donna , 

Carmen Dekmezian , 

1 și 

Frank Pajonk 1, 2, *

Informații despre autor Informații despre drepturi de autor și licență Declinare a răspunderiiV

Date asociate

Materiale suplimentare

Mergi la:

Introducere

Datele clinice și preclinice recente susțin opinia că multe tipuri de cancer solide, inclusiv cancerele de sân, sunt organizate ierarhic cu un număr mic de celule stem canceroase (CSC) capabile să recrească o tumoră, în timp ce descendenții lor nu au această caracteristică 1 , 2 . Clinic, CSC-urile au fost asociate cu rate mai mari de recidivă și metastaze 3 , 4 . Este important că CSC din cancerul de sân și gliom s-au dovedit a fi relativ rezistente la radiații și chimioterapie în comparație cu descendenții lor non-tumorigenici 5 – 7 . În concordanță cu aceste rapoarte, mai multe grupuri au raportat îmbogățirea pentru CSC atunci când cancerele solide au fost supuse unor tratamente anticancerigene clasice 5 ,6 , 8 .

Folosind un sistem in vitro , am cuantificat numărul de CSC de sân (BCSC) care au supraviețuit după tratamentul cu radiații în mostre de pacienți, precum și în mai multe linii de cancer de sân. Când am comparat numărul absolut de CSC mamare (BCSC) care au supraviețuit tratamentului cu radiații cu numărul de BCSC care se aștepta să supraviețuiască, am constatat o îmbogățire profundă a BCSC-urilor după expunerea la radiații ionizante și o creștere atât de drastică a numărului nu ar putea fi explicată cu ușurință prin diferenţe de sensibilitate la radiaţii şi/sau prin repopulare activă. Aici raportăm că radiațiile ionizante au indus un fenotip BCSC în celulele anterior netumorigenice. Această tranziție a fost dependentă de Notch și a coincis cu reglarea în sus a factorilor de transcripție utilizați pentru a genera celule pluripotente induse din celule normale diferențiate.

Mergi la:

Metode

Cultură de celule

Liniile de celule de cancer de sân uman SUM159PT au fost achiziționate de la Asterand (Asterand, Inc., MI). Liniile de celule umane MCF-7 și T47D de cancer de sân au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). SUM159PT-ZsGreen-cODC, MCF-7-ZsGreen-cODC, T47D-ZsGreen-cODC, au fost obținute așa cum este descris în Vlashi și colab. 9. Celulele SUM159PT au fost cultivate în fază de log-creștere în mediu F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplimentat cu 5% ser fetal bovin (Sigma Aldrich, St Louis, MO), penicilină (100 unități/ml) și streptomicina (100 ug/ml). ) (ambele Invitrogen) și insulină (5 ug/ml) și hidrocortizon (1 ug/ml). Celulele MCF-7 și T47D au fost cultivate în fază de log-creștere în Mediu Eagle Modificat Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, penicilină și streptomicina. Toate celulele au fost crescute într-un incubator umidificat la 37°C cu 5% CO2.

Iradierea

Celulele crescute ca monostraturi au fost iradiate la temperatura camerei folosind un iradiator experimental cu raze X (Gulmay Medical Inc. Atlanta, GA) la o rată de doză de 2,789 Gy/min pentru timpul necesar pentru aplicarea unei doze prescrise. Martorii corespunzătoare au fost iradiați simulat. Evaluarea proliferării celulare, numărul de BCSC și testele de formare a sferei au fost efectuate la 5 zile după radiație.

Citometrie în flux

BCSC-urile au fost identificate pe baza activității lor scăzute de proteazom 9 , 10 folosind sistemul de raportare ZsGreen-cODC. La cinci zile după radiație, celulele au fost tripsinizate și expresia ZsGreen-cODC a fost evaluată prin citometrie în flux (MACSQuant Analyzer, Miltenyi). Celulele au fost definite ca „ZsGreen-cODC pozitiv” dacă fluorescența în canalul FL-1H a depășit nivelul de fluorescență de 99,9% din celulele martor goale transfectate cu vector.

Testul Aldefluor și separarea populației ALDH1-negative prin FACS

Genestier şi colab. au raportat anterior că celulele stem de cancer de sân ar putea fi izolate pe baza activității lor ridicate ALDH1 2 . Kit-ul ALDEFLUOR (StemCell Technologies, Durham, NC, SUA) a fost utilizat pentru a izola populația fără activitate enzimatică ALDH1. Celulele obținute din monostratul cancerului de sân (SUM159PT și T47D) au fost suspendate în tampon de testare ALDEFLUOR care conține substrat ALDH1 (BAAA, 1 μmol/l per 1 x 106 celule) și incubate timp de 40 de minute la 37°C. Ca martor negativ pentru fiecare probă de celule, o alicotă a fost tratată cu 50 mmol/L dietilaminobenzaldehidă (DEAB), un inhibitor specific ALDH1. Porțile de sortare au fost stabilite folosind celule colorate cu ALDEFLUOR tratate cu DEAB ca martori negativi.

Colorarea CD24/CD44 și separarea populației CD24 +/high /CD44  prin FACS

Celulele MCF-7 și T47D care cresc ca culturi monostrat au fost colorate pentru exprimarea CD24 și CD44 așa cum s-a descris anterior 10 . Pe scurt, celulele au fost incubate cu tripsină-EDTA, disociate și trecute printr-o sită de 40 µm. Celulele au fost granulate prin centrifugare la 500 × g timp de 5 minute la 4°C, resuspendate în 100 µL de anticorp monoclonal de șoarece anti-uman CD24–fluorescein izotiocianat (FITC) (BD Pharmingen, San Jose, CA) și un monoclonal de șoarece anti- anticorp uman CD44-fitoeritrină (PE) (BD Pharmingen) și incubat timp de 20 de minute la 4°C. Porțile de sortare au fost stabilite folosind celule colorate cu controale de izotip (anticorpi conjugați cu FITC de control izotip (BD pharmingen) și respectiv anticorpi conjugați cu PE de control de izotip (BD pharmingen).

Capacitate de formare a sferelor

După iradiere, celulele au fost tripsinizate și placate în mediu de mammosferă (DMEM-F12, 0,4% BSA (Sigma), 10 ml/500 ml B27 (Invitrogen) 5 pg/ml insulină bovină (Sigma), 4 pg/ml heparină (Sigma), 20 ng/ml factor de creștere fibroblast 2 (bFGF, Sigma) și 20 ng/ml factor de creștere epidermică (EGF, Sigma)) în plăci cu 96 de godeuri cu aderență ultra-scăzută, variind de la 1 la 256 celule/godeu. Factorii de creștere, EGF și bFGF, au fost adăugați la fiecare 3 zile, iar celulele au fost lăsate să formeze sfere timp de 20 de zile. Numărul de sfere formate per godeu a fost apoi numărat și exprimat ca procent din numărul inițial de celule placate. Celulele au fost, de asemenea, placate în mediu mammosferă în vase de suspensie de 100 mm la 10.000 celule/ml și lăsate să formeze sfere timp de 15 zile, aceste celule au fost utilizate pentru experimente secundare de formare a sferei. Au fost efectuate trei experimente independente.

Transcriere inversă cantitativă-PCR

ARN total a fost izolat utilizând reactiv TRIZOL (Invitrogen). Sinteza cADN a fost efectuată utilizând SuperScript Reverse Transcription III (Invitrogen). PCR cantitativă a fost efectuată în termociclorul My iQ (Bio-Rad, Hercules, CA) folosind 2x iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Ct pentru fiecare genă a fost determinată după normalizarea la GAPDH sau RPLP0 și ΔΔCt fost calculat în raport cu proba de referință desemnată. Valorile expresiei genelor au fost apoi setate egale cu 2 -ΔΔCtașa cum este descris de producătorul trusei (Applied Biosystems). Toți primerii PCR au fost sintetizați de Invitrogen și proiectați pentru secvențele umane Oct4, Sox2, Nanog, Klf4, c-Myc. Primerii pentru matricea personalizată de expresie a genei de celule stem au fost sintetizați de Real Time Primers LLC (Elkins Park, PA).

Citometrie în flux cu două canale pentru OCT4/Sox2/Nanog/Klf4/c-Myc și conținutul de ADN

Celulele au fost recoltate la momentele relevante, spălate în TBS rece și fixate peste noapte în etanol rece (-20 ° C) 70%. După două spălări în TBS, celulele au fost permeabilizate cu TBS/4% BSA/0,1% Triton X-100 timp de 10 minute la RT. Probele au fost incubate cu un anticorp policlonal anti-Oct4 de iepure (Cell Signaling), un anti-Sox2 monoclonal de șoarece (R&D Systems), un anti-Nanog policlonal de iepure (Abcam), un anti-Klf4 monoclonal de șoarece (Abgen), un anti-șoarece monoclonal anti -c-Myc (Abcam) sau controlul izotip corespunzător (Biolegend) în TBS/4% BSA/0,1% Triton X100 timp de 1 oră la RT. După trei spălări în TBS, celulele au fost incubate cu anticorpi de capră anti-iepure Alexa Fluor 750-APC (Invitrogen) sau capră anti-șoarece PE-Cy7 (Sigma) în TBS/4%BSA/0,1% Triton X100, 1:200 pentru 1 h în întuneric. ADN-ul a fost contracolorat cu 10 ug/ml soluție de iodură de propidiu (PI) în PBS,

animale

Șoareci femele nuzi (nu/nu), în vârstă de 6-8 săptămâni, obținuți inițial de la The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) au fost re-derivați, crescuți și menținuți într-un mediu fără patogeni în Asociația Americană a Animalelor de Laborator Facilități pentru animale acreditate de îngrijire ale Departamentului de Oncologie cu radiații, Universitatea din California (Los Angeles, CA), în conformitate cu toate ghidurile locale și naționale pentru îngrijirea animalelor.

Xenotransplantul tumoral

Celulele negative SUM159PT-ZsGreen-cODC derivate din culturi monostrat și sortate prin sortarea celulelor activate prin fluorescență au fost placate în mediu F12 suplimentat cu ser fetal bovin și penicilină (100 unități/ml) și cocktail de streptomicina (100 ug/ml), insulină ( 5 ug/ml) și hidrocortizon (1 ug/ml). În ziua următoare, celulele au fost iradiate cu 0, 4 sau 8Gy. La cinci zile după iradiere, celulele au fost injectate subcutanat în coapsele și umerii șoarecilor femele Nu/Nu în vârstă de 6 săptămâni (106 , 105 , 104 , 103 sau 102 ).celule per inocul, n=8) în Matrigel (BD Biosciences). Creșterea tumorii a fost evaluată săptămânal, iar șoarecii au fost sacrificați atunci când dimensiunea tumorii a atins diametrele tumorii care necesită eutanasie. Experimentul a fost încheiat după 13 săptămâni. Datele au fost ajustate folosind un model de regresie sigmoidală (Y=a*X^b/(c+X^b), Graphpad Prism 5.0). Numărul de celule necesare pentru a obține tumori la 50% dintre animale (TD50) a fost calculat pentru fiecare doză de radiație.

Specimenele primare de cancer mamar uman

Specimenele de tumoră primară au fost obținute în conformitate cu un protocol aprobat de comitetele de revizuire instituționale de la Universitatea din California, Los Angeles prin intermediul Laboratorului de bază de patologie translațională (TCPL) de la UCLA (IRB# 02-02-057-22).

– Proba pacient 1: Carcinom mamar invaziv (90%), Carcinom lobular in situ (10%), gradul 2, Stadiul TNM: pT3, N0 (i-), Mx , ER3+, PR3+, HER/Neu1+, fără amplificare (FISH) ).

– Proba pacient 2: Carcinom ductal invaziv, grad 3, Stadiul TNM: pT2, N0, Mx , ER-, PR-, HER/Neu3+. Amplificare (FISH).

– Proba pacient 3: Carcinom ductal extensiv in situ (90%), Carcinom ductal invaziv (10%), grad 1, Stadiul TNM: pT1b, N0 (i-)(sn), Mx , ER3+, PR2+, Her/neu1, fara amplificare (FISH).

Specimenul de tumoră a fost digerat și celulele au fost extinse ex vivo timp de 2-3 săptămâni. Celulele ALDH-negative au fost izolate utilizând sortarea celulelor activată prin fluorescență.

Transfectarea Notch1-4 și Sox2/Nanog siRNA

Celulele SUM159PT au fost supuse transfecției cu Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, Sox2 sau ARNsi specific Nanog (Sigma Aldrich). Control negativ universal MISSION ® siRNA (Sigma Aldrich) a fost utilizat ca control de transfecție. Pe scurt, ARNsi (în total 100 ng) și Lipofectamine (invitrogen) au fost diluate în mediu de ser redus OptiMEM I (Invitrogen), amestecate și incubate timp de 20 de minute așa cum este descris de producător. Celulele au fost clătite cu PBS 1X, de două ori și incubate în 750 uL de OptiMEM I. S-a adăugat amestec de siRNA/Lipofectamină deasupra celulelor și s-a incubat la 37°C, 5% CO2timp de 6h. După incubare, mediul a fost îndepărtat și s-au adăugat 2 ml de ser care conține mediu F12. La douăzeci și patru de ore după transfecție, celulele au fost placate pentru un test de capacitate de formare a sferei sau celulele au fost sortate și tratate așa cum s-a descris anterior.

Tratamentul cu Noscapine și analiza ciclului celular

Pentru a identifica contribuția poliploidiei la generarea de CSC, au fost tratate cu Noscapine MCF-7, T47D, SUM159PT și 2 probe de pacienți non-tumorigenice (2 și 3 ) . Celulele non-tumorigenice (CD24 +/high /CD44– , ALDH1-negative sau ZsGreen-cODC-negative) au fost sortate și placate ca culturi monostrat. În fiecare zi următoare, celulele MCF-7 și T47D au fost tratate cu Noscapină (0, 10 sau 25 pM). Celulele SUM159PT și mostrele de pacient 1 și 2 au fost tratate cu Noscapină la 0, 25 sau 50 pM (Sigma Aldrich). În ziua 5, prezența celulelor CD24- /low /CD44 high , ALDH1-pozitive sau ZsGreen-cODC-pozitive a fost analizată prin citometrie în flux. În paralel, celulele au fost analizate pentru poliploidie așa cum este descris mai sus.

metode statistice

Toate rezultatele sunt exprimate ca valori medii. O valoare p de ≤ 0,05 într-un test t Student cu două fețe pereche a fost considerată a indica diferențe semnificative statistic. Testul a fost aplicat datelor normalizate pentru a compensa variația măsurătorilor între replici independente din punct de vedere biologic ale acelorași experimente.

Mergi la:

Rezultate

Radiația induce un fenotip BCSC în celulele anterior netumorigenice

În concordanță cu un fenotip radiorezistent pentru BCSC, noi și alții au raportat anterior că radiațiile ionizante au crescut numărul de BCSC în populația totală de celule de cancer de sân 5 , 6 , 10 . Acest lucru a fost atribuit uciderii selective a celulelor netumorigenice și/sau trecerii de la un tip de diviziune celulară asimetrică la simetrică a BCSC-urilor care dă naștere la două BCSC-uri fiice identice și, astfel, ducând la o creștere relativă și absolută a BCSC-urilor.

În studiul de față, am folosit suspensii de celule unice din specimenul proaspăt de sân uman și le-am colorat pentru activitatea ALDH1, un marker descris recent pentru BCSCs 2 , 3 . Folosind sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS), am izolat non-BCSC (celule ALDH1-negative) din aceste specimene după purjarea BCSC-urilor (celule ALDH1-pozitive). Ne-BCSC purificate (celule ALDH1-negative) au fost apoi placate și iradiate în ziua următoare cu 0, 4 sau 8 Gy. La cinci zile după iradiere, am evaluat numărul de BCSC care apar în cadrul populației non-BCSC. Am descoperit că radiațiile au condus la o creștere dependentă de doză a numărului de celule ALDH1 pozitive (Figura 1a; proba pacient 1: 0Gy, 0,92%, 4Gy, 1,92%, 8Gy, 4,05%; Proba pacient 2: 0Gy, 1,46%, 4Gy, 3,56%, 8Gy, 8,59%, Proba pacient 3: 0Gy, 1,24%, 4Gy, 2,9%, 8Gy, 3,45%).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f1.jpg

figura 1

Radiația induce generarea de novo de CSC

(a) Probe de pacient proaspăt izolate și (b) celulele SUM159PT au fost colorate pentru activitatea ALDH1. Celulele ALDH1-negative au fost sortate, placate ca culturi monostrat și iradiate cu 0, 4 sau 8Gy în ziua următoare. Prezența celulelor ALDH1-pozitive (ALDH1 + ) a fost analizată la 5 zile după iradiere. Procente de celule ALDH1-pozitive sunt prezentate pentru 3 probe de pacient. Sunt prezentate petele reprezentative ale SUM159PT și mijloacele ALDH1-pozitive (ALDH1 + ) SUM159PT (n=3). ( c ) MCF-7 și T47D au fost colorate pentru CD24 și CD44 și purjate prin citometrie în flux din CD24 -/low / CD44 highcelule. Celulele au fost apoi placate ca monostraturi și iradiate în ziua următoare cu 0, 4 sau 8Gy. La cinci zile după tratament, celulele au fost colorate pentru CD24 și CD44, iar prezența celulelor CD24 -/low /CD44 ridicat a fost analizată de FACS. Celulele ZsGreen-cODC-negative de la SUM159PT au fost sortate și placate ca monostraturi sau mammosfere. În ziua următoare, celulele au fost iradiate. La cinci zile după tratament, prezența celulelor ZsGreen-cODC-pozitive a fost analizată prin citometrie în flux. (d) Petele reprezentative și (e) imaginile (contrastul de fază și fluorescența verde) ale mamosferelor SUM159PT-ZsGreen-cODC la 5 zile după iradiere sunt afișate. Mijloacele, sem și valoarea p pentru creșterile relative ale numerelor de celule pozitive ZsGreen-cODC sunt prezentate întabelul suplimentar 1 și 2 .

Din experiența anterioară cu populațiile de celule purificate cu FACS am fost conștienți de faptul că, în practică, aceste populații de celule purificate nu sunt 100% pure 9 . Într-adevăr, o privire mai atentă a populațiilor purificate cu FACS de celule ALDH1 negative a arătat că acestea au conținut întotdeauna o populație foarte mică de celule contaminante ALDH1 pozitive. Cu toate acestea, calculele se bazează pe numărul de celule contaminante, timpul lung de dublare a BCSC (~ 72 de ore), care nu este afectat de iradiere 10 și fracțiunea de supraviețuire a BCSC-urilor pentru fiecare punct de doză ( Figura 1 suplimentară ).), a sugerat că contaminarea BCSC prezente la momentul iradierii este puțin probabil să fie singura sursă a creșterii absolute a numărului de BCSC observată la 5 zile după iradiere. Prin urmare, am ales să testăm o explicație alternativă, și anume că celulele canceroase de sân netumorigenice dobândesc un fenotip BCSC ca răspuns la radiațiile ionizante, contribuind astfel la îmbogățirea BCSC observate după tratamentul cu radiații.

Pentru a testa această ipoteză alternativă, am folosit un grup de trei linii de celule de cancer de sân stabilite și utilizate pe scară largă (SUM159PT, MCF-7 și T47D). Acest panou a permis numărul necesar de repetări experimentale într-un număr mare de teste diferite. Pe lângă testul Aldefluor (Figura 1b) am folosit CD24 și CD44 pentru a identifica BCSC și am folosit un sistem de imagistică descris anterior pentru CSC în cancerul de sân și gliom. Acest ultim sistem se bazează pe o proteină de fuziune între proteina verde fluorescentă ZsGreen și degronul C-terminal al ornitin decarboxilazei murine (cODC) și raportează activitatea proteazomului 26S (Figura 1d, e), o activitate de protează care s-a dovedit a fi foarte scăzută în CSC 9 . Celulele cu activitate proteazomică scăzută acumulează proteina de fuziune fluorescentă, în timp ce în celulele cu activitate proteazomală ridicată, porțiunea cODC a proteinei de fuziune direcționează ZsGreen către degradarea independentă de ubiquitină de către proteazomul 26S. Foarte important, în cancerul de sân, celulele cu activitate proteazomală intrinsec scăzută s-au suprapus cu populația de celule CD24 -/low /CD44 mare 10 și cu celule pozitive pentru ALDH1 ( Figura suplimentară 2a/b ).

Apoi, am confirmat că creșterile induse de radiații ale numărului de BCSC nu au avut loc numai în non-BCSC-uri din probele de pacienți, ci și în non-BCSC-uri din liniile de celule stabilite. Prin urmare, celulele ALDH1-negative sortate din SUM159PT (Figura 1b) și liniile celulare T47D ( Figura suplimentară 3a ) au fost placate ca culturi monostrat și iradiate în ziua următoare cu 0, 4 sau 8Gy. Ca și în probele derivate de la pacient, am observat o creștere semnificativă dependentă de doză a numărului de celule ALDH1-pozitive, la cinci zile după iradiere (Figura 1b, SUM159PT: 0Gy: 0,3%; 4Gy, 1,76%, p = 0,008; 8Gy, 5,74%, p = 0,002; testul t Student bifacial). Pentru a confirma această observație, am folosit combinația de marker CD24 ridicat / CD44 scăzut pentru a izola celulele canceroase de sân MCF-7 și T47D non-tumorigenice. Din nou, la cinci zile după iradiere, am observat inducerea CD24 -/low /CD44 high din celulele CD24 high /CD44 scăzute anterior netumorigenice (MCF-7: 0Gy: 0,37%: 4Gy: 2,35%, p = 0,016; 8Gy). : 6,33%, p = 0,221. T47D: 0Gy: 0,08%: 4Gy: 0,38%, p = 0,025; 8Gy: 1,38%, p=0,006). În experimente paralele, am folosit celule SUM159PT, MCF-7 și T47D transfectate cu constructul reporter ZsGreen-cODC pentru activitatea proteazomului. Folosind acest al treilea marker pentru BCSC, am observat, de asemenea, o creștere dependentă de doză, indusă de radiații, a numărului de celule ZsGreen-cODC-pozitive (activitate scăzută a proteazomului) (Figura 1d/e,Figura 2Tabelul suplimentar 1 și 2 ). Este important că celulele pozitive pentru markeri BCSC nu ar putea fi generate numai din celule diferențiate în culturi monostrat, ci și din celule diferențiate sortate din mamsfere (Figura 2Figura suplimentară 3b ).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f2.jpg

Figura 2

Radiația induce generarea de novo dependentă de Notch de CSC

(a) SUM159PT-, (b) MCF-7- și (c) Celulele negative T47D-ZsGreen-cODC au fost sortate și placate ca monostraturi sau mammosfere. În ziua următoare, celulele au fost apoi tratate cu 0, 2, 4, 6, 8 sau 12 Gy (rata de doză: 2,789 Gy/min). Cu 1 oră înainte de iradiere și în fiecare zi după iradiere, celulele au fost tratate cu un inhibitor de y-secretază (5 pM). La cinci zile după tratament, prezența celulelor pozitive ZsG-cODC a fost analizată de FACS. Este prezentată media pentru creșterile relative ale numerelor de celule pozitive ZsG-cODC (* și # indică p<0,05, vezi tabelul suplimentar 1 și 2 pentru medii, 95% CI și valoarea P). (d)Celulele SUM159PT au fost transfectate cu ARNsi specific Notch1, Notch2, Notch3 sau Notch4 și apoi sortate pentru celule negative ZsGreen-cODC. Celulele au fost placate ca monostraturi și iradiate cu 0, 4 sau 8 Gy în ziua următoare. Prezența celulelor ZsGreen-cODC-pozitive a fost analizată la 5 zile după tratament. Procentul mediu al numerelor de celule pozitive ZsGreen-cODC este prezentat (* indică p<0,05, n=4). (e)Celulele SUM159PT-ZsGreen-cODC au fost transfectate cu vector Strawberry-Red exprimat constitutiv. Celulele ZsGreen-cODC-pozitive/StrawberryRed-pozitive au fost izolate prin citometrie următoare și amestecate cu celule SUM159PT-ZsGreen-cODC-negative (transfectate fără StrawberryRed) la concentrații diferite (0, 2 sau 10%). Celulele au fost placate și iradiate în ziua următoare. La cinci zile după iradiere, prezența celulelor ZsGreen-cODC-pozitive/StrawberryRed-negative a fost evaluată de FACS. Sunt prezentate procentele medii ale numerelor de celule ZsGreen-cODC-pozitive/StrawberryRed-negative (n=3).

Studiile anterioare au raportat un rol pentru calea de semnalizare Notch în menținerea unui fenotip de celule stem în celulele epiteliale mamare 12 . Am decis să repetăm ​​experimentele de radiație de mai sus în prezența unui inhibitor de γ-secretază pentru a bloca semnalizarea Notch. Inhibarea semnalizării Notch a atenuat generarea de celule pozitive pentru markerul BCSC (ZsGreen-cODC-pozitiv), dar nu a anulat complet capacitatea celulelor non-tumorigenice (ZsGreen-cODC-negative) de a da naștere la celule cu activitate proteazomului intrinsec scăzută. (Figura 2a-cTabelul suplimentar 1 și 2 ). Pentru a testa în continuare implicarea căii Notch în inducerea BCSC, am inhibat expresia receptorilor Notch prin transfectarea celulelor cu țintirea siARN. Celulele SUM159PT-ZsGreen-cODC au fost transfectate cu siARN specific care vizează receptorii Notch1, Notch2, Notch3 sau Notch4 folosind lipofectamină. La douăzeci și patru de ore după transfecție, celulele SUM159PT-ZsGreen-cODC negative au fost izolate și placate ca culturi monostrat. În ziua următoare, celulele au fost iradiate cu 0, 4 sau 8 Gy. La cinci zile după iradiere, am observat o scădere a numărului de BCSC-uri generate în comparație cu celulele transfectate cu un control siRNA amestecat. Reglarea în jos a Notch2, 3 și 4 nu a împiedicat inducerea BCSC (Figura 2d, 8Gy: siCTL: 3,04%, siNotch1: 1,54%, p = 0,013). Acest lucru a indicat că semnalizarea prin receptorul Notch1 a fost fie implicată în inducerea BCSC, fie în menținerea fenotipului de celule stem a BCSC-urilor nou generate.

Pentru a studia dacă celulele non-tumorigenice ar putea genera și BCSC-uri în prezența BCSC-urilor preexistente, am reconstituit o populație mixtă de celule non-tumorigenice și BCSC-uri marcate cu StrawberryRed la diferite diluții (0, 2 și 10% BCSC). După sortare, celulele netumorigenice SUM159PT-ZsGreen-cODC-negative și BCSC-uri SUM159PT-ZsGreen-cODC-pozitive/StrawberryRed au fost amestecate și placate ca culturi monostrat. În ziua următoare, celulele au fost iradiate cu 0, 4 sau 8Gy. Când am analizat celulele la cinci zile după iradiere prin citometrie în flux, am constatat că generarea de BCSC indusă de radiații (ZsGreen-cODC-pozitiv/StrawberryRed-negativ) a fost scăzută în prezența BCSC-urilor preexistente (Figura 2e) sugerând o buclă de feedback negativ a BCSC existente în generarea de BCSC induse (iBCSC).

Folosind mijloace operaționale, am căutat apoi să testăm dacă apariția celulelor pozitive ALDH1 și a celulelor pozitive ZsGreen-cODC cu activitate proteazomică scăzută a reflectat doar o inducere a expresiei markerului BCSC sau dacă a fost cu adevărat inducerea unui fenotip BCSC. Pentru a evalua capacitatea de auto-reînnoire a iBCSC, am folosit un test de formare a sferei în care celulele epuizate din BCSC cu activitate proteazomică scăzută au fost însămânțate la densități clonale în plăci cu aderență ultra-scăzută în absența serului fetal de vițel pentru a permite formarea mamosfere din celule unice. În cancerul de sân, formarea mamosferei este o măsură a capacității de auto-reînnoire in vitro a BCSC și se corelează strâns cu tumorigenitatea 13. Pentru a testa dacă radiația a indus un fenotip BCSC pe celulele netumorigene, am comparat capacitatea de formare a sferei a probelor iradiate și a controlului neiradiat. Mai mult, numărul de sfere formate pentru fiecare doză de radiație a fost comparat cu numărul ipotetic de mamosfere așteptate. Numărul așteptat de mammosfere la fiecare doză a fost calculat pe baza 1) numărul de celule contaminante ZsGreen-cODC pozitive după sortare, 2) un timp de dublare de 72 de ore în timpul celor 5 zile de cultură și 3) pe fracția lor de supraviețuire clonogenă. la fiecare punct de doză ( Figura 1 suplimentară ).

În sferele primare, capacitatea de auto-înnoire a celulelor iradiate a rămas fie aceeași, fie a depășit-o pe cea a celulelor de control neiradiate corespunzătoare. Cu excepția T47D, acest efect a fost observat și în mamosferele secundare. Cu toate acestea, atunci când numărul observat de mammosfere a fost comparat cu numărul așteptat de mammosfere la fiecare punct de doză, formarea mammosferei de celule iradiate a depășit semnificativ numărul de mammosfere estimate a fi formate (Figura 3ași Figura suplimentară 3b ).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f3.jpg

Figura 3

Radiația induce generarea de novo de CSC funcționale

Celulele ZsGreen-cODC-negative de la SUM159PT, MCF-7 și T47D au fost sortate și placate ca monostraturi sau mamsfere (a se vedea figura suplimentară 3b ). În ziua următoare, celulele au fost iradiate. (a) La cinci zile după iradiere, celulele MCF-7, T47D și SUM159PT au fost însămânțate la densități clonale pentru a evalua capacitatea de formare a sferei. Sunt afișate mediile și sem, *indică p<0,05. Graficele cu linii întunecate reprezintă media numărului de mammosfere observate (n=3), liniile întrerupte reprezintă numărul de mammosfere care se așteaptă să derive din contaminarea BCSC-urilor. Capacitatea secundară de formare a sferei a fost evaluată la 15 zile după iradiere. (b)Celulele SUM159PT-ZsGreen-cODC negative au fost sortate și placate ca culturi monostrat. În ziua următoare, celulele au fost iradiate cu 0, 4 sau 8 Gy. La cinci zile după iradiere, celulele au fost injectate subcutanat în șoareci nuzi. La 13 săptămâni după injectare, s- au calculat valorile TC50 .

Apoi, am sortat celulele SUM159PT pe baza expresiei ZsGreen-cODC și non-BCSC-uri iradiate (ZsGreen-cODC-negativ) cu 0, 4 și 8 Gy. După 5 zile, celulele au fost injectate în coapsele și umerii șoarecilor femele Nu/Nu în vârstă de 6 săptămâni într-un test de diluție limitativă (106 , 105 , 104 , 103 sau 102 celule per inocul, n=8 per injecție). La 13 săptămâni după injectare, a fost calculat numărul de celule necesare pentru a iniția creșterea tumorii la 50% dintre animale (TD50 ) . După cum era de așteptat, valorile TD50 ale non-BCSC neiradiate au fost ridicate (1,15 x 105 celule ) în concordanță cu un număr mic de BCSC-uri contaminante după sortarea FACS. Cu toate acestea, TD 50valorile au fost reduse de 32 de ori după o singură doză de 4Gy (3,6×103 ) și de 9 ori (1,26× 104) după o singură doză de 8Gy , sugerând o creștere relativă și absolută indusă de radiații a numerelor BCSC (Figura 3bși Tabelul suplimentar 3 ). Luate împreună, aceste date au indicat că iradierea ionizantă nu numai că a indus expresia markerilor BCSC în BSCS non-tumorigenice, dar a condus și la dobândirea de trăsături de celule stem canceroase.

În cele din urmă, am decis să comparăm profilul de expresie a 86 de gene asociate cu trăsăturile celulelor stem între celulele negative ZsGreen-cODC neiradiate, BCSC-uri pozitive ZsGreen-cODC neiradiate și iBCSC-uri pozitive ZsGreen-cODC induse de 8Gy. 10 gene au fost regulate în mod constant și semnificativ în BCSC-uri ZsGreen-cODC-pozitive și iBCSC-uri generate de 8Gy (Figura 4ași Figura suplimentară 4). Genele au inclus elemente cheie ale căilor de semnalizare Notch, Wnt, Shh și FGF, precum și gene implicate în reglarea ciclului celular, aderența celulară și contactul celulă la celulă. Profilurile de expresie genică comparabile ale iBCSC-urilor ZsGreen-cODC-pozitive după o singură doză de radiație de 8Gy administrată unui non-BCSC ZsGreen-cODC-negativ sortat FACS și BCSC-urilor ZsGreen-cODC-pozitive preexistente au sugerat că iBCSC-urile sunt conduse de același set a genelor legate de celulele stem. Au existat totuși unele diferențe în acea expresie a SRY (regiunea determinantă a sexului Y) – caseta 1 (Sox-1), SRY (regiunea determinantă a sexului Y) – caseta 2 (Sox-2), proteina B care leagă calciul S100 (S100B), Omologul alfa 6 defect de partiționare Par-6 (PARP6A), omologul Deltex 1 (DTX1) și 1 asemănător Delta (DLL1) au fost semnificativ mai mari în iBSCS-uri,Figura 6b). În general, profilul de expresie al genelor legate de stemness în iBCSC-uri a reasamblat profilul de expresie găsit în BCSC-uri mult mai aproape decât profilul de expresie găsit în populația non-BCSC neiradiată din care provin.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f4.jpg

Figura 4

Expresia genei celulelor stem a BCSC și iBSCS

Expresia a 86 de gene legate de celule stem și a 10 gene de menaj a fost analizată prin RT-PCR semi-cantitativă în celule ZsGreen-cODC-negative, -pozitive și iBCSC-uri (8 Gy). (a) Harta termică a genelor exprimate diferențial între celulele ZsGreen-cODC-negative, ZsGreen-cODC-pozitive neiradiate sau iBCSCs 8Gy și expresia medie (Mean of ZsGreen-cODC-negative cells, non-iradiate ZsGreen-cODC- sunt prezentate celule pozitive și celule iBCSCs 8Gy) (vezi, de asemenea , Figura 6 suplimentară ). (b) Expresia diferită semnificativă între BCSC-urile neiradiate ZsGreen-cODC-pozitive și iBCSC-urile 8Gy sunt prezentate (n = 3), * indică p<0,05.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f6.jpg

Figura 6

Celulele poliploide induse de iradiere exprimă Oct4, Sox2, Nanog și Klf4 și sunt îmbogățite pentru BCSC

Nivelurile de expresie a proteinelor ZsGreen-cODC, Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 și c-Myc și conținutul de ADN au fost analizate prin citometrie în flux. (a) Sunt prezentate mijloacele și sem ale celulelor poliploide induse de radiații. (b) Sunt prezentate mediile și sem ale numărului de celule poliploide Oct4-, Sox2-, Nanog-, Klf4- și c-Myc-pozitive după iradiere. (c) Expresia Oct4, Sox2 și Nanog în poliploid au fost analizate în probe derivate de la pacient (Pentru MCF-7 și T47D, vezi figura suplimentară 5 ). (d) Sunt afișate distribuțiile BCSC-urilor SUM159PT în populația totală, populația non-poliploidă, în populația poliploidă Oct4-, Sox2-, Nanog-, Klf4- sau c-Myc-pozitivă (a se vedea și figura suplimentară 6pentru MCF-7 și T47D). Datele sunt exprimate ca medii și sem, * indică p<0,05. (e) Celulele SUM159PT-ZsGreen-cODC au fost transfectate cu ARNsi țintit Sox2 și/sau Nanog, iar ZsGreen-cODC-negativ au fost sortate și iradiate. Sunt prezentate mediile (± sem) ale celulelor pozitive ZsGreen-cODC găsite la 5 zile după iradiere. * indică p<0,05.

Radiația induce re-exprimarea Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4

Achiziția unui fenotip de celule stem a fost descrisă pentru celulele diferențiate nemaligne după supraexprimarea Oct4, Sox-2, Nanog, Klf4 și c-Myc. Acești factori de transcripție sunt acum utilizați în mod obișnuit pentru a genera celule stem pluripotente induse (iPS) din celule somatice diferențiate 14 , 15 și s-a dovedit, de asemenea, că mențin fenotipul BCSC 16 . Interesant, Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4 sunt substraturi cunoscute ale proteazomului 26S 17 – 20și, prin urmare, se așteaptă să fie stabilizat în celule cu activitate proteazomică scăzută. Pentru a determina dacă acești factori de transcripție au fost reactivați în populațiile non-BCSC după iradiere, le-am analizat nivelurile de expresie la 5 zile după 0, 4 sau 8 Gy de radiație, momentul în care am observat creșteri absolute ale numerelor BCSC. După cum era de așteptat, am găsit o creștere semnificativă, dependentă de doza de radiație, a nivelurilor de expresie a ARNm Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4 care se potrivea cu nivelurile de expresie pentru acești factori de transcripție în BCSC-uri neiradiate care apar intrinsec (Figura 5).

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f5.jpg

Figura 5

iBCSC-urile supraexprimă Oct4, Sox2, Nanog și Klf4, dar nu c-Myc

Celulele SUM159PT-ZsGreen-ODC au fost sortate în celule ZsGreen-cODC-pozitive și -negative. Celulele ZsGreen-cODC negative au fost placate ca monostraturi și iradiate în ziua următoare cu 4 sau 8 Gy. Celulele iBCSC au fost sortate în ziua 5 după iradiere. Expresia Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 și c-Myc a fost analizată prin RT-PCR semi-cantitativă. Sunt prezentate mijloacele nivelurilor de expresie a genei factorului de transcripție (n=4), * indică p<0,05.

Pentru a testa dacă reexprimarea celor patru factori de transcripție de mai sus a avut loc în mod aleatoriu sau într-un subset specific de celule, am analizat expresia nivelurilor de proteine ​​Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4 și am corelat-o cu conținutul de ADN al celulelor. În celulele iradiate am observat un număr crescut de celule poliploide (SUM159PT: 0Gy: 0,74%, 4Gy: 4,63%, p <0,0001; 8Gy: 6,33%, p <0,0001; Proba pacient 2: 0Gy: 12,4%, 4Gy: 12,4%, 4Gy:% p <0,032; 8Gy: 22,5%, p <0,0003; Eșantion de pacient 3: 0Gy: 6,41%, 4Gy: 12,6%, p <0,012; 8Gy: 15,4%, p <0,0004; MCF-7: 4,60%:, 0Gy : 6,96%, p <0,004; 8Gy: 24,7%, p <0,0006; T47D: 0Gy: 12,0%, 4Gy: 17,6%, p<0,007; 8Gy: 47,23%, p <0,003;Figura 6ași Figura suplimentară 5a/b ) în care proteinele Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4 au fost reglate în sus (SUM159PT: Oct4: 0Gy, 2,71%, 4Gy: 17,02%, p = 0,041; 8Gy: 20,1%, p = 0.003 ). Sox2: 0Gy, 4,52%, 4Gy: 14,5%, p = 0,0002; 8Gy: 48,98%, p <.0001; Nanog: 0Gy, 0,39%, 4Gy: 18,9%, p = 0,228 %, p = 0,228:%; 0,222: Klf4: 0Gy, 1,89%, 4Gy: 4,74%, p = 0,031, 8Gy: 9,86%, p = 0,084;Figura 6b/cși figura suplimentară 5c/d ) și care au fost, de asemenea, foarte îmbogățite pentru celule ZsGreen-cODC-pozitive cu activitate proteazomică scăzută (populație totală: 0Gy, 0,64%, 4Gy: 1,84%, p <0,0001; 8Gy: 9,09%, p <0,0001 Poliploid: 0Gy, 0,08%, 4Gy: 0,94%, p = 0,01; 8Gy: 2,69%, p = 0,005; Poliploid/Oct4 + : 0Gy, 0%, 4Gy: 3,97%, p <0,001:%, 12,12:%; p = 0,031; Poliploid/Sox2 + : 0Gy, 0%, 4Gy: 3,84%, p = 0,041; 8Gy: 10,19%, p = 0,042; Poliploid/Nanog + : 0Gy, 0,45%, 4Gy: 1,014%, p = 1,042; 8Gy: 2,79%, p = 0,029;Figura 6dși Figura suplimentară 5b ). Nivelurile c-Myc nu au fost crescute (Figura 6b/d,​,5d).5d). În concordanță cu un raport anterior 21 , inhibarea activării Notch a atenuat inducerea poliploidiei (4Gy: 4,87%; 4Gy + inhibitor de y-secretază: 2,72, p = 0,03; 8Gy: 6,32%; 8Gy + inhibitor de y-secretază: p3,42: p . = 0,028; Figura suplimentară 5b ) și inducerea celulelor poliploide care exprimă Oct4, Sox-2, Nanog și Klf4 ( Figura suplimentară 5d ). Acest lucru a susținut din nou implicarea semnalizării Notch în reprogramarea radiațiilor.

Pentru a identifica rolul acestor factori de transcripție în generarea iBCSC-urilor, am folosit siRNA pentru a viza expresia Sox2 și Nanog. Celulele non-tumorigenice transfectate cu siARN-Sox2 și siARN-Nanog au fost sortate, placate și iradiate cu 0, 4 și 8Gy în ziua următoare. Reglarea în jos a fie a Sox2, fie a lui Nanog nu a avut niciun efect asupra inducerii iBCSC-urilor. Cu toate acestea, generarea iBCSC-urilor a fost redusă semnificativ atunci când Sox2 și Nanog au fost reglate în jos simultan (0Gy: control siRNA: 0,37%, siRNA-Sox2/Nanog: 0,57%, p = 0,505; 4Gy: control siRNA: 1,36%, siRNA-Sox2 /Nanog: 0,49%, p = 0,008, 8Gy: control siARN: 3,04%, siARN-Sox2/Nanog: 1,63%, p = 0,047;Figura 6e).

Inducerea generării induse de poliploidie de iBCSC

În celulele diferențiate, Sox2 și Oct4 sunt reduse la tăcere epigenetic. Suprimarea expresiei genelor pentru ambii factori de transcripție este incompletă, dar încă suficientă pentru a menține nivelurile de proteine ​​sub un prag critic. Am emis ipoteza că în celulele poliploide găsite după iradiere, mai multe copii ale genelor Oct4 și Sox2 parțial reduse la tăcere ar putea fi suficiente pentru a conduce expresia genei dincolo de acest prag, inducând astfel un fenotip BCSC. Pentru a testa această ipoteză, am explorat dacă efectul radiațiilor ar putea fi imitat prin inducerea farmacologică a poliploidiei. Tratamentul liniilor celulare de cancer de sân și a probelor de pacient cu noscapină a determinat o creștere substanțială a numărului de celule poliploide în ziua 5 după adăugarea medicamentului. Creșterea observată a fost comparabilă cu cantitatea de poliploidie găsită după iradiere (Figura 7ași Figura suplimentară 7a/b ). Apoi am testat dacă a crescut și numărul de BCSC. În ambele probe de pacienți, tratamentul cu noscapină a crescut semnificativ numărul de celule ALDH1-pozitive (Figura 7b). Un număr crescut de BCSC-uri cu activitate proteazomală scăzută au fost, de asemenea, găsite atunci când celulele care exprimă ZsGreen-cODC MCF-7, T47D sau SUM159PT au fost analizate pentru celulele pozitive ZsGreen-cODC (Figura 7cși Figura suplimentară 7c ) și când celulele MCF-7 și T47D au fost analizate pentru numărul de celule CD24 scăzut/- /CD44 ridicat (Figura 7d). Aceste rezultate au sugerat că doza crescută de gene în celulele poliploide ar putea fi într-adevăr unul dintre mecanismele care conduc la achiziționarea unui fenotip CSC în cancerul de sân, ca răspuns la tratamentul cu radiații.

Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este nihms392738f7.jpg

Figura 7

Poliploidia induce generarea de novo de CSC

(a) Evaluarea poliploidiei induse de noscapină în liniile celulare MCF-7, T47D, SUM159PT și 2 probe derivate de la pacient, la cinci zile după tratamentul medicamentos.

Celule non-tumorigenice Celulele derivate de la pacient ALDH1-negative (b) , MCF-7-, T47D- și SUM159PT-ZsGreen-cODC-negative (c) și celulele CD24 + /CD44  MCF-7 și T47D (d) au fost tratați cu noscapină la 0, 25 sau 50 pM. Prezența iBCSC-urilor a fost evaluată după 5 zile prin citometrie în flux.

Celula SUM159PT și probele de pacient 2 și 3 au fost transfectate cu ARNsi specifici care vizează receptorii Notch (e) sau Sox2 și Nanog (f) . Secvențele amestecate au fost folosite ca control. La douăzeci și patru de ore după transfecție, celulele au fost placate pentru un test de capacitate de formare a sferei. Pentru fiecare condiție sunt afișate procentele de celule capabile să formeze o sferă.

În cele din urmă, am confirmat că BCSC se bazează pe semnalizarea Notch folosind siRNA-uri specifice care vizează receptorii Notch1, Notch2, Notch3 sau Notch4. Celulele au fost transfectate cu Lipofectamină, la 24 de ore după transfecție, celulele au fost placate în mediu de sferă pentru un test de capacitate de formare a sferei. După cum era de așteptat, reglarea în jos a expresiei receptorului Notch a redus capacitatea celulelor de a forma mamosfere (Figura 7e). În plus, pentru a demonstra că BCSC se bazează pe factorii de transcripție induși de radiații, am reglat în jos Sox2 și Nanog folosind siRNA-uri specifice. Celulele au fost transfectate cu Lipofectamină, la 24 de ore după transfecție, celulele au fost placate și testate pentru formarea sferei. După cum era de așteptat, reglarea în jos a expresiei Sox2 și Nanog a redus capacitatea de auto-reînnoire a celulelor din liniile celulare de cancer de sân consacrate și probele primare de cancer de sân, iar Sox2, care acționează în amonte de Nanog și are ținte în plus față de Nanog, a fost mai eficient în (Figura 7f).

Mergi la:

Discuţie

Se știe de multă vreme că lipsurile de tratament în radioterapie agravează rezultatul la pacienții care suferă de cancere epiteliale, inclusiv cancere ale regiunii capului și gâtului și ale sânului 22 , 23 .. Mecanismele care stau la baza sunt înțelese incomplet, dar în general sunt atribuite repopulării accelerate, un fenomen care se referă la ratele crescute de creștere a cancerelor în timpul intervalelor de tratament care depășesc cu mult ratele lor inițiale de creștere. Se crede că, în timpul repopulării accelerate, CSC-urile trec de la un tip asimetric de diviziune celulară, care duce la o CSC fiică și o celulă de diferențiere, la un tip simetric de diviziune celulară care dă două CSC-fiice identice. Datele noastre sugerează că, pe lângă viziunea clasică a repopulării accelerate, în care CSC-urile trec de la un tip asimetric de diviziune celulară care duce la o CSC fiică și la o celulă de diferențiere la un tip simetric de diviziune celulară care dă în două CSC fiice, celulele canceroase diferențiate pot, de asemenea, să dobândească trăsături de celule stem în anumite condiții de stres micro-mediu tumoral, inclusiv stresul indus de radiațiile ionizante. Dobândirea trăsăturilor de celule stem de către celulele gliom netumorigenice CD133-negative a fost raportată anterior în condiții hipoxice24 și ca răspuns la semnalizarea crestăturii induse de oxid nitric 25 , sugerând că plasticitatea celulelor stem canceroase poate fi un răspuns comun la stimuli multipli, inclusiv terapii pentru cancer.

Este provocatoare observația noastră că radiațiile ionizante au reactivat aceiași factori de transcripție în celulele canceroase de sân diferențiate care reprogramează celulele somatice diferențiate în celule iPS. Cu toate acestea, este în conformitate cu rapoartele recente că nivelurile inițiale ale expresiei Sox2, Oct4 și Nanog pot fi detectate în cancerele de sân 26 , 27 și că supraexprimarea ectopică a Oct4 în celulele epiteliale mamare normale induce un fenotip BCSC 28.. Datele noastre indică în continuare că un număr crescut de copii ale genelor Oct4 și Sox2 în celulele poliploide ar putea fi un posibil mecanism din spatele reprogramării induse de radiații. Acest lucru a fost susținut de datele noastre care arată că reglarea în jos a Sox2 a prevenit formarea mamosferei. Reglarea în jos a țintei Sox2 din aval Nanog a fost mai puțin eficientă, indicând faptul că mai multe gene în aval de Sox2 contribuie la dobândirea unui fenotip de celule stem canceroase. Observații similare au fost raportate pentru celulele limfomului 29 . În plus, acest lucru este în conformitate cu rapoartele anterioare privind inducerea poliploidiei 21 dependentă de Notch și datele noastre care arată că inhibarea semnalizării Notch a prevenit parțial apariția iBCSC-urilor ( Figura suplimentară 5b), sugerând că țintirea semnalizării Notch ar putea îmbunătăți controlul local după radioterapie.

Ipoteza CSC a fost formulată cu mai bine de un secol în urmă 30 . Cu toate acestea, până de curând identificarea prospectivă a CSC a fost imposibilă. Descoperirea combinațiilor de markeri care identifică CSC au dus la noi perspective asupra biologiei cancerului. Totuși, ipoteza CSC a fost contestată și unele date experimentale susțin un model de evoluție clonală ca o structură organizațională alternativă a tumorilor 31 în care fiecare celulă canceroasă poate dobândi trăsături de celule stem la un moment dat.

Studiul nostru reunește modelele concurente de evoluție clonală și organizarea ierarhică a cancerelor 32deoarece sugerează că tumorile în creștere netulburată mențin într-adevăr un număr scăzut de CSC. Cu toate acestea, dacă sunt provocate de diverși factori de stres, inclusiv radiații ionizante, iCSC-uri sunt generate, care împreună cu CSC-urile supraviețuitoare pot repopula o tumoare. Aceste constatări au implicații pentru proiectarea de noi protocoale de tratament care vizează CSC, inclusiv radioterapia. Curabilitatea unui cancer poate depinde nu numai de radiosensibilitatea intrinsecă a CSC, ci și de radiosensibilitatea CSC induse și de rata la care acestea sunt generate. Controlul radiorezistenței BCSC și generarea de noi iBCSC în timpul tratamentului cu radiații poate îmbunătăți în cele din urmă curabilitatea și poate permite de-escaladarea dozelor totale de radiații administrate în prezent pacienților cu cancer de sân, reducând astfel efectele adverse acute și pe termen lung.

Mergi la:

Concluzie și rezumat

În rezumat, studiul nostru arată că radiațiile ionizante au reactivat expresia Oct4 și Sox2 și au indus un fenotip CSC în celulele cancerului de sân anterior netumorigenice. Fenomenul a fost dependent de inducerea poliploidiei și a semnalizării Notch. Concluzionăm că o înțelegere detaliată a căilor subiacente ar putea duce la terapii combinate noi care vor spori potențial eficacitatea tratamentului cu radiații.

Mergi la:

Material suplimentar

Supp Fig S1-S7

Click aici pentru a vizualiza. (4,1 M, pdf)

Supp Tabel S1

Click aici pentru a vizualiza. (174K, document)

Supp Tabel S2

Click aici pentru a vizualiza. (158K, document)

Supp Tabel S3

Click aici pentru a vizualiza. (32K, document)

01

Click aici pentru a vizualiza. (81K, pdf)

Mergi la:

Mulțumiri

Acordați sprijin

FP a fost susținută de subvenții din California Breast Cancer Research Program (15NB-0153), Departamentul de Apărare (W81XWH-07-1-0065) și Institutul Național al Cancerului (5RO1CA137110). CL a fost susținut de un premiu din partea Fundației pentru Familie Ward.

Mergi la:

Note de subsol

Contribuția autorilorChann Lagadec : Concepție și proiectare, Colectare și asamblare de date, Analiza și interpretarea datelor, Scrierea manuscriselor;

Erina Vlashi : Concepție și design, Analiza și interpretarea datelor;

Lorenza Della Donna : Concepție și design;

Carmen Dekmezian : Colectarea si asamblarea datelor;

Frank Pajonk : Concepție și proiectare, Analiza și interpretarea datelor, Scrierea manuscrisului, Aprobarea finală a manuscrisului, Sprijin financiar;

Mergi la:

Referințe

1. 

Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Identificarea prospectivă a celulelor canceroase de sân tumorigene. Proc. Natl Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2003; 100 :3983–3988. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]2. 

Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E, et al. ALDH1 este un marker al celulelor stem mamare umane normale și maligne și un predictor al rezultatelor clinice slabe. Celulă stem celulară. 2007; 1 :555–567. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]3. 

Charafe-Jauffret E, Ginestier C, Iovino F, et al. Celulele stem canceroase aldehiddehidrogenaza 1-pozitive mediază metastazele și rezultatul clinic slab în cancerul de sân inflamator. Clin Cancer Res. 2010; 16 :45–55. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]4. 

Marcato P, Dean CA, Pan D, et al. Activitatea aldehidei dehidrogenazei a celulelor stem din cancerul de sân se datorează în principal izoformei ALDH1A3, iar expresia acesteia este predictivă pentru metastaze. Celule stem. 2010 [ PubMed ] [ Google Scholar ]5. 

Phillips TM, McBride WH, Pajonk F. Răspunsul celulelor CD24(-/low)/CD44+ care inițiază cancerul de sân la radiații. J Natl Cancer Inst. 2006; 98 :1777–1785. [ PubMed ] [ Google Scholar ]6. 

Woodward WA, Chen MS, Behbod F, și colab. WNT/beta-catenina mediază rezistența la radiații a celulelor progenitoare mamare de șoarece. Proc Natl Acad Sci US A. 2007; 104 :618–623. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]7. 

Li HZ, Yi TB, Wu ZY. Cultură în suspensie combinată cu agenți chimioterapeutici pentru sortarea celulelor stem de cancer de sân. BMC Cancer. 2008; 8 :135. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]8. 

Celulele stem Bao S. Glioma promovează radiorezistența prin activarea preferențială a răspunsului la deteriorarea ADN-ului. Natură. 2006; 444 :756–760. [ PubMed ] [ Google Scholar ]9. 

Vlashi E, Kim K, Lagadec C, et al. Imagistica in vivo, urmărirea și țintirea celulelor stem canceroase. J Natl Cancer Inst. 2009; 101 :350–359. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]10. 

Lagadec C, Vlashi E, Della Donna L, et al. Capacitatea de supraviețuire și auto-reînnoire a celulelor inițiatoare de cancer de sân în timpul tratamentului cu radiații fracționate. Cancer mamar Res. 2010; 12 :R13. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]11. 

Mitchell ID, Carlton JB, Chan MY, et al. Poliploidie indusă de noscapină in vitro. Mutageneză. 1991; 6 :479–486. [ PubMed ] [ Google Scholar ]12. 

Dontu G, Jackson KW, McNicholas E, et al. Rolul semnalizării Notch în determinarea destinului celular al celulelor stem/progenitoare mamare umane. Cancer mamar Res. 2004; 6 :R605–R615. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]13. 

Fillmore CM, Kuperwasser C. Liniile de celule de cancer de sân uman conțin celule stem care se auto-reînnoiesc, dau naștere la descendență fenotipic diverse și supraviețuiesc chimioterapiei. Cancer mamar Res. 2008; 10 :R25. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]14. 

Patel M, Yang S. Progrese în reprogramarea celulelor somatice la celule stem pluripotente induse. Stem Cell Rev. 2010; 6 :367–380. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]15. 

Zhao R, Daley GQ. De la fibroblaste la celulele iPS: pluripotență indusă de factori definiți. J Cell Biochim. 2008; 105 :949–955. [ PubMed ] [ Google Scholar ]16. 

Wu K, Jiao X, Li Z și colab. Factorul de determinare a destinului celular teckelul reprogramează funcția celulelor stem ale cancerului de sân. J Biol Chem. 2010 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]17. 

Chen ZY, Wang X, Zhou Y, et al. Destabilizarea proteinei factorului 4 asemănător Kruppel ca răspuns la stimularea serică implică calea ubiquitină-proteazom. Cancer Res. 2005; 65 :10394–10400. [ PubMed ] [ Google Scholar ]18. 

Baltus GA, Kowalski MP, Zhai H, et al. Acetilarea sox2 induce exportul său nuclear în celulele stem embrionare. Celule stem. 2009; 27 :2175–2184. [ PubMed ] [ Google Scholar ]19. 

Moretto-Zita M, Jin H, Shen Z, et al. Fosforilarea stabilizează Nanog prin promovarea interacțiunii sale cu Pin1. Proc Natl Acad Sci US A. 2010; 107 :13312–13317. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]20. 

Xu H, Wang W, Li C și colab. WWP2 promovează degradarea factorului de transcripție OCT4 în celulele stem embrionare umane. Cell Res. 2009; 19 :561–573. [ PubMed ] [ Google Scholar ]21. 

Baia GS, Stifani S, Kimura ET, et al. Activarea Notch este asociată cu tetraploidie și instabilitate cromozomială sporită în meningioame. Neoplazie. 2008; 10 :604–612. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]22. 

Bese NS, Sut PA, Ober A. Efectul întreruperilor de tratament în iradierea postoperatorie a cancerului de sân. Oncologie. 2005; 69 :214–223. [ PubMed ] [ Google Scholar ]23. 

Withers HR, Maciejewski B, Taylor JM și colab. Repopularea accelerată în cancerul de cap și gât. Radiat fata Ther Oncol. 1988; 22 :105–110. [ PubMed ] [ Google Scholar ]24. 

Heddleston JM, Li Z, McLendon RE, et al. Micromediul hipoxic menține celulele stem de glioblastom și promovează reprogramarea către un fenotip de celule stem canceroase. Ciclul celulei. 2009; 8 :3274–3284. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]25. 

Charles N, Ozawa T, Squatrito M, et al. Oxidul nitric perivascular activează semnalizarea crestăturii și promovează caracterul asemănător tulpinii în celulele gliom induse de PDGF. Celulă stem celulară. 2010; 6 :141–152. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]26. 

Leis O, Eguiara A, Lopez-Arribillaga E, et al. Expresia Sox2 în tumorile mamare și activarea în celulele stem ale cancerului de sân. Oncogene. 2011 [ PubMed ] [ Google Scholar ]27. 

Ezeh UI, Turek PJ, Reijo RA, et al. Genele celulelor stem embrionare umane OCT4, NANOG, STELLAR și GDF3 sunt exprimate atât în ​​seminom, cât și în carcinomul mamar. Cancer. 2005; 104 :2255–2265. [ PubMed ] [ Google Scholar ]28. 

Beltran AS, Rivenbark AG, Richardson BT, et al. Generarea de celule inițiatoare de tumoră prin livrarea exogenă a factorului de transcripție OCT4. Cancer mamar Res. 2011; 13 :R94. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]29. 

Salmina K, Jankevics E, Huna A, et al. Reglarea în sus a rețelei de auto-reînnoire embrionară prin poliploidie reversibilă în celulele tumorale mutante p53 iradiate. Exp Cell Res. 2010; 316 :2099–2112. [ PubMed ] [ Google Scholar ]30. 

Paget S. Distribuția creșterilor secundare în cancerul de sân. Lancet. 1889; 1 :571–573. [ PubMed ] [ Google Scholar ]31. 

Quintana E, Shackleton M, Sabel MS, et al. Formarea eficientă a tumorii de către celulele melanomului uman unice. Natură. 2008; 456 :593–598. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]32. 

Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Celule stem, cancer și celule stem canceroase. Natură. 2001; 414 :105–111. [ PubMed ] [ Google Scholar ]

Exprimati-va pararea!

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest site folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.