Oncotarget. 15 sept 2017; 8(40): 68305–68316. doi: 10.18632/oncotarget.20054
PMC5620258PMID: 28978118
Valentina Belli , 1 Vincenzo Sforza , 1 Claudia Cardone , 1 Erika Martinelli , 1 Giusi Barra , 2 Nunzia Matrone , 1 Stefania Napolitano , 1 Floriana Morgillo , 1 Concetta Tuccillo , 3 Alessandro Federico , 3 Marcello Dallio , 3 Carmelina Loguercio Gerar ,
3 Antonia Loguercio , 3 Gravina , 3 Raffaele De Palma , 2 Fortunato Ciardiello ,1 și Teresa Troiani 1
Informații despre autor Note despre articol Informații privind drepturile de autor și licență Declinare a răspunderii
Abstract
Scop
Regorafenib, un inhibitor oral al multikinazei, a demonstrat beneficii de supraviețuire la pacienții cu cancer colorectal metastatic (mCRC) care au progresat după toate terapiile standard. Cu toate acestea, sunt necesare strategii noi pentru a îmbunătăți tolerabilitatea și a spori eficacitatea împotriva cancerului.
Design experimental
Am evaluat in vitro efectele regorafenib în combinație cu silibina, o componentă biologic activă extrasă din semințele de Silybum marianum, într-un panel de celule umane canceroase de colon. În plus, am tratat prospectiv o cohortă de 22 de pacienți cu mCRC refractari cu regorafenib plus silibină.
Rezultate
Tratamentul cu regorafenib a determinat o inhibare a creșterii dependentă de doză, în timp ce tratamentul cu silibină nu a avut efecte anti-proliferative între toate celulele canceroase testate. Tratamentul combinat cu regorafenib și silibină a indus efecte anti-proliferative și apoptotice sinergice prin blocarea căii intracelulare PI3K/AKT/mTOR. Mai mult, tratamentul combinat cu regorafenib și silibină a crescut producția de niveluri reactive a speciilor de oxigen în interiorul celulelor. Într-un studiu clinic explorator de dovadă a conceptului într-o cohortă de 22 de pacienți mCRC după eșecul tuturor terapiilor standard, a fost evaluată activitatea clinică a regorafenib în combinație cu silibina. La acești pacienți s-au observat o supraviețuire medie fără progresie de 10,0 luni și o supraviețuire globală mediană de 17,6 luni. Aceste rezultate sugerează că tratamentul combinat crește potențial eficacitatea clinică a regorafenib. Mai mult, datorită proprietăților sale antioxidante, silibina ar putea proteja pacienții de leziunile hepatice induse de medicamente, permițând continuarea unei terapii anticancer eficiente.
Concluzii
Prezentul studiu sugerează că silibina în combinație cu regorafenib este o strategie promițătoare pentru tratamentul pacienților colorectali metastatic.
INTRODUCERE
Noile progrese în terapiile pentru cancerul colorectal metastatic (mCRC) au condus în ultimele două decenii la o creștere a supraviețuirii globale mediane (SG) a pacienților de la 12 luni, în timpul erei chimioterapiei pe bază de 5-fluoruracil (5-FU) la aproximativ 30. luni datorită dezvoltării de noi agenți terapeutici [ 1 – 2]. În acest scenariu, regorafenib este un inhibitor oral de multikinază care vizează diferite proteine kinaze implicate în căile oncogene cheie, cum ar fi angiogeneza prin blocarea receptorului 1 al factorului de creștere endotelial vascular (VEGFR-1), 2 și 3 și tirozin kinazele, imunoglobulina și creșterea epidermică. factor (EGF) omologie domeniul 2 (TIE-2) tirozin kinaza; cum ar fi progresia tumorii prin inhibiţie KIT, RET, RAF-1 şi BRAF; și cum ar fi micromediul tumoral prin blocarea tirozin kinazelor receptorului factorului de creștere derivat de trombocite-β (PDGR-β) și receptorului factorului de creștere a fibroblastelor (FGFR) [ 3 – 4 ]]. Două studii clinice de fază III (CORRECT și CONCUR) au demonstrat la pacienții cu mCRC prea tratați în prealabil o îmbunătățire semnificativă a OS și a supraviețuirii fără progresie (PFS) cu regorafenib în comparație cu placebo [ 5-6 ] . În ciuda avantajului în supraviețuire, au fost raportate foarte puține răspunsuri obiective, cu efectul principal constând în stabilizarea bolii [ 5 – 7 ]. Pe baza acestor rezultate, regorafenib a fost aprobat de Agenția Europeană pentru Medicamente (EMA) și Administrația pentru Alimente și Medicamente (FDA) pentru tratamentul pacienților cu mCRC chimiofractari. Cu toate acestea, profilul de toxicitate, inclusiv toxicitatea hepatică, oboseala și reacțiile cutanate ale mâinilor și piciorului (HFSR), are un consum limitat de medicamente în practica clinică [ 8 ].]. Aceste preocupări au produs o nevoie urgentă de identificare a compușilor care sunt capabili să limiteze efectele secundare ale regorafenibului și, prin urmare, de a îmbunătăți tolerabilitatea regorafenibului și, în același timp, de a îmbunătăți activitatea clinică a acestuia. În acest scenariu, silibina este un compus biologic activ care este extras din semințele de ciulin de lapte ale Silybum marianum , care s-a dovedit a avea efecte antiinflamatorii și antioxidante în tratamentul bolilor hepatice, cum ar fi hepatita și ciroza [ 9 – 10 ]. Mai mult, în ultimele două decenii, silibina a demonstrat efecte anticancerigene împotriva mai multor tipuri de modele tumorale, în principal prin țintirea proliferării celulelor canceroase, metabolismului, apoptozei, inflamației sau angiogenezei [ 11 –19 ]. Silibina a fost conjugată cu vitamina E și fosfolipide pentru a îmbunătăți biodisponibilitatea, care este mai mică atunci când silibina pură este administrată pe cale orală și, prin urmare, activitatea sa antioxidantă (RealSiL). În această formulare, a fost propus ca un potențial agent pentru reducerea leziunilor hepatice induse de medicamente [ 20 – 22 ]. Pe baza acestor considerații, am efectuat un studiu in vitro pentru a evalua capacitatea silibinei în combinație cu regorafenib de a inhiba creșterea și de a induce apoptoza într-un panou de linii celulare de cancer de colon uman. În plus, am explorat potențialul rol clinic al tratamentului combinat într-o cohortă prospectivă de 22 de pacienți mCRC care au progresat după administrarea tuturor terapiilor standard disponibile.
REZULTATE
Sensibilitatea la tratamentul cu regorafenib și silibină într-un grup de linii celulare de cancer de colon uman
Pentru a evalua efectele anti-proliferative ale tratamentului cu regorafenib și silibină, ca agenți unici, am selectat zece linii celulare de cancer de colon uman (LoVo, HCT15, SW48, SW48-CR, GEO, GEO-CR, SW620, SW480, HCT116 și LIM1215). ) care au profiluri de mutație distincte în genele KRAS , NRAS, BRAF și PIK3CA . În special, celulele canceroase SW48 și LIM1215, care sunt de tip sălbatic (WT) pentru genele KRAS, BRAF, NRAS și PIK3CA , și celulele canceroase GEO, care au o mutație a codonului 12 KRAS , sunt sensibile la receptorul factorului de creștere anti-epidermic ( EGFR) anticorp monoclonal cetuximab [ 23 ]. În ciuda celulelor GEO adăpostește un KRASmutația genelor, studii anterioare din diferite laboratoare, inclusiv al nostru, au demonstrat că această linie de celule canceroase este una dintre cele mai sensibile la activitatea antitumorală in vitro și in vivo a tratamentului cu cetuximab [ 24 ]. Mai mult, am selectat două linii celulare rezistente la cetuximab, cum ar fi GEO-CR și SW48-CR, care au fost obținute anterior în laboratorul nostru [ 25 ] și cinci linii celulare rezistente primare cetuximab, cum ar fi LoVo, HCT15, SW620, SW480 și HCT116, care au o mutație activatoare în KRASgena fie în codonul 12, fie în codonul 13 din exonul 2. Toate celulele canceroase au fost expuse la doze crescânde de regorafenib (interval, 0,005–2 μM) sau silibin (interval, 10–100 μM), timp de 96 de ore, iar efectele asupra proliferării celulare au fost evaluat prin testul cu bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT). Concentraţiile de medicament necesare pentru a inhiba creşterea celulelor cu 50% (IC50 ) au fost determinate prin interpolare din curbele doză-răspuns. Așa cum se arată în figura1A–1B, a existat o sensibilitate diferențială la inhibarea creșterii celulare indusă de regorafenib. De fapt, trei linii celulare de cancer de colon (HCT116, SW620 și LoVo) au fost cele mai sensibile la tratamentul cu regorafenib, cu valori IC50 variind de la 0,5 μM (HCT116 și SW620) la 2 μM (LoVo). Silibina nu a avut efecte anti-proliferative printre liniile celulare de colon care adăpostesc mutații KRAS, NRAS, BRAF sau PIK3CA (Figura1B–1C).
Efectele tratamentului cu regorafenib sau silibină asupra proliferării celulare într-un panou de linii celulare de cancer de colon uman
( A-C ) Celulele au fost tratate cu diferite concentrații de regorafenib (interval, 0,005-2 μM) sau silibină (interval, 10-100 μM) timp de 96 de ore. Rata de proliferare a fost evaluată prin test MTT, așa cum este descris în Materiale și Metode. (B) Valoarea IC50 a fost determinată prin interpolare cu curbele doză-răspuns. Rezultatele reprezintă media a trei experimente separate, fiecare efectuată în duplicat.
Efectele regorafenib în combinație cu silibina asupra proliferării celulare într-un panou de linii celulare de cancer de colon uman
Apoi am evaluat activitatea anti-proliferativă a regorafenibului în combinație cu silibina în panoul de linii celulare de cancer de colon uman. În special, celulele canceroase au fost tratate cu două concentrații diferite de silibină, 60 și 90 μM, cu doze crescânde de regorafenib (interval, 0,005-2 μM) timp de 96 de ore. În toate liniile de celule canceroase testate, cu excepția celulelor LIM1215 sensibile la cetuximab, tratamentele combinate au determinat un efect anti-proliferativ semnificativ într-o manieră dependentă de doză în comparație cu tratamentele individuale ( Figura 1 suplimentară ). În special, în timp ce tratamentul cu regorafenib nu a avut niciun efect asupra creșterii celulelor în celulele HCT115, tratamentul combinat cu regorafenib 0,01 μM și silibină 90 μM a restabilit sensibilitatea celulelor HCT115 la regorafenib ( Figura 1 suplimentară ).). Mai mult, nu au fost observate diferențe semnificative între 60 și 90 μM de silibină.
Efectele tratamentului cu regorafenib în combinație cu silibină asupra formării coloniilor de linii celulare de colon SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
Pentru a evalua în continuare activitatea anti-cancer a tratamentului combinat, am efectuat un test de formare a coloniilor. Pentru a face acest lucru, am selectat patru linii celulare cu profil de mutație diferit pentru gena KRAS (celule SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480) și în care tratamentul a indus un efect anti-proliferativ mai puternic în comparație cu toate celulele testate. Prin urmare, celulele canceroase au fost tratate cu silibină (90 μM) și regorafenib (2 μM) ca agenți unici sau în combinație timp de 72 de ore. După 14 zile, coloniile au fost colorate cu violet cristal și numărate (Figura2A–2B). În grupul de control, celulele canceroase au format grupuri de celule mari în decurs de 48 de ore. Dimpotrivă, tratamentul combinat a redus semnificativ numărul de colonii în comparație cu martor și cu un singur agent în toate liniile de celule canceroase.
Efectul regorafenib în combinație cu silibina asupra formării coloniilor și asupra metabolismului celular în liniile de celule canceroase de colon SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
Celulele canceroase SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost tratate cu silibină (90 μM) sau regorafenib (2 μM) și combinația lor timp de 72 de ore. După 14 zile, coloniile au fost colorate cu violet cristal 0,1% și au fost numărate așa cum este descris în Materiale și Metode. ( A ) Imagini ale celulelor canceroase de colon dobândite prin microscop cu contrast de fază. ( B ) Histograma numărului de colonii numărată de pluginul imagine j. Barele de eroare indică abaterea standard. * p < 0,05 comparativ cu un singur tratament. Efectele tratamentelor au fost evaluate și în ceea ce privește generarea de stres oxidativ, așa cum este descris în Materiale și Metode. ( C ) Histograma intensității medii a fluorescenței DHE (% din control). Barele de eroare indică abaterea standard. * p< 0,05 comparativ cu controlul pozitiv. ( D ) Suprapunerea prin citometrie în flux a intensității fluorescenței dihidroetidiu (DHE) în celulele HCT15.
Efectele tratamentului cu regorafenib în combinație cu silibină asupra metabolismului celular în liniile celulare de colon SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
Am investigat efectul tratamentului combinat asupra metabolismului celular prin evaluarea producției de specii reactive de oxigen (ROS) în celulele canceroase. Stresul oxidativ apare în celule atunci când generarea de ROS copleșește apărarea antioxidantă naturală a celulei. Mai multe studii au demonstrat că mai multe medicamente anti-cancer ar putea duce la producerea de ROS și că acest efect ar putea juca un rol important în activitatea lor anticancer [ 26-27 ] . Acumularea ROS a fost evaluată prin test de dihidroetidiu (DHE) utilizând citometrie în flux în celulele SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480. Așa cum se arată în figura2C–2D, nivelurile de ROS au crescut semnificativ în urma tratamentului combinat în toate celulele; în timp ce tratamentele unice nu au avut niciun efect asupra generațiilor intracelulare de ROS. Aceste date sugerează că tratamentul combinat cu regorafenib plus silibină crește producția de ROS și acumularea de anioni superoxid.
Efectul tratamentului cu regorafenib în combinație cu silibină asupra inducerii apoptozei în celulele SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
În plus, am măsurat capacitatea regorafenib și silibină în combinație de a induce apoptoza utilizând testul Annexin V-FITC. După cum este prezentat în figuraFigura 3A,3A, în comparație cu agenții individuali, tratamentul combinat a indus semnificativ mai multă apoptoză timpurie și târzie în 24 de ore de la tratament în toate celulele de colon. În special, celulele SW48 au prezentat o rată apoptotică de 22% și 34%, cu tratament cu regorafenib sau silibină, respectiv; în timp ce tratamentul combinat a indus o rată apoptotică de 62%. Pentru a extinde și mai mult aceste rezultate, starea de activare a diferiților factori pro-apoptotici a fost examinată prin western blot. Tratamentul combinat cu regorafenib și silibină a indus în mod substanțial scindarea fragmentului PARP în toate liniile celulare (Figura(Figura 3B).3B). Mai mult, am observat o creștere puternică a nivelurilor de expresie a caspazei 3 și pro-caspazei 9 în celulele SW48, SW48-CR și HCT15, sugerând o activare probabilă a mecanismelor apoptotice extrinseci care implică calea independentă de caspază 9 și dependentă de caspază 3 în aceste celule. linii [ 28 ]. În schimb, nivelurile de expresie ale ambelor caspaze au fost aproximativ aceleași în celulele SW480 și acest efect ar putea fi explicat prin activarea mecanismelor independente de caspază 9 și caspază 3. Sunt necesare experimente suplimentare pentru a clarifica mecanismele implicate în procesul de apoptoză după tratamentul cu regorafenib și silibină.
Efectele regorafenib în combinație cu silibină asupra inducerii apoptozei în celulele canceroase de colon SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
( A ) Apoptoza a fost evaluată cu colorarea cu Annexin-V-FITC și teste de detecție cu 7-Amino-Actinomicină D (7-AAD) folosind citometrie în flux în celulele canceroase SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 după 24 de ore de incubare cu silibină ( 90 μM) sau regorafenib (2 μM) și combinația acestora. Histograma datelor exprimată ca procent de celule apoptotice.* p < 0,05 comparativ cu un singur tratament. ( B ) Celulele canceroase de colon au fost tratate cu silibină (90 μM) sau regorafenib (2 μM) și combinația lor timp de 24 de ore. Expresia PARP, caspaza 3 și 9 au fost evaluate prin imunoblot așa cum este descris în Materiale și Metode. α-Tubulina a fost folosită ca control al încărcării.
Efectele tratamentului cu regorafenib în combinație cu silibină asupra căii intracelulare PI3K/AKT/mTOR în celulele SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
Pentru a examina mecanismele prin care tratamentul combinat inhibă proliferarea celulelor canceroase, a fost evaluată activarea căii PI3K/AKT/mTOR. Celulele SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost tratate cu silibină (90 mM) sau regorafenib (2 mM) sau cu combinația lor timp de 24 de ore. Activarea semnalizării PI3K/AKT/mTOR a fost analizată prin analiză Western blot. Așa cum se arată în figuraFigura 4,4, tratamentul combinat a indus o inhibare semnificativă a expresiei formei totale a proteinei AKT în comparație cu tratamentul unic. Interesant este că combinația de regorafenib plus silibină a inhibat substanțial fosforilarea AKT (pAKT) în toate celulele canceroase. În plus, am studiat și expresia kinazei S6 ribozomale (p70-S6K) și proteinei 4EB-P1 (p4EB-P1), doi efectori majori ai semnalizării PI3K/AKT/mTOR. Am observat o inhibare mai mare a p70-S6K și p4EB-P1 după tratamentul combinat în comparație cu regorafenib sau silibina în monoterapie. Acest efect a fost mai evident în celulele SW48, HCT15 și SW480 (Figura(Figura 44).
Efectele regorafenib în combinație cu silibină asupra semnalizării intracelulare PI3K/AKT/mTOR în liniile celulare de cancer de colon SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480
Celulele canceroase SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost tratate cu silibină sau regorafenib și combinația lor la dozele indicate timp de 24 de ore. Extractele totale de proteine celulare au fost supuse imunoblotării cu anticorpii indicați așa cum este descris în Materiale și Metode. α-Tubulina a fost folosită ca control al încărcării.
Activitatea clinică și tolerabilitatea regorafenibului în combinație cu silibina la pacienții cu cancer colorectal metastatic
Pentru a evalua dacă silibina ar putea crește eficacitatea clinică și profilul de toxicitate al regorafenib, a fost efectuat un studiu clinic pilot cu un singur braț. Din noiembrie 2013 până în martie 2017, douăzeci și doi de pacienți cu mCRC după eșecul tuturor tratamentelor disponibile, inclusiv medicamentele anti-angiogenice și anticorpii monoclonali anti-EGFR (în boala de tip sălbatic RAS) au fost tratați cu regorafenib. Complexul silibină-vitamina E-fosfolipide (188 mg silibină, 388 mg fosfatidilcolină și 60 mg vitamina E/zi) a fost adăugat la tratamentul cu regorafenib la apariția toxicității hepatice. Datele demografice de bază, caracteristicile clinice și patologice sunt enumerate în Tabelul suplimentar 1. În acest sens, 17 din 22 de pacienți (77%) au avut antecedente de boală metastatică mai lungă de 18 luni, iar la 17 pacienți (77%) numărul de situsuri metastatice a fost ≥ 2. Unsprezece din 22 de pacienți (50%) au primit ≥ 3 terapii pentru tratamentul bolii metastatice înainte de regorafenib. Starea de performanță (PS) conform scalei ECOG a fost 0 la 14 pacienți (64%) ( Tabelul suplimentar 1 ). La acești pacienți, o PFS mediană de 10,0 luni (lună) (IC95%: 4,7–15,1) [IC 95%: 4,7–15,1 luni] și un OS median de 17,6 luni [IC 95%; 6,2–28,9 mo] au fost observate, respectiv (Figura(Figura 5).5). Patru din 22 de pacienți (18%) au început silibină concomitent cu prima doză de regorafenib. Doi dintre acești pacienți au început cu o reducere a dozei de regorafenib (120 mg) din cauza insuficienței hepatice inițiale (creșterea bilirubinei G2 și creșterea G1 a nivelurilor sanguine de AST și ALT) și nu a necesitat nicio reducere suplimentară a dozei de regorafenib în timpul tratamentului. Ceilalți doi pacienți au început cu o doză de 80 mg de regorafenib (două reduceri ale nivelului de doză) din cauza PS 2 concomitentă, conform scalei ECOG, hiperbilirubinemie G2 și hipertransaminazemie G1 ( Tabelul suplimentar 2).). Trei dintre acești 4 pacienți urmează, începând cu 16 mai 2016, tratamentul combinat cu regorafenib și silibină. Optsprezece din 22 de pacienți (82%) au început tratamentul cu silibină la apariția toxicității hepatice, în principal în timpul celei de-a doua săptămâni de tratament și aceasta a fost continuată până la progresia bolii (Figurile).(Figurile 66șiși 7).7). Optsprezece din 22 de pacienți (82%) au necesitat o reducere a dozei de regorafenib în timpul tratamentului. În special, șaisprezece pacienți (72%) au necesitat o reducere a dozei de regorafenib în timpul primelor trei cicluri, în principal pentru hiperbilirubinemie și/sau hipertransaminasemie (85%) sau pentru reacțiile cutanate ale mâinilor și piciorului (HFSR) (15%), în timp ce în 2 pacienți (9%) doza a fost redusă după al treilea ciclu de tratament pentru HSFR și oboseală. Șase pacienți din 22 (27%) au avut nevoie de o reducere a dozei de regorafenib (120 mg), în timp ce 12 pacienți (55%) au necesitat reducerea cu 2 doze (80 mg) ( Tabelul suplimentar 2 ).). Când au fost evaluate valorile mediane ale valorilor transaminazelor și ale bilirubinei sanguine la pacienții tratați cu regorafenib, s-a observat o creștere de la valoarea inițială până la a doua săptămână a primului ciclu de tratament cu regorafenib, în timp ce s-a constatat o reducere rapidă a concentrațiilor sanguine ale transaminazelor și bilirubinei. a fost început tratamentul cu silibină (Figura(Figura 7).7). Efectul silibinei asupra restabilirii funcției hepatice a fost semnificativ atât pentru normalizarea nivelurilor de AST și ALT ( p < 0,0001), cât și pentru reducerea nivelurilor de bilirubină ( p = 0,035). Nu au fost observate toxicități neașteptate la tratamentul combinat cu regorafenib și silibină. Motivul întreruperii tratamentului cu regorafenib a fost progresia radiologică a bolii la 14 din 22 de pacienți (64%), în timp ce opt pacienți (36%) sunt încă în tratament. Nu am observat nicio întrerupere a tratamentului din cauza evenimentelor adverse.
Analiza Kaplan-Meier a supraviețuirii fără progresie (PFS) și a supraviețuirii generale (OS) în populația totală
Supraviețuirea fără progresie (PFS) în populația generală
Pacienți 1-2-5-6-11-12-15-21: tratamentul era în curs de desfășurare la momentul limitării datelor; Pacienții 3-5-11-12 au primit tratament cu silibină din primul ciclu din cauza hipertransaminazemiei bazale.
Nivelurile plasmatice ale bilirubinei totale, AST și ALT (medie ±) în populația totală în timpul tratamentului cu regorafenib și silibină
DISCUŢIE
Dezvoltarea de terapii țintite molecular a oferit noi oportunități pentru îmbunătățirea și personalizarea tratamentului mCRC. În acest scenariu, s-a demonstrat că inhibitorul multikinazei regorafenib, în comparație cu placebo, crește semnificativ OS median în două studii mari randomizate de fază III la pacienții cu mCRC chimiofractară. Cu toate acestea, profilul de toxicitate, în special toxicitatea hepatică, precum și lipsa biomarkerilor predictivi de răspuns, limitează utilizarea acestuia în practica clinică.
Mai multe studii experimentale au furnizat dovezi pentru efectele antiinflamatorii și antioxidante ale silibinei, un constituent activ al semințelor de ciulin de lapte ale Silybum marianum , pentru tratamentul potențial al bolilor hepatice, inclusiv protecția daunelor funcției hepatice prin medicamente, cum ar fi citotoxice. agenți anti-cancer [ 9 – 10 ]. Mai mult, s-a sugerat o activitate directă de inhibare a creșterii celulelor silibinei pe mai multe tipuri de tumori, inclusiv cancerul de prostată, piele, vezică urinară și pulmonar [ 11-15 ] .]. În studiul de față, am evaluat rolul potențial al combinației de regorafenib și silibină ca strategie nouă pentru tratamentul pacienților cu mCRC. Aici oferim dovezi pentru un efect anti-proliferativ sinergic al tratamentului combinat într-un grup de linii celulare de cancer de colon uman. De fapt, tratamentul cu regorafenib plus silibină a indus o inhibare mai puternică a proliferării celulare în comparație cu regorafenib și silibina în monoterapie. În plus, am demonstrat o creștere a producției de ROS și a ratei apoptotice după tratamentul combinat în mai multe modele de cancer de colon.
Din perspectivă terapeutică, am efectuat un studiu clinic exploratoriu de dovadă a conceptului, în care am evaluat activitatea clinică a regorafenib plus silibină într-o cohortă consecutivă de 22 de pacienți cu CRC m, care au fost eligibili pentru tratamentul cu regorafenib după eșecul tuturor anti- standard disponibile. terapii pentru cancer. O PFS mediană de 10,0 luni [IC 95%: 4,7–15,1 luni] și un OS median de 17,6 luni [IC 95%; 6,2–28,9 mo] au fost observate la acești pacienți. Deși aceste rezultate derivă dintr-o dimensiune mică, un singur braț, o dovadă a conceptului, un studiu clinic prospectiv și deși trebuie să fie confirmate și validate în studii adecvate mai mari și randomizate, ele sugerează că adăugarea de silibină la tratamentul cu regorafenib la pacienții cu mCRC care au eșuat toate tratamentele anti-cancer disponibile ar putea crește eficacitatea antitumorală a regorafenibului. În plus, o altă implicație clinică potențial relevantă a acestui studiu este dovada că adăugarea de silibină la tratamentul cu regorafenib la apariția toxicității hepatice induse de regorafenib a fost asociată cu o scădere semnificativă statistic a nivelului seric de AST, ALT și bilirubină. Prin urmare, silibina ar putea proteja pacientul de leziunile hepatice induse de regorafenib și, prin urmare, ar putea permite continuarea unei terapii anti-cancer potențial eficace.
MATERIALE ȘI METODE
Droguri
Silybin a fost furnizat de Indena (Milano, Italia). Regorafenib a fost oferit cu amabilitate de Bayer Pharma (Berlin, Germania). Pentru studiile in vitro , silibina și regorafenib au fost dizolvate în dimetil sulfoxid steril (DMSO) și soluția stoc (10 mmol/L) a fost depozitată în părți alicote la -20°C. Soluția de lucru a fost diluată în mediu de cultură chiar înainte de fiecare experiment.
Linii telefonice
Celula umană de cancer de colon SW48 ( profil de tip sălbatic KRAS, NRAS, BRAF și PIK3CA ) a fost obținută de la IRCCS „Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino-IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova” Italia. Linia celulară de cancer de colon uman GEO ( mutația KRAS (G12A); NRAS, BRAF și PIK3CA WT a fost oferită cu amabilitate de Dr. N. Normanno (Institutul Național al Cancerului, Napoli, Italia). Celulele de colon umane LIM1215 ( KRAS, NRAS, BRAF și PIK3CA WT) a fost obținută de la Dr.ssa Di Nicolantonio de la Institutul Național al Cancerului Candiolo (Candiolo, Italia) Liniile de celule umane HCT15, HCT116, SW480, LoVo și SW620 de cancer de colon, având profiluri de mutații diferite înGenele KRAS , NRAS , BRAF și PIK3CA au fost achiziționate de la ATCC. GEO-CR și SW48-CR au fost stabilite așa cum s-a descris anterior [ 25 ]. Celulele canceroase HCT15, SW480, SW48, SW48-CR, LoVo, LIM1215 și HCT116 au fost cultivate cu mediu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS, Sigma-Aldrich), 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicină. Celulele canceroase SW620, GEO și GEO-CR au fost cultivate de rutină cu mediu McCoy (Sigma-Aldrich) suplimentat cu 10% FBS, 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicina. Celulele au fost menţinute într-o atmosferă controlată umidificată cu un raport de 95% până la 5% aer/C02 , la 37°C. Mediul a fost schimbat la fiecare 3-4 zile.
Test de viabilitate celulară
Celulele canceroase de colon au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri la o densitate de 1 × 104 celule/godeu și au fost expuse la concentrații crescânde de silibină (interval: 10-100 μM) sau regorafenib (interval: 0,005-2 μM). Pentru tratamentele combinate, celulele canceroase de colon au fost tratate cu două concentrații de silibină (60 sau 90 μM) cu doze crescânde de regorafenib (0,005 până la 2 μM). Inhibarea creșterii a fost evaluată prin testul 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromidă (MTT, Sigma-Aldrich) după 96 de ore de incubare. S-au obţinut concentraţiile care inhibă 50% din creşterea celulară (IC50 ) şi aceste valori au fost utilizate pentru experimentele ulterioare. Rezultatele reprezintă mediana a trei experimente separate, fiecare efectuată în duplicat.
Test de formare a coloniilor
Testul de formare a coloniilor a fost efectuat pentru a evalua potențialul proliferativ pe termen lung al celulelor SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 în urma tratamentelor cu silibină și regorafenib. Celulele canceroase au fost însămânțate în vase de cultură celulară de 100 mm 3 la o densitate de 3 × 10 3 și incubate cu silibină (90 μM) sau regorafenib (2 μM) și combinația lor timp de 72 de ore. Mediul a fost înlocuit cu mediu de cultură proaspăt la fiecare 3 zile. După 14 zile, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4% la temperatura camerei (RT) timp de 15 minute, colorate cu violet cristal 0,1% și numărate folosind imaginea j plugin [ 29 ]. Rezultatele reprezintă mediana a două experimente separate.
Detectarea speciilor reactive de oxigen (ROS).
Evaluarea acumulării ROS a fost detectată utilizând testul dihidroetidiu (DHE) prin citometrie în flux (BD Accuri™ C6 Plus) [ 30 ]. Odată oxidat în celule, DHE a fost transformat în etidio (HE) și emite la 605 nm. Pe scurt, celulele canceroase SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri (1 × 105 celule /godeu) și tratate cu silibină (90 μM) sau regorafenib (2 μM) și combinația lor timp de 24 de ore . Celulele canceroase au fost, de asemenea, tratate cu 250 μM de H2O2ca control pozitiv al citotoxicităţii. Ca control negativ, am aplicat același test pe celule netratate. La sfârșitul fiecărui tratament, toate celulele canceroase au fost incubate cu soluții stoc DHE 20 ng/mL (2,5 mg/mL) timp de 1 oră. În momentul procesării, celulele au fost recoltate, spălate de două ori cu PBS 1X și peletul a fost suspendat în 500 μl de PBS 1X. Acumularea de colorant a fost măsurată folosind un citometru de flux BD Accuri™ C6 (BD Bioscences) și analizată cu software-ul BD Accuri™ C6. Pentru fiecare probă, au fost obținute 1 × 104 evenimente . Rezultatele reprezintă mediana a trei experimente separate, fiecare efectuată în duplicat.
Testul de apoptoză
Moartea celulelor apoptotice a fost analizată utilizând testele de detecție Annexin-V-FITC și 7-Amino-Actinomicin D (7-AAD) (Invitrogen). Pe scurt, SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri la densitatea de 2 × 105 celule /godeu cu aceleași concentrații utilizate pentru evaluarea ROS. După 24 de ore de tratament, celulele au fost recoltate, centrifugate timp de 5 minute la 1200 RPM și peletele au fost suspendate în 100 μL 1X soluție tampon de anexină. Apoi, 5 μL de anexină V-FITC și 10 μl de 7-AAD (100 μg/ml) au fost adăugate la suspensia celulară la temperatura camerei timp de 15 minute. Detectarea celulelor viabile, a celulelor de apoptoză timpurie și târzie și a celulelor necrotice a fost efectuată cu citometrul de flux BD Accuri™ C6 (BD Bioscences) urmând protocolul producătorului. Pentru fiecare probă, 1 × 10 4evenimentele au fost dobândite. Rezultatele reprezintă mediana a trei experimente separate, fiecare efectuată în duplicat.
Imunoblotting
Celulele canceroase SW48, SW48-CR, HCT15 și SW480 au fost însămânțate în 100 mm 3vase Petri și tratate timp de 24 de ore cu silibină sau regorafenib și combinația acestora, așa cum s-a indicat anterior. Celulele au fost lizate cu tampon de liză RIPA (Sigma-Aldrich, MO, SUA) cu cocktail de inhibitori de protează și fosfatază. Extractele de proteine au fost apoi cuantificate folosind testul Bradford (BioRad, CA, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. Cantități egale de proteine totale au fost separate prin mini gel TGX prefabricat cu gradient de 4-15% (BioRad) și transferate pe membrana de nitroceluloză (BioRad). Membrana a fost blocată cu 5% lapte la temperatura camerei timp de 1 oră și incubată cu următorii anticorpi policlonali primari Caspaza 3 (#9662), PARP (#9542), AKT (#9272), p70-S6K (#9205) și anticorpi monoclonali Caspaza 9 (#9508), p-AKT (#4060) și p4EB-P1 (#2855) achiziționate de la Cell Signaling (Beverly, MA, SUA). Anticorpul monoclonal anti-a-tubulină a fost furnizat de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). După incubarea cu anticorp secundar anti-capră la temperatura camerei timp de 1 oră, conform instrucțiunilor producătorului, membranele au fost dezvoltate utilizând un sistem de detectare cu chemiluminiscență îmbunătățită (ECL) (Invitrogen, CA, SUA). Fiecare experiment a fost făcut în dublu exemplar.
Studiu clinic: populație de pacienți
Am efectuat o singură instituție, dovada de concept exploratorie, studiu clinic cu un singur braț pentru a evalua activitatea clinică a regorafenib în combinație cu silibină la pacienții cu mCRC, după eșecul terapiilor standard, inclusiv fluoropirimidină, oxaliplatină, irinotecan, terapie anti-VEGF și anti-EGFR. medicamente dacă RASWT. Regorafenib a fost administrat în doză de 160 mg/zi în primele 3 săptămâni o dată la 28 de zile, în timp ce complexul silibină-vitamina E-fosfolipide (188 mg silibină, 388 mg fosfatidilcolină și 60 mg vitamina E/zi) a fost administrat continuu, începând cu apariția toxicității hepatice, definită ca gradul 1 (G1) nivel crescut de bilirubină din sânge și/sau niveluri crescute G1 de aspartat aminotransferaze (AST) sau alanin aminotransferaze (ALT), conform criteriilor comune de terminologie pentru evenimente adverse ale Institutului Național al Cancerului. (CTCAE), versiunea 4.03. Populația de studiu a constat dintr-o cohortă consecutivă de 22 de pacienți, mai în vârstă de 18 ani, cu adenocarcinom de colon sau rect confirmat histologic, starea de performanță (PS) a Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0-2.Tabelul suplimentar 1 . Toți pacienții și-au dat consimțământul informat înainte de a primi prima doză de regorafenib. Severitatea evenimentelor adverse (EA) a fost evaluată utilizând CTCAE, versiunea 4. Am efectuat o vizită clinică săptămânală în prima lună cu o evaluare fizică și biochimică. Răspunsul tumoral a fost evaluat la fiecare 8 săptămâni și evaluat conform criteriilor de evaluare a răspunsului în tumorile solide (RECIST 1.1). Au fost evaluate OS, PFS și siguranța.
analize statistice
Analizele statistice ale datelor in vitro au fost efectuate folosind o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA). Datele cantitative au fost raportate ca medie ± abatere standard (SD). Rezultatele au fost comparate prin analiza varianței (ANOVA), iar o valoare p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic. Metoda Kaplan-Meier a fost utilizată pentru a estima PFS median și timpul OS al populației de pacienți, valorile p au fost calculate utilizând teste log-rank la un nivel de semnificație de 5%. Testul ANOVA a fost utilizat pentru a detecta diferențele medii pe variabilele continue. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind statisticile IBM-SPSS versiunea 22.0.
MATERIALE SUPLIMENTARE FIGURA SI TABELE
Click aici pentru a vizualiza. (1,9 M, pdf)
Mulțumiri
Cercetarea în laboratorul lui Fortunato Ciardiello este susținută de un grant de investigator de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC).
Note de subsol
CONFLICTE DE INTERES
Autorii nu au conflicte de interese de dezvăluit.
REFERINȚE
1.
Van Cutsem E, Cervantes A, Adam R, Sobrero A, Van Krieken JH, Aderka D, Aranda Aguilar E, Bardelli A, Benson A, Bodoky G, Ciardiello F, D’Hoore A, Diaz-Rubio E și colab. . Ghidurile de consens ESMO pentru managementul pacienților cu cancer colorectal metastatic. Ann Oncol. 2016; 27 :1386–422. https://doi.org/10.1093/annonc/mdw235 [ PubMed ] [ Google Scholar ]2.
Sforza V, Martinelli E, Ciardiello F, Gambardella V, Napolitano S, Martini G, Della Corte C, Cardone C, Ferrara ML, Reginelli A, Liguori G, Belli G, Troiani T. Mecanisme de rezistență la creșterea anti-epidermică inhibitori ai receptorilor factorilor în cancerul colorectal metastatic. World J Gastroenterol. 2016; 22 :6345–61. https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i28.6345 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]3.
Schmieder R, Hoffmann J, Becker M, Bhargava A, Müller T, Kahmann N, Ellinghaus P, Adams R, Rosenthal A, Thierauch KH, Scholz A, Wilhelm SM, Zopf D. Regorafenib BAY 73–4506): antitumoral and activități antimetastatice în modelele preclinice de cancer colorectal. Int J Cancer. 2014; 135 :1487–96. https://doi.org/10.1002/ijc.28669 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]4.
Wilhelm SM, Dumas J, Adnane L, Lynch M, Carter CA, Schütz G, Thierauch KH, Zopf D. Regorafenib BAY 73–4506): un nou inhibitor oral al multikinazei al receptorilor tirozin kinazelor angiogenice, stromale și oncogenice cu preclinice puternice activitate antitumorală. Int J Cancer. 2011; 129 :245–55. https://doi.org/10.1002/ijc.25864 [ PubMed ] [ Google Scholar ]5.
Grothey A, Van Cutsem E, Sobrero A, Siena S, Falcone A, Ychou M, Humblet Y, Bouché O, Mineur L, Barone C, Adenis A, Tabernero J, Yoshino T și colab. Regorafenib în monoterapie pentru cancerul colorectal metastatic tratat anterior (CORRECT): un studiu internațional, multicentric, randomizat, controlat cu placebo, de fază 3. Lancet. 2013; 381 :303–12. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(12)61900-X [ PubMed ] [ Google Scholar ]6.
Li J, Qin S, Xu R, Yau TC, Ma B, Pan H, Xu J, Bai Y, Chi Y, Wang L, Yeh KH, Bi F, Cheng Y și colab. Regorafenib plus cea mai bună îngrijire de susținere versus placebo plus cea mai bună îngrijire de susținere la pacienții asiatici cu cancer colorectal metastatic tratat anterior (CONCUR): un studiu de fază 3 randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo. Lancet Oncol. 2015; 16 :619–29. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(15)70156-7 [ PubMed ] [ Google Scholar ]7.
van Cutsem E, Ciardiello F, Seitz J, Hofheinz RD, Verma U, Garcia-Carbonero R, Grothey A, Miriyala A, Kalmus J, Shapiro J, Falcone A, Zaniboni A. Results from the large, open-label phase 3b Studiu CONSIGN al regorafenib la pacienții cu cancer colorectal metastatic (mCRC) tratat anterior Ann Oncol. 2015; 26 :42–70. http://doi.org/10.1093/annonc/mdv523 [ Google Scholar ]8.
Jumătate E, Arber N. Cancerul de colon: agenți preventivi și starea actuală a chimioprevenției. Expert Opin Pharmacother. 2009; 10 :211–9. https://doi.org/10.1517/14656560802560153 [ PubMed ] [ Google Scholar ]9.
Katiyar SK. Silimarina si prevenirea cancerului de piele: efecte antiinflamatorii, antioxidante si imunomodulatoare (Review) Int J Oncol. 2005; 26 :169–76. [ PubMed ] [ Google Scholar ]10.
Ramasamy K, Agarwal R. Multitargeted therapy of cancer by silymarin. Rac Lett. 2008; 269 :352–62. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2008.03.053 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]11.
Vaid M, Singh T, Prasad R, Katiyar SK. Silimarina inhibă creșterea celulelor melanomului atât in vitro , cât și in vivo prin țintirea regulatorilor ciclului celular, biomarkerilor angiogenici și inducerea apoptozei. Mol Carcinog. 2015; 54 :1328–39. https://doi.org/10.1002/mc.22208 [ PubMed ] [ Google Scholar ]12.
Deep G, Agarwal R. Eficacitatea antimetastatică a silibininei: mecanisme moleculare și potențial terapeutic împotriva cancerului. Cancer Metastasis Rev. 2010; 29 :447–63. https://doi.org/10.1007/s10555-010-9237-0 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]13.
Davis-Searles PR, Nakanishi Y, Kim NC, Graf TN, Oberlies NH, Wani MC, Wall ME, Agarwal R, Kroll DJ. Ciulinul de lapte și cancerul de prostată: efectele diferențiale ale flavonolignanilor puri din Silybum marianum asupra punctelor finale antiproliferative în celulele carcinomului de prostată uman. Cancer Res. 2005; 65 :4448–57. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-4662 [ PubMed ] [ Google Scholar ]14.
Tyagi A, Singh RP, Ramasamy K, Raina K, Redente EF, Dwyer-Nield LD, Radcliffe RA, Malkinson AM, Agarwal R. Growth inhibition and regresion of pulmonar tumors by silibinin: modulation of angiogenesis by macrofage-associated cytokines and factor nuclear-kappaB și traductoare de semnal și activatori ai transcripției 3. Cancer Prev Res (Phila) 2009; 2 :74–83. https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-08-0095 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]15.
Chu SC, Chiou HL, Chen PN, Yang SF, Hsieh YS. Silibinina inhibă invazia celulelor canceroase pulmonare umane prin scăderea producției de activator urokinaza-plasminogen și metaloproteinaza-2 matriceală. Mol Carcinog. 2004; 40 :143–9. https://doi.org/10.1002/mc.20018 [ PubMed ] [ Google Scholar ]16.
Kim S, Kim SH, Hur SM, Lee SK, Kim WW, Kim JS, Kim JH, Choe JH, Nam SJ, Lee JE, Yang JH. Silibinina previne expresia MMP-9 indusă de TPA prin reglarea în jos a COX-2 în celulele canceroase de sân umane. J Etno Pharmacol. 2009; 126 :252–7. https://doi.org/10.1016/j.jep.2009.08.032 [ PubMed ] [ Google Scholar ]17.
Kim KW, Choi CH, Kim TH, Kwon CH, Woo JS, Kim YK. Silibinina inhibă proliferarea celulelor gliomului prin mecanism dependent de Ca2+/ROS/MAPK in vitro și creșterea tumorii gliom in vivo. Neurochem Res. 2009; 34 :1479–90. https://doi.org/10.1007/s11064-009-9935-6 [ PubMed ] [ Google Scholar ]18.
Zhou L, Liu P, Chen B, Wang Y, Wang X, Chiriva Internati M, Wachtel MS, Frezza EE. Silibinina restabilește sensibilitatea la paclitaxel la celulele de carcinom ovarian uman rezistente la paclitaxel. Anticancer Res. 2008; 28 :1119–27. [ PubMed ] [ Google Scholar ]19.
Kim S, Choi MG, Lee HS, Lee SK, Kim SH, Kim WW, Hur SM, Kim JH, Choe JH, Nam SJ, Yang JH, Kim S, Lee JE și colab. Silibinina suprimă expresia MMP-9 indusă de TNF-alfa în celulele canceroase gastrice prin inhibarea căii MAPK. Molecule. 2009; 14 :4300–11. https://doi.org/10.3390/molecules14114300 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]20.
Loguercio C, Federico A, Trappoliere M, Tuccillo C, de Sio I, Di Leva A, Niosi M, D’Auria MV, Capasso R, Del Vecchio Blanco C, Real Sud Group The effect of a silybin-vitamin e- Complex de fosfolipide asupra bolii hepatice grase nealcoolice: un studiu pilot. Dig Dis Sci. 2007; 52 :2387–95. https://doi.org/10.1007/s10620-006-9703-2 [ PubMed ] [ Google Scholar ]21.
Loguercio C, Andreone P, Brisc C, Brisc MC, Bugianesi E, Chiaramonte M, Cursaro C, Danila M, de Sio I, Floreani A, Freni MA, Grieco A, Groppo M, et al. Silibina combinată cu fosfatidilcolină și vitamina E la pacienții cu boală hepatică grasă non-alcoolică: un studiu controlat randomizat. Free Radic Biol Med. 2012; 52 :1658–65. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2012.02.008 [ PubMed ] [ Google Scholar ]22.
Federico A, Dallio M, Loguercio C. Silymarin/Silybin and Chronic Hepati Disease: A Marriage of Many Years. Molecule. 2017; 22 https://doi.org/10.3390/molecules22020191 [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]23.
Troiani T, Martinelli E, Napolitano S, Vitagliano D, Ciuffreda LP, Costantino S, Morgillo F, Capasso A, Sforza V, Nappi A, De Palma R, D’Aiuto E, Berrino L, et al. Creșterea TGF-α ca mecanism de rezistență dobândită la cetuximab inhibitor anti-EGFR prin interacțiunea EGFR-MET și activarea semnalizării MET în celulele canceroase de colon. Clin Cancer Res. 2013; 19 :6751–65. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-0423 [ PubMed ] [ Google Scholar ]24.
Napolitano S, Martini G, Rinaldi B, Martinelli E, Donniacuo M, Berrino L, Vitagliano D, Morgillo F, Barra G, De Palma R, Merolla F, Ciardiello F, Troiani T. Primary and Acquired Resistance of Colorectal Cancer to Anticorpul monoclonal anti-EGFR poate fi depășit prin tratamentul combinat al Regorafenib cu Cetuximab. Clin Cancer Res. 2015; 21 :2975–83. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-15-0020 [ PubMed ] [ Google Scholar ]25.
Troiani T, Napolitano S, Vitagliano D, Morgillo F, Capasso A, Sforza V, Nappi A, Ciardiello D, Ciardiello F, Martinelli E. Rezistența primară și dobândită a celulelor cancerului colorectal la anticorpii anti-EGFR converge pe MEK/ERK activarea căii și poate fi depășită prin inhibarea combinată MEK/EGFR. Clin Cancer Res. 2014; 20 :3775–86. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-2181 [ PubMed ] [ Google Scholar ]26.
Liou GY, Storz P. Specii reactive de oxigen în cancer. Radic liber Res. 2010; 44 :479–96. https://doi.org/10.3109/10715761003667554 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]27.
Hancock JT, Desikan R, Neill SJ. Rolul speciilor reactive de oxigen în căile de semnalizare celulară. Biochem Soc Trans. 2001; 29 :345–50. https://doi.org/10.1042/0300-5127:0290345 [ PubMed ] [ Google Scholar ]28.
Tait SW, Green DR. Mitocondriile și moartea celulară: permeabilizarea membranei exterioare și nu numai. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11 :621–32. https://doi.org/10.1038/nrm2952 [ PubMed ] [ Google Scholar ]29.
Franken NA, Rodermond HM, Stap J, Haveman J, van Bree C. Testul clonogenic al celulelor in vitro . Nat Protoc. 2006; 1 :2315–9. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.339 [ PubMed ] [ Google Scholar ]30.
Perillo E, Porto S, Falanga A, Zappavigna S, Stiuso P, Tirino V, Desiderio V, Papaccio G, Galdiero M, Giordano A, Galdiero S, Caraglia M. Lipozomi înarmați cu peptida gH625 derivată din virusul herpesului pentru a depăși rezistența la doxorubicină în liniile celulare de adenocarcinom pulmonar. Oncotarget. 2016; 7 :4077–92. https://doi.org/10.18632/oncotarget.6013 [ articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
Articolele de la
Oncotarget sunt furnizate aici prin amabilitatea
Impact Journals, LLC
TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice 
