Doxiciclina, un inhibitor al biogenezei mitocondriale, reduce în mod eficient celulele stem canceroase (CSC) la pacienții timpurii cu cancer de sân: un studiu clinic pilot

Abstract

Context și obiective: Celulele stem canceroase (CSC) au fost implicate în inițierea tumorii, recidivă, răspândire metastatică și supraviețuire slabă în mai multe tipuri de tumori, inclusiv cancerele de sân. CSC-urile supraexprimă selectiv proteinele cheie legate de mitocondrie, iar inhibarea funcției mitocondriale poate reprezenta o nouă abordare potențială pentru eradicarea CSC. Deoarece mitocondriile au evoluat din bacterii, multe clase de antibiotice aprobate de FDA, inclusiv doxiciclina, vizează de fapt mitocondriile. Studiul nostru pilot clinic și-a propus să determine dacă tratamentul preoperator pe termen scurt cu doxiciclină orală are ca rezultat reducerea CSC la pacienții cu cancer mamar timpuriu.

Metode: Doxiciclina a fost administrată oral timp de 14 zile înainte de intervenția chirurgicală pentru o doză zilnică de 200 mg. Analiza imuno-histochimică a probelor încorporate în parafină fixată în formol (FFPE) de la 15 pacienți, dintre care 9 au fost tratați cu doxiciclină și 6 au fost martori (fără tratament), a fost efectuată cu biomarkeri cunoscuți ai „tulpinii” (CD44, ALDH1), mitocondriile (TOMM20), proliferarea celulară (Ki67, p27), apoptoza (caspaza-3 scindată) și neo-angiogeneza (CD31). Pentru fiecare pacient, analiza a fost efectuată atât pe specimene preoperatorii (core-biopsii) cât și pe specimene chirurgicale. Modificările de la momentul inițial la post-tratament au fost evaluate cu MedCalc 12 (test t nepereche ) și ANOVA.

Rezultate: Probele de tumoră post-doxiciclină au demonstrat o scădere semnificativă statistic a markerului de stemness CD44 ( valoarea p < 0,005), în comparație cu probele de tumoră pre-doxiciclină. Mai precis, nivelurile de CD44 au fost reduse între 17,65 și 66,67%, la 8 din 9 pacienți tratați cu doxiciclină. În schimb, doar un pacient a prezentat o creștere a CD44, cu 15%. În general, aceasta reprezintă o rată de răspuns pozitivă de aproape 90%. Rezultate similare au fost obținute și cu ALDH1, un alt marker al tulpinii. În schimb, markerii mitocondriilor, proliferării, apoptozei și neo-angiogenezei au fost toți similari între cele două grupuri.

Concluzii: Scăderile cantitative ale expresiei CD44 și ALDH1 sunt în concordanță cu experimentele preclinice și sugerează că doxiciclina poate eradica selectiv CSC la pacienții cu cancer de sân in vivo . Vor fi efectuate studii viitoare (cu un număr mai mare de pacienți) pentru a valida aceste studii pilot promițătoare.

Front Oncol. 2018; 8: 452. . doi:  10.3389/fonc.2018.00452 PMCID: PMC6194352PMID:  30364293

Cristian Scatena , ¹ Manuela Roncella , ^1, 2 Antonello Di Paolo , ³ Paolo Aretini , ⁴ Michele Menicagli , 

⁴ Giovanni Fanelli , ⁵ Carolina Marini , ⁶ Chiara Maria Mazzanti , ⁴ Matteo Ghilli , ² Federica Sotgia , 

⁷ Michael P. Lisanti , ^{7 , *} și Antonio Giuseppe Naccarato ^1, *

 Informații despre autor Note despre articol Informații privind drepturile de autor și licență Declinare a răspunderii

Materiale suplimentare

Introducere

Celulele inițiatoare de tumori (TIC) au multe caracteristici funcționale cu celulele stem normale și sunt factori importanți ai inițierii tumorii și a progresiei cancerului ( 1 – 7 ). Ca atare, noi terapii pentru țintirea TIC [alias, celulele stem canceroase (CSC)] ar putea fi utilizate pentru prevenirea cancerului. Interesant este că celulele tumorale circulante (CTC) se pot comporta și ca inițiatori ai formării tumorii.

Datorită rezistenței lor la tratamentele anticancer convenționale (de exemplu, chimioterapie și radioterapie), se crede că CSC-urile susțin, de asemenea, baza celulară și moleculară a recidivei tumorii, a metastazelor la distanță și, în cele din urmă, a eșecului tratamentului, în majoritatea tipurilor de cancer ( 1 ). – 6 ). Astfel, sunt necesare urgent noi strategii de tratament pentru a ajuta la remedierea acestei nevoi clinice nesatisfăcute ( 1 – 4 ).

O idee simplistă este de a identifica noi ținte terapeutice care sunt relativ unice pentru CSC, care pot fi apoi inhibate cu medicamente aprobate de FDA care prezintă puține efecte secundare și au profiluri excelente de siguranță ( 1 – 3 ). Am folosit recent această abordare promițătoare pentru a identifica mitocondriile în CSC ca o țintă terapeutică conservată ( 7 ). În acest context, antibioticul doxiciclină a apărut ca un candidat excelent pentru reutilizarea medicamentelor ( 8 , 9 ).). În 1967, doxiciclina a fost aprobată pentru prima dată de FDA, cu peste 50 de ani în urmă. Prezintă efecte secundare minime și este utilizat în prezent în întreaga lume ca antibiotic cu spectru larg, în principal pentru tratamentul acneei și acneei rozacee. Doxiciclina are o farmacocinetică excelentă, cu o absorbție orală foarte bună (~100%) și un timp de înjumătățire seric lung (18–22 ore), la doza standard de 200 mg pe zi.

Doxiciclina se comportă funcțional ca un inhibitor netoxic al biogenezei mitocondriale, din cauza asemănărilor conservate evolutiv dintre ribozomii bacterieni și ribozomii mitocondriali ( 10 – 12 ). Prin urmare, acest „efect secundar gestionabil” al doxiciclinei ar putea fi reutilizat ca un „efect terapeutic”, pentru a viza și inhiba biogeneza mitocondrială în CSC ( 13 , 14 ).

Anterior, doxiciclina a fost utilizată clinic pentru a viza infecțiile asociate cancerului, cu rezultate promițătoare, ducând la un răspuns patologic complet (CPR) sau „remisie” la pacienții cu limfom MALT ( 15 , 16 ). Interesant, acest CPR nu s-a corelat cu prezența microorganismelor, sugerând posibil că doxiciclina ar putea acționa asupra celulelor tumorale în sine.

În 2015, laboratorul Sotgia/Lisanti a demonstrat pentru prima dată că tratamentul cu doxiciclină a fost suficient pentru a opri cu succes propagarea CSC in vitro ( 13 , 14 ). În acest scop, am testat 12 linii celulare tumorale umane diferite, reprezentând opt tipuri diferite de cancer, cum ar fi DCIS, sân [ER(+) și ER(-)], carcinoame pulmonare, ovariene, pancreatice și de prostată, precum și glioblastomul. (GBM) și melanom ( 13 ). În mod remarcabil, doxiciclina a inhibat propagarea CSC în întregul panou de linii celulare diverse ( 13 ).

Studii mecanice suplimentare, folosind teste pe bază de luciferază în celulele MCF7 (o linie celulară de cancer de sân uman) au arătat că tratamentul cu doxiciclină inhibă eficient semnalizarea CSC, pe căi multiple, inclusiv semnalizarea Wnt, Notch, Hedgehog și STAT1/3 ( 14 ). Prin urmare, doxiciclina este un candidat excelent pentru reutilizarea medicamentelor, în studiile pilot clinice care vizează validarea capacității sale de a viza CSC la pacienții cu cancer. Ca atare, aici am evaluat capacitatea doxiciclinei de a viza CSC la pacienții cu cancer de sân in vivo , folosind markeri CSC bine stabiliți (CD44 și ALDH1) ca citire.

Capacitatea doxiciclinei de a viza CSCs mamare in vitro a fost deja confirmată independent ( 17 , 18 ) și extinsă la câteva alte clase de antibiotice și inhibitori mitocondriali OXPHOS ( 19 – 24 ). În concordanță cu aceste constatări, masa mitocondrială este crescută în CSC ( 25 , 26 ) și nivelurile ridicate de expresie ale markerilor mitocondriali se corelează direct cu un rezultat clinic slab la pacienții cu cancer ovarian ( 27 ) și mamar ( 28 ).

În cele din urmă, încă din 2002, a fost raportat pentru prima dată că doxiciclina reduce în mod eficient metastazele osoase, cu până la ~ 60–80%, într-un model murin preclinic in vivo de cancer de sân uman ( 29 ). Din punct de vedere mecanic, aceste constatări se pot datora capacității doxiciclinei de a eradica CSC, deși această ipoteză nu a fost testată la acel moment.

Mergi la:

Rezultate

Descrierea populației de pacienți cu cancer de sân

O diagramă rezumată care evidențiază structura organizatorică a acestui studiu cu „fereastra de oportunitate” (Faza II) a doxiciclinei este prezentată în figura​Figura 11.

figura 1

Diagrama schematică care rezumă structura organizatorică a studiului pilot clinic Doxiciclină. Rețineți că acest format de Faza II „Fereastra de oportunitate” oferă un mecanism clinic excelent pentru evaluarea antibioticelor aprobate de FDA, ca potențiali candidați pentru reutilizarea medicamentelor.

Un total de 15 paciente de sex feminin cu cancer mamar timpuriu au participat la studiul pilot actual. Nouă pacienți au primit doxiciclină (200 mg pe zi) pentru o perioadă de 14 zile, în timp ce șase pacienți au rămas netratați. Un rezumat al caracteristicilor clinice ale populației de pacienți este prezentat în tabel​Tabelul 11.

tabelul 1

Caracteristicile clinice ale populației de pacienți.

Pacienți tratați	Vârstă	Dimensiunea tumorii (mm)	Nota	Subtipul molecular
Cazul 1	42	12	2	Luminal A
Cazul 2	57	15	3	HER2poz
Cazul 4	65	23	3	HER2poz
Cazul 5	52	10	2	Luminal A
Cazul 7	46	12	2	Luminal A
Cazul 8	46	27	2	Lumina B
Cazul 13	50	10	2	Luminal A
Cazul 14	52	13	1	Luminal A
Cazul 15	44	30	2	Luminal A
Pacienți netratați
Cazul 3	71	25	3	Lumina B
Cazul 6	50	15	2	Luminal A
Cazul 9	51	12	2	Luminal A
Cazul 10	48	25	3	Lumina B
Cazul 11	41	21	2	Luminal A
Cazul 12	69	16	3	Luminal/HER2poz

Deschide într-o fereastră separată

Pe scurt, în grupul de tratament cu doxiciclină, vârsta pacientului la diagnostic a variat între 42 și 65 de ani, dimensiunea tumorii a fost între 10 și 30 mm, iar 6 din 9 pacienți au fost de gradul 2. În plus, 7 din 9 pacienți au fost ER. (+), cu 6 fiind de subtipul luminal A și unul din subtipul luminal B. În plus, doi pacienți erau de subtip HER2(+).

În grupul de control netratat, vârsta pacientului a variat între 41 și 71 de ani, iar dimensiunea tumorii a fost între 12 și 25 mm; 3 pacienți au fost de gradul 2 și 3 pacienți au fost de gradul 3. Toți cei 6 pacienți au fost ER(+), cu 3 din subtipul luminal A, 2 din subtipul luminal B și unul prezentând caracteristicile ambelor luminal/HER2(+). ) subtipuri.

Astfel, ambele grupuri au fost bine potrivite pentru vârsta și caracteristicile clinice.

Starea biomarkerilor în secțiunile de țesut tumoral, înainte și după administrarea orală de doxiciclină

Am evaluat cantitativ expresia mai multor biomarkeri diversi în secțiuni de țesut tumoral încorporate în parafină. Acestea au inclus markeri de „stemness” (CD44, ALDH1), mitocondrii (TOMM20), proliferare celulară (Ki67, p27), apoptoză (caspaza-3 scindată) și neo-angiogeneză (CD31).

Figura​Figura 22evidențiază faptul că majoritatea markerilor tumorali au rămas neschimbați înainte și după administrarea orală de doxiciclină, cu excepția CD44 – un marker de „stemness”. Mai precis, CD44 a fost redus în medie cu ~40% ( p < 0,005), la pacienții examinați. Rețineți că 4 din 9 pacienți au prezentat reduceri de 50% sau mai mult în CD44.

Figura 2

Efectele administrării doxiciclinei asupra expresiei a șase clase diferite de biomarkeri la pacienții cu cancer mamar timpuriu (Ki67, Cleaved Caspase-3, CD31, CD44, p27 și TOMM20). Rețineți că doar nivelurile CD44 au fost reduse semnificativ în medie cu aproape 40% (***; p < 0,005), în timp ce nivelurile altor markeri au rămas neschimbate. Rezultatele analizei multivariate sunt incluse ca Informații suplimentare și arată că CD44 a rămas semnificativ (ANOVA; p < 0,0007) și a fost independent de toate celelalte variabile testate [grad histologic (1, 2, 3), tipul diametrului (mic, mare) și subtipul molecular] (vezi Tabelele S1 – S15 ).

Rezultatele analizei multivariate sunt incluse ca informații suplimentare și au demonstrat că reducerile CD44 au rămas semnificative (ANOVA; p < 0,0007) și au fost independente de toate celelalte variabile testate [inclusiv gradul histologic (1, 2, 3), tipul diametrului tumorii. (mic, mare) și subtip molecular] (vezi tabelele S1 – S15 ). În schimb, nivelurile de caspază-3 scindate au părut a fi crescute după administrarea orală de doxiciclină; cu toate acestea, aceasta nu a atins semnificație statistică, cu excepția cazului de grad histologic scăzut (vezi tabelul S4 ).

Figura​Figura 33prezintă o diagramă în cascadă a expresiei CD44 la 9 pacienți individuali cu cancer de sân. În mod remarcabil, nivelurile de CD44 au fost reduse între 17,65 și 66,67%, la 8 din 9 pacienți tratați cu doxiciclină. Imaginile reprezentative ale acestei reduceri a imunocolorării CD44 sunt ilustrate în figură​Figura 44pentru doi pacienți. În schimb, doar un pacient a prezentat o creștere a CD44, cu 15%. În general, aceasta reprezintă o rată de răspuns pozitivă care se apropie de 90%. Este de remarcat faptul că nivelurile de caspază-3 scindată au fost cel mai izbitor crescute la cei doi pacienți (Cazurile 8 și 14) care au prezentat cele mai mari reduceri ale expresiei CD44 (Figura​(Figura 5).5). Prin urmare, poate fi necesar să se atinse un anumit nivel de prag pentru a crește activarea caspazei-3.

Figura 3

Efectul administrării doxiciclinei asupra expresiei CD44 la pacienții timpurii cu cancer de sân: diagramă în cascadă. Rețineți că nivelurile de CD44 au fost reduse între 17,65 și 66,67%, la 8 din 9 pacienți tratați. În schimb, doar un pacient a prezentat o creștere a CD44, cu 15%. În general, aceasta reprezintă o rată de răspuns pozitivă de aproape 90%. De asemenea, rețineți că 4 din 9 pacienți au prezentat reduceri de 50% sau mai mult în CD44.

Figura 4

Efectul administrării doxiciclinei asupra expresiei CD44 la pacienții cu cancer mamar timpuriu: sunt prezentate imagini reprezentative. Rețineți că tratamentul cu doxiciclină reduce expresia CD44, așa cum se vede prin colorarea imuno-histochimică. Sunt prezentate imagini reprezentative din două cazuri. Mărire, 40X.

Figura 5

Efectul administrării doxiciclinei asupra nivelurilor de caspază 3 scindată la pacienții timpurii cu cancer de sân. Rețineți că nivelurile de caspază 3 scindată au prezentat cele mai mari creșteri la doi pacienți, care au demonstrat cele mai mari reduceri ale nivelurilor de CD44 (Cazurile 8 și 14); compara cu figura​Figura 3.3. În plus, nivelurile de caspază 3 scindată au fost crescute la 4 din 9 pacienți studiați (~44 %).

Cei doi pacienți din subtipul HER2(+), au prezentat, de asemenea, pozitivitate pentru un alt marker de celule stem, și anume ALDH1. Interesant, nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu aproape 60% la un pacient (Cazul 2), în timp ce nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu ~90% la celălalt pacient (Cazul 4) (Figura 4).​(Figura 6),6), toate ca răspuns la doxiciclină. Aceste rezultate sunt, de asemenea, în concordanță cu reducerea CD44; la aceiași doi pacienți HER2(+), nivelurile CD44 au fost reduse cu aproape 40% (Cazul 2) și, respectiv, cu 60% (Cazul 4) (Figura​(Figura 33).

Figura 6

Efectul administrării doxiciclinei asupra expresiei ALDH1 la pacienții cu cancer de sân precoce HER2(+). Cei doi pacienți din subtipul HER2(+), au prezentat, de asemenea, pozitivitate pentru un alt marker de celule stem, și anume ALDH1. Rețineți că nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu aproape 60% la un pacient (Cazul 2), în timp ce nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu 90% la celălalt pacient (Cazul 4), ca răspuns la doxiciclină.

Starea biomarkerilor în secțiunile de țesut tumoral din grupul de control netratat, înainte și după operație

Spre deosebire de rezultatele noastre cu populația de pacienți tratați cu doxiciclină, pacienții din grupul de control netratat nu au prezentat modificări semnificative statistic în expresia CD44, atunci când secțiunile de țesut tumoral au fost comparate înainte și după operație (Figura S1 ). Rezultatele analizei multivariate sunt incluse ca informații suplimentare (Tabelele S11–S15 ) și au arătat că CD44 a rămas neschimbat (a se vedea Tabelul S13 ; ANOVA; P <0,7707).

Prin urmare, intervenția chirurgicală în sine nu a fost suficientă pentru a modifica semnificativ nivelurile de expresie ale markerilor tumorali examinați, inclusiv CD44.

Mergi la:

Discuţie

Aici, am efectuat un studiu pilot clinic cu doxiciclină, pentru a evalua efectele acesteia la pacienții timpurii cu cancer de sân. Important este că majoritatea biomarkerilor testați au rămas neschimbați, cu excepția CD44, care a fost redus în medie cu aproape 40%, într-o perioadă de numai două săptămâni de tratament. Analiza datelor grafice în cascadă a arătat că la 8 din 9 pacienți tratați cu doxiciclină, nivelurile de CD44 au fost reduse între 17,65 și 66,67%. În schimb, doar un pacient a prezentat o creștere a CD44, cu 15%. Doi pacienți din subtipul HER2(+), au prezentat, de asemenea, pozitivitate pentru un alt marker de celule stem, și anume ALDH1. La acesti pacienti HER2(+), nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu aproape 60% la un pacient, in timp ce nivelurile de ALDH1 au fost reduse cu 90% la celalalt pacient, ca raspuns la doxiciclina. Astfel, tratamentul oral cu doxiciclină a redus în mod eficient expresia a doi markeri CSC,

Rezultatele noastre actuale in vivo sunt în concordanță cu descoperirile recente în celulele MCF7 și MDA-MB-468, două linii celulare de cancer de sân uman în cultură, care au arătat reduceri semnificative ale populației CSC CD44(+)/CD24(-/low) după tratament cu doxiciclină ( 17 ). În plus, nivelurile de expresie ale altor markeri de „stemness” (Oct4, Sox2, Nanog și CD44) au fost, de asemenea, reduse cu > 50%, ca răspuns la doxiciclină, așa cum a fost evaluat prin nivelurile de ARNm și confirmat în mod independent prin analiza imuno-blot ( 17 ) .

În mod similar, s-a demonstrat că doxiciclina reduce CSC-urile de sân ALDH(+) în liniile celulare de cancer de sân uman HER2(+) și triple negative in vitro ( 18 ). Ca atare, doxiciclina poate fi utilă pentru țintirea atât a subpopulațiilor CD44(+) cât și ALDH(+) ale CSC-urilor de sân uman ( 17 , 18 ).

Nivelurile de caspază-3 scindată par să fie crescute după tratamentul cu doxiciclină; cu toate acestea, aceasta nu a atins semnificație statistică în toate gradele tumorii. Cu toate acestea, s-a demonstrat că doxiciclina induce apoptoza în liniile celulare de cancer de sân uman in vitro ( 17 ).

Mergi la:

Concluzii

Tratamentul preoperator cu doxiciclină orală (200 mg pe zi) timp de 2 săptămâni este suficient pentru a reduce expresia CD44 și ALDH1 în țesutul tumoral de la pacienții cu cancer mamar timpuriu. Cu toate acestea, studii clinice suplimentare (cu un număr mai mare de pacienți) vor fi necesare pentru a valida în continuare aceste studii pilot clinice promițătoare.

Mergi la:

Materiale și metode

Construirea studiilor, revizuirea etică și înregistrarea studiilor clinice în UE

Un studiu clinic de fază II (studiu preoperator în „fereastră”; Figura​Figura 1)1) pentru utilizarea doxiciclinei orale la pacienții cu cancer mamar timpuriu a fost prezentat, revizuit și aprobat de comitetele de etică locale și naționale de la Spitalul Universitar din Pisa și de Ministerul italian al Sănătății (Roma, Italia). Toți pacienții au primit consimțământ informat în scris, înainte de includerea lor în studiu. Doxiciclina a fost administrată în „fereastra de oportunitate”, după diagnostic și cu exact 14 zile înainte de data intervenției chirurgicale, în timp ce pacientul aștepta excizia tumorii la intervenție chirurgicală. Acronimul pentru studiu este ABC (Antibiotice pentru cancerul de sân), iar numărul de înregistrare EudraCT este 2016-000871-26. EudraCT este baza de date europeană a studiilor clinice (European Union Drug Regulating Authorities Clinical Trials). Titlul complet al studiului este: „Un studiu de fezabilitate pre-chirurgical, randomizat, controlat, deschis, de fază II, al doxiciclinei în cancerul de sân precoce.” Obiectivul și scopul principal al studiului este de a determina dacă tratamentul preoperator pe termen scurt (2 săptămâni) cu doxiciclină orală la pacienții cu cancer de sân în stadiul I-III precoce are ca rezultat inhibarea markerilor de proliferare tumorală, așa cum este determinat de o reducere a Ki67 tumorii de la valoarea inițială (pre-tratament) până la post-tratament (la momentul exciziei chirurgicale). Doxiciclina (marca Bassado) a fost administrată pe cale orală, 100 mg de două ori pe zi pentru un total de 200 mg pe zi, pe o perioadă de 14 zile. În această perioadă, grupul de control nu a primit nicio terapie medicală (adică standard de îngrijire: așteptarea unei intervenții chirurgicale). Informațiile despre subiectele de studiu sunt păstrate confidențiale și gestionate în conformitate cu cerințele reglementărilor UE și italiene.

Nivelurile plasmatice ale doxiciclinei

Aportul oral de doxiciclină a fost validat prin măsurarea concentrațiilor din probele de plasmă, obținute imediat înaintea intervenției chirurgicale [media +/– SD, 0,76 ± 0,41 mg/L, interval 0,25–1,57 mg/L]. Nivelurile de doxiciclină au fost determinate prin analiza spectrometriei de masă. Această monitorizare precisă a confirmat conformitatea pacienților la regimul de tratament planificat, propus acestora la momentul înscrierii.

Reactivi de imunocolorare

Anticorpii pentru imuno-colorare au fost achiziționați din surse comerciale, așa cum este rezumat pe scurt în Tabelul S16 .

Imuno-colorare și cuantificare

Expresia tumorală a Ki67, p27, caspaza 3 scindată, CD31, markerii CSC (CD44, ALDH1) și mitocondriile (TOMM20) a fost efectuată pe țesuturi tumorale încorporate în parafină fixate în formalină. Secțiuni de țesut (4 microni) au fost deparafinate cu xilen și rehidratate printr-o serie de alcool gradat. După clătire cu soluție salină tampon fosfat (PBS), proba au fost scufundate în tampon citrat de sodiu (pH 6) pentru p27 și caspaza 3 scindată și în tampon UNMASKER (pH 7,8) pentru CD44, TOMM20, ADLH1 și încălzite într-un cuptor cu microunde la 100°C. Peroxidaza endogenă a fost blocată prin incubare de 10 minute în _H2O2 3 _%. După blocarea cu ser normal de capră timp de 10 minute la temperatura camerei, lamelele au fost incubate în continuare peste noapte la 4°C cu următorii anticorpi primari: șoarece anti CD44 (1:1000, clona 156-3C11), șoarece anti-ALDH1A1, (1 :500, clona 703410), caspaza 3 anticlivată de iepure (Asp175; 1:150), anti-p27 de iepure (1:250) şi anti TOMM20 de şoarece (1:250, clona F-10). A fost aplicat un anticorp secundar derivat de capră conjugat cu biotină, urmat de streptavidină marcată cu enzimă și cromogen de substrat (kit IHC de detecție HRP/DAB-ABC specific pentru iepure/șoarece, Abcam). Lamele au fost contracolorate cu hematoxilină.

Imunocolorarea pentru Ki67 (gata de utilizare, clona MIB-1, Dako) și CD31 (gata de utilizare, clona JC70, Ventana Medical Systems) a fost efectuată în schimb într-un imunocolorator automat (BenchMark Ultra, Ventana Medical Systems). Au fost măsurate intensitatea colorării și procentul de celule tumorale pozitive. Ki67 este un marker nuclear exprimat în toate fazele ciclului celular, cu excepția _G0. „Indexul Ki67” (procentul de nuclee care prezintă imuno-reactivitate nucleară de orice intensitate) a fost determinat conform protocoalelor de rutină. p27 (colorarea nucleară) este un inhibitor al ciclului celular care se corelează negativ cu Ki67. Caspaza-3 (colorarea citoplasmatică și/sau nucleară) este sintetizată ca o pro-enzimă inactivă care este activată prin scindare în celulele care suferă apoptoză. CD31 (colorarea membranoasă) este exprimată de celulele endoteliale și este folosit ca marker al angiogenezei. CD44 (colorarea membranoasă: completă sau incompletă, de orice intensitate) și ALDH1 (colorarea citoplasmatică) sunt markeri bine stabiliți care sunt crescuti în celulele cu caracteristici „de tip tulpină”. TOMM20 (colorarea citoplasmatică), o componentă centrală a complexului receptor responsabil pentru recunoașterea și translocarea preproteinelor mitocondriale sintetizate citosol; este folosit ca marker al mitocondriilor. Procentul de colorare a celulelor tumorale pozitive a fost măsurat independent de doi patologi orbi. Discrepanțele în interpretare sau scor (< 5% din cazuri) au fost rezolvate prin conferință de consens la un microscop cu două capete. Toate modificările markerilor tumorali au fost analizate ca procent (pre-post/pre x 100) și o modificare absolută (pre-post) față de valoarea inițială.

analize statistice

Valorile markerilor înainte de tratament au fost referința noastră (100%), iar toate celelalte valori măsurate după tratament sunt prezentate ca raport post/pre, pentru a evidenția eventualele creșteri sau scăderi față de valoarea de referință. Valorile din grafice sunt reprezentate de valoarea medie a fiecărui obiectiv, cu eroarea standard relativă a mediei (SEM). Diferențele semnificative au fost evaluate cu MedCalc 12 ( test t nepereche). Valorile p < 0,05 au fost considerate semnificative statistic. S-a efectuat și o analiză multivariată cu ANOVA, iar rezultatele acestei analize sunt incluse ca informații suplimentare (a se vedea tabelele S1 – S15 ).

Mergi la:

Contribuții ale autorului

Studiul ABC se desfășoară la Centrul de îngrijire a sânilor din Spitalul Universitar din Pisa. Recrutarea pacienților este condusă de chirurgi (MR și MG). FS și ML au conceput inițial ideea unui studiu clinic pe cancer de sân pe bază de doxiciclină și au scris o primă schiță a studiului clinic. CS, MR, AD, GF, CM, MG, CMM și AN au editat și implementat studiul clinic. CS a procesat probele de țesut și a generat cifrele finale. MM a efectuat imuno-colorarea secțiunilor de țesut. AD a efectuat analiza dozelor de sânge de doxiciclină. PA a efectuat analizele statistice. FS și ML au scris prima schiță a lucrării, care a fost editată și aprobată de toți coautorii.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Mergi la:

Note de subsol

Finanțarea. Această activitate a fost susținută de donații generoase din partea Fundației pentru viață sănătoasă (HLF) și a Fundației Foxpoint (către FS și MPL), precum și a Fundației pentru Știință din Pisa (la Spitalul Universitar din Pisa). Autorii doresc să mulțumească și Katiei De Ieso de la Laboratorul de Imunohistochimie, Departamentul de Medicină de Laborator, Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, Pisa, Italia.

Mergi la:

Material suplimentar

Materialul suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online la: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2018.00452/full#supplementary-material

Faceți clic aici pentru un fișier de date suplimentar. ^{(63K, DOCX)}

Faceți clic aici pentru un fișier de date suplimentar. ^{(29K, DOCX)}

Faceți clic aici pentru un fișier de date suplimentar. ^{(16K, DOCX)}

Figura S1

Exprimarea a șase clase diferite de biomarkeri la pacienții timpurii cu cancer de sân. Spre deosebire de rezultatele noastre cu populația de pacienți tratați cu doxiciclină, pacienții din grupul de control netratat nu au prezentat modificări semnificative în exprimarea markerilor tumorali, atunci când au fost comparate secțiunile tumorale, înainte și după operație.

Faceți clic aici pentru un fișier de date suplimentar. ^{(59K, tiff)}

Mergi la:

Referințe

1. 

Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pagés M, Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP. Metabolismul cancerului: o perspectivă terapeutică . Nat Rev Clin Oncol. (2017) 14 :11–31. 10.1038/nrclinonc.2016.60 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]2. 

Martinez-Outschoorn UE, Sotgia F, Lisanti MP. Caveole și semnalizare în cancer . Nat Rev Cancer (2015) 15 :225–37. 10.1038/nrc3915 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]3. 

De Francesco EM, Sotgia F, Lisanti MP. Celulele stem canceroase (CSC): strategii metabolice pentru identificarea și eradicarea lor . Biochim J. (2018) 475 :1611–34. 10.1042/BCJ20170164 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]4. 

Peiris-Pagès M, Martinez-Outschoorn UE, Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP. Metabolismul celulelor stem canceroase . Cancer mamar Res . (2016) 18:55 . 10.1186/s13058-016-0712-6 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]5. 

Luo M, Clouthier SG, Deol Y, Liu S, Nagrath S, Azizi E, Wicha MS. Celulele stem de cancer de sân: progrese actuale și implicații clinice . Metode Mol Biol . (2015) 1293 :1–49. 10.1007/978-1-4939-2519-3_1 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]6. 

Brooks MD, Burness ML, Wicha MS. Implicații terapeutice ale eterogeneității și plasticității celulare în cancerul de sân . Cell Stem Cell (2015) 17 :260–71. 10.1016/j.stem.2015.08.014 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]7. 

Lamb R, Harrison H, Hulit J, Smith DL, Lisanti MP, Sotgia F. Mitocondria ca noi ținte terapeutice pentru eradicarea celulelor stem canceroase: proteomică cantitativă și validare funcțională prin inhibarea MCT1/2 . Oncotarget (2014) 5 :11029–37. 10.18632/oncotarget.2789 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]8. 

Peiris-Pagès M, Sotgia F, Lisanti MP. Doxiciclina și țintirea terapeutică a răspunsului la deteriorarea ADN-ului în celulele canceroase: medicament vechi, scop nou . Oncoscience (2015) 2 :696–9. 10.18632/oncoscience.215 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]9. 

Ozsvári B, Lamb R, Lisanti MP. Reutilizarea medicamentelor aprobate de FDA împotriva cancerului – accent pe metastaze . Aging (2016) 8 :567–8. 10.18632/aging.100941 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]10. 

Ozsvari B, Sotgia F, Lisanti MP. O nouă abordare independentă de mutație a terapiei cancerului: inhibarea RAS și MYC oncogene, prin țintirea biogenezei mitocondriale . Aging (2017) 9 :2098–116. 10.18632/aging.101304 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]11. Ozsvari B, Fiorillo M, Bonuccelli G, Cappello AR, Frattaruolo

 L, Sotgia F și alții . Oncotarget (2017) 8 :67457–72. 10.18632/oncotarget.19084 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]12. 

De Francesco EM, Bonuccelli G, Maggiolini M, Sotgia F, Lisanti MP. Vitamina C și doxiciclină: o terapie combinată letală sintetică care vizează flexibilitatea metabolică în celulele stem canceroase (CSC) . Oncotarget (2017) 8 :67269–86. 10.18632/oncotarget.18428 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]13. 

Lamb R, Ozsvari B, Lisanti CL, Tanowitz HB, Howell A, Martinez-Outschoorn UE, și colab.. Antibioticele care vizează mitocondriile eradicează eficient celulele stem canceroase, în mai multe tipuri de tumori: Tratarea cancerului ca o boală infecțioasă . Oncotarget (2015) 6 :4569–84. 10.18632/oncotarget.3174 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]14. 

Lamb R, Fiorillo M, Chadwick A, Ozsvari B, Reeves KJ, Smith DL și colab.. Doxiciclina reglează în jos ADN-PK și radiosensibilizează celulele care inițiază tumora: Implicații pentru o terapie cu radiații mai eficientă . Oncotarget (2015) 6 :14005–25. 10.18632/oncotarget.4159 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]15. 

Han JJ, Kim TM, Jeon YK, Kim MK, Khwarg SI, Kim CW și colab.. Rezultatele pe termen lung ale tratamentului de primă linie cu doxiciclină la pacienții cu limfom cu celule B din zona marginală anexală oculară netratată anterior . Ann Hematol . (2015) 94 :575–81. 10.1007/s00277-014-2240-8 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]16. 

Ferreri AJ, Govi ​​S, Pasini E, Mappa S, Bertoni F, Zaja F, et al.. Chlamydophila psittaci eradication with doxicycline as first-line targeted therapy for ocular annexae lymphoma: final results of an international phase II trial . J Clin Oncol. (2012) 30 :2988–94. 10.1200/JCO.2011.41.4466 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]17. 

Zhang L, Xu L, Zhang F, Vlashi E. Doxiciclina inhibă fenotipul celulelor stem canceroase și tranziția de la epiteliu la mezenchimal în cancerul de sân . Cell Cycle (2017) 16 :737–45. 10.1080/15384101.2016.1241929 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]18. 

Lin CC, Lo MC, Moody RR, Stevers NO, Tinsley SL, Sun D. Doxiciclina vizează celulele stem ale cancerului de sân aldehide dehidrogenază pozitive . Oncol Rep . (2018) 39 :3041–7. 10.3892/or.2018.6337 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]19. 

Fiorillo M, Lamb R, Tanowitz HB, Mutti L, Krstic-Demonacos M, Cappello AR și colab.. Repurposing atovaquone: Targeting mitocondrial complex III and OXPHOS to eradicate cancer stem cells . Oncotarget (2016) 7 :34084–99. 10.18632/oncotarget.9122 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]20. 

Fiorillo M, Lamb R, Tanowitz HB, Cappello AR, Martinez-Outschoorn UE, Sotgia F, et al.. Bedaquiline, un antibiotic aprobat de FDA, inhibă funcția mitocondrială și blochează puternic expansiunea proliferativă a celulelor canceroase asemănătoare stem ( CSC-uri) . Aging (2016) 8 :1593–607. 10.18632/aging.100983 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]21. 

Fiorillo M, Peiris-Pagès M, Sanchez-Alvarez R, Bartella L, Di Donna L, Dolce V și colab.. Produsele naturale de bergamot eradicează celulele stem canceroase (CSC) prin țintirea mevalonatului, semnalizării Rho-GDI și mitocondriale metabolismul . BBA Bioenerget. (2018) 1859 :984–96. 10.1016/j.bbabio.2018.03.018 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]22. 

Bonuccelli G, De Francesco EM, de Boer R, Tanowitz HB, Lisanti MP. Autofluorescența NADH, un nou biomarker metabolic pentru celulele stem canceroase: Identificarea vitaminei C și CAPE ca produse naturale care vizează „stemness” . Oncotarget (2017) 8 :20667–78. 10.18632/oncotarget.15400 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]23. 

De Luca A, Fiorillo M, Peiris-Pagès M, Ozsvari B, Smith DL, Sanchez-Alvarez R, et al. Biogeneza mitocondrială este necesară pentru supraviețuirea independentă de ancorare și propagarea celulelor canceroase asemănătoare stem . Oncotarget (2015) 6 :14777–95. 10.18632/oncotarget.4401 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]24. 

Ozsvari B, Sotgia F, Simmons K, Trowbridge R, Foster R, Lisanti MP. Mitocetoscine: inhibitori mitocondriali noi pentru țintirea metabolismului cetonelor în celulele stem canceroase (CSC) . Oncotarget (2017) 8 :78340–50. 10.18632/oncotarget.21259 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]25. 

Lamb R, Bonuccelli G, Ozsvári B, Peiris-Pagès M, Fiorillo M, Smith DL și colab.. Masa mitocondrială, un nou biomarker metabolic pentru celulele canceroase asemănătoare stem: înțelegerea semnalizării anabolice conduse de WNT/FGF . Oncotarget (2015) 6 :30453–71. 10.18632/oncotarget.5852 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]26. 

Farnie G, Sotgia F, Lisanti MP. Masa mitocondrială mare identifică o subpopulație de celule canceroase asemănătoare stem care sunt rezistente la chimio . Oncotarget (2015) 6 :30472–86. 10.18632/oncotarget.5401 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]27. 

Sotgia F, Lisanti MP. Transcrierile ARNm mitocondriale prezic supraviețuirea globală, recurența tumorii și progresia cancerului ovarian seros: diagnosticare însoțitoare pentru terapia cancerului . Oncotarget (2017) 8 :66925–39. 10.18632/oncotarget.19963 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]28. 

Sotgia F, Fiorillo M, Lisanti MP. Markerii mitocondriali prezic recurența, metastazele și rezistența la tamoxifen la pacienții cu cancer de sân: detectarea precoce a eșecului tratamentului cu diagnosticare însoțitoare . Oncotarget (2017) 8 :68730–45. 10.18632/oncotarget.19612 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]29. 

Duivenvoorden WC, Popović SV, Lhoták S, Seidlitz E, Hirte HW, Tozer RG, Singh G. Doxiciclina reduce sarcina tumorală într-un model de metastază osoasă a cancerului de sân uman . Cancer Res . (2002) 62 :1588–91. [ PubMed ] [ Google Scholar ]