Parvovirusul oncolitic H-1 arată siguranța și semnele activității imunogene într-un studiu de primă fază I/IIa cu glioblastom

nota autorului L terapia se face si la clinica privata Praxis für Hyperthermie Dr. Hüseyin Sahinbas Dusseldorf

Address: Reichsstraße 59, 40217 Düsseldorf, Germany

Phone: +49 211 31600422

Mol Ther. 6 dec 2017; 25(12): 2620–2634.

Publicat online 24 aug 2017. doi:  10.1016/j.ymthe.2017.08.016

PMCID: PMC5768665 PMID: 28967558

Karsten Geletneky , ^1, 15, 18 Jacek Hajda , ^2, 15 Assia L. Angelova , ^3, 16 Barbara Leuchs , ^3, 16 David Capper , ^4, 5, 19 Andreas J. Bartsch , ⁶ Jan-Oliver Neumann , ¹ Tilman Schöning , ⁷ Johannes Hüsing , ² Birgit Beelte , ² Irina Kiprianova , ³ Mandy Roscher , 

³ Rauf Bhat , ³ Andreas von Deimling , ^4, 5 Wolfgang Brück , ⁸ Alexandra Just , ³ Veronika Frehtman , ³ Stephanie Löbhard , ⁹ Elena Terletskaia ^– Ladwig , ^10, 20 ^Jeremy Fry , ¹¹ Karin Jochims , ¹² Volkert ,Daniel , ^{1 Krem 13} Volker ¹⁴ Bernard Huber , ¹⁴ Andreas Unterberg , ^1, 17 și Jean Rommelaere ^3,

^17, *

Informații despre autor Note despre articol Informații privind drepturile de autor și licență Declinare a răspunderii

Abstract

Viroterapia oncolitică poate fi un mijloc de îmbunătățire a prognosticului sumbru al tumorilor cerebrale maligne. Parvovirusul H-1 de șobolan (H-1PV) suprimă tumorile în modelele preclinice de gliom, atât prin oncoliză directă, cât și prin stimularea răspunsurilor imune anticancer. Aceasta a stat la baza ParvOryx01, primul studiu clinic de fază I/IIa a unui parvovirus oncolitic la pacienții cu glioblastom recurent. H-1PV (doză crescătoare) a fost administrată prin injecție intratumorală sau intravenoasă. Tumorile au fost rezecate la 9 zile după tratament, iar virusul a fost readministrat în jurul cavităţii de rezecţie. Obiectivele principale au fost siguranța și tolerabilitatea, distribuția virusului și doza maximă tolerată (MTD). Au fost investigate, de asemenea, supraviețuirea fără progresie și globală și nivelurile markerilor virali și imunologici din tumoră și din sângele periferic. Tratamentul cu H-1PV a fost sigur și bine tolerat și nu a fost atins niciun MTD. Virusul ar putea traversa bariera hematoencefalică/tumorală și s-ar putea răspândi pe scară largă prin tumoră. A arătat o farmacocinetică favorabilă, a indus formarea de anticorpi într-o manieră dependentă de doză și a declanșat răspunsuri specifice celulelor T. Markeri de replicare a virusului, activarea microglia/macrofagului și infiltrarea celulelor T citotoxice au fost detectați în tumorile infectate, sugerând că H-1PV poate declanșa un stimul imunogen. Supraviețuirea mediană a fost extinsă în comparație cu meta-analizele recente. În total, rezultatele ParvOryx01 oferă un impuls pentru dezvoltarea clinică ulterioară a H-1PV. și a declanșat răspunsuri specifice celulelor T. 

Introducere

Glioblastomul este cea mai agresivă tumoare primară a creierului uman. În prezent, supraviețuirea mediană este în intervalul de numai 13-15 luni la primul diagnostic la 1 și 6-9 luni la recidivă. 2 Tratamentele îmbunătățite sunt așadar necesare urgent.

O abordare nouă, viroterapia oncolitică, exploatează capacitatea de replicare a virusurilor oncolitice (OV) de a ucide selectiv celulele tumorale, 3 așa cum s-a demonstrat atât în ​​medii preclinice, cât și în diferite studii clinice. 4 Dovezile tot mai mari arată că infecția cu OV poate induce, de asemenea, efecte imune antitumorale specifice, atât prin producerea sau eliberarea (la liza celulară) de neo-antigene, cât și printr-un proces imunogen declanșat de virus care provoacă moartea celulelor tumorale. 5 Inoculul viral poate acționa astfel ca un vaccin oncolitic, iar conceptele pentru combinarea infecției cu OV cu imunoterapiile actuale, cum ar fi inhibarea punctului de control, sunt în curs de investigare. 6

Testele inițiale de viroterapie oncolitică în glioblastom au fost efectuate cu virusul herpes simplex, 7 , 8 , 9 , 10 adenovirus, 11 sau reovirus 12 , 13 injectat fie direct în tumoră, fie în creierul adiacent. Ei au demonstrat siguranța acestei abordări, dar nici o eficacitate clinică. Recent, un al doilea val de studii a fost finalizat (dar nu a fost raportat încă). Un studiu de fază I extins, folosind un retrovirus replicat care adăpostește o enzimă de conversie a promedicamentului, a dat rezultate promițătoare. 14

Aici, raportăm despre prima utilizare a parvovirusului H-1 oncolitic (H-1PV), un virus ADN mic, neînvelit, monocatenar 15 a cărui gazdă naturală este șobolanul, 16 la pacienții cu glioblastom recurent. Oamenii nu sunt infectați în mod natural și, prin urmare, nu au anticorpi neutralizanți. 17 Două aplicații anterioare ale H-1PV la oameni nu au evidențiat efecte patogenice legate de virus. 18 , 19 Activitatea oncosupresivă a H-1PV a fost demonstrată în numeroase studii preclinice în glioblastom și alte modele tumorale. 20 , 21 La șobolani, H-1PV poate traversa bariera hemato-encefalică, determinând regresia tumorii intracraniene după injectarea intravenoasă. 22Celulele tumorale sunt vulnerabile la acțiunea citotoxică directă a H-1PV deoarece conțin niveluri mai mari decât celulele normale de multipli determinanți esențiali pentru reglarea proteinei oncotoxice H-1PV NS1 (factori de replicare și transcripție celulară, componente ale căilor metabolice). 23 La modelele animale, s-a descoperit că răspunsurile imune celulare potențează efectul oncosupresiv al H-1PV. 20

ParvOryx01, primul studiu clinic de creștere a dozei de H-1PV (formulare farmaceutică: ParvOryx) la pacienții cu tumori cerebrale maligne, a investigat tratamentul local și sistemic cu H-1PV la pacienții cu glioblastom. Obiectivele principale au fost de a determina siguranța și tolerabilitatea, farmacocinetica virusului, eliminarea și o doză maximă tolerată (MTD). Dovezile activității antitumorale au fost evaluate prin supraviețuirea fără progresie (PFS) și supraviețuirea globală (OS) și prin modificări histologice, imunologice și virologice în specimenele tumorale. Spre deosebire de majoritatea studiilor anterioare, proiectul ParvOryx01 24 prevedea investigarea țesutului tumoral după tratament, o condiție prealabilă pentru a obține o înțelegere aprofundată a modului de acțiune al agentului utilizat și pentru a concepe posibile îmbunătățiri.

Mergi la:

Rezultate

Pacienți și tratament

Optsprezece pacienți (vârsta medie: 57,8 ± 10,6 ani) cu antecedente de rezecție anterioară de glioblastom și radioterapie ulterioară au fost înrolați în ParvOryx01 (figura 1A;tabelul 1). Criteriile cheie de eligibilitate au fost: vârsta ≥18 ani; glioblastom solid, nemetastatic, progresiv primar sau recurent programat pentru rezecție completă sau subtotală; speranța de viață ≥3 luni; scor de performanță Karnofsky ≥60; și evitarea expunerii la indivizi imunocompromiși și sugari cu vârsta ≤18 luni timp de 28 de zile după prima doză de ParvOryx. Tratamentul cu substanțe anti-angiogene în 21 de zile, radioterapia în 90 de zile și chimioterapia în 4 săptămâni înainte de includerea în studiu nu au fost permise. Cincisprezece pacienți au primit concomitent temozolomidă (TMZ) ca terapie de primă linie, în timp ce trei au fost tratați în schimb cu bevacizumab și irinotecan. 25 MGMT (O ⁶-metilguanină-ADN metiltransferază) metilarea promotorului a fost prezentă la doi pacienți și toți au fost negativi la mutația izocitrat dehidrogenazei 1 (IDH1). Majoritatea pacienților nu au prezentat simptome sau au avut puține simptome, după cum a fost evaluat prin statutul Karnofsky. Dimensiunea tumorii, definită ca aria maximă a secțiunii transversale de îmbunătățire a contrastului pe planurile RMN axiale, a diferit substanțial între pacienți individuali, dar a fost obținută rezecția subtotală la totală la toți pacienții.

figura 1

Programul de administrare ParvOryx și diagrama de flux a procesului

(A) Organigrama procesului conform declarației CONSORT. Intervalul de timp alocat fiecărui grup și nivel de doză reprezintă perioada calendaristică de înscriere a pacienților în cohorta corespunzătoare. (B) Reprezentarea schematică a programului de administrare a ParvOryx. Panoul superior: tratament în G1 și G3. Administrarea intratumorală a fost efectuată printr-un cateter intracranian timp de aproximativ 30 de minute. Panou inferior: tratament în G2. Toate cele cinci administrări au fost administrate sub formă de perfuzii intravenoase de 2 ore. În toate grupurile în ziua 10, restul de 50% din doza totală de ParvOryx a fost injectat în pereții cavității de rezecție în mai multe locații. PFU, unități formatoare de plăci.

tabelul 1

Caracteristicile pacientului la intrarea în studiu

ID subiect	Varsta (ani)	Sex	Grup de tratament	Doza (PFU)	Terapii anterioare	Metilarea MGMT	Mutația IDH1	Aria secțiunii transversale (mm 2 )	KPS
1-01	51	masculin	G1-L1	1E6	S, RAD, TMZ	ND	neg	112	100
1-02	42	masculin	G1-L1	1E6	S, RAD, TMZ	Nu	neg	108	80
1-03	62	masculin	G1-L1	1E6	S, RAD, TMZ	Nu	neg	266	100
2-04	70	masculin	G1-L2	5E7	S, RAD, TMZ	N / A	neg	288	100
2-05	53	Femeie	G1-L2	5E7	S, RAD, TMZ	Nu	neg	3.300	100
2-06	64	masculin	G1-L2	5E7	S, RAD, TMZ	Nu	neg	2.772	80
3-07	48	Femeie	G1-L3	1E9	S, RAD, TMZ	Nu	neg	805	80
3-08	44	masculin	G1-L3	1E9	S, RAD, BEV, IRI	Nu	neg	731	100
3-09	45	masculin	G1-L3	1E9	S, RAD, BEV, IRI	Nu	neg	638	70
4-10	69	masculin	G2-L2	5E7	S, RAD, TMZ	Nu	neg	1.925	60
4-11	47	masculin	G2-L2	5E7	S, RAD, BEV, IRI	Nu	neg	629	100
4-12	64	masculin	G2-L2	5E7	S, RAD, TMZ	N / A	N / A	770	90
5-13	66	masculin	G2-L3	1E9	S, RAD, TMZ	ND	neg	1.519	90
5-14	52	masculin	G2-L3	1E9	S, RAD, TMZ	da	neg	336	90
5-15	55	Femeie	G2-L3	1E9	S, RAD, TMZ	Nu	neg	1.056	100
6-16	62	Femeie	G3-L4	5E9	S, RAD, TMZ	Nu	neg	575	90
6-17	76	masculin	G3-L4	5E9	S, RAD, TMZ	da	neg	2.184	100
6-18	71	masculin	G3-L4	5E9	S, RAD, TMZ	Nu	neg	1.881	90

Deschide într-o fereastră separată

BEV, bevacizumab; IDH1, izocitrat dehidrogenaza 1; IRI, irinotecan; KPS, starea de performanță Karnofsky; MGMT, O6 ^– metilguanin-ADN metiltransferaza; NA, nu este disponibil; ND, nedeterminabil; neg, negativ; PFU, unități formatoare de plăci; RAD, radioterapie; S, chirurgie; TMZ, temozolomidă.

Cei 18 pacienți au fost repartizați la două brațe de tratament care diferă în modul de aplicare a primului virus. În brațul 1, care cuprinde grupele 1 și 3 (G1 și G3), prima doză de ParvOryx a fost injectată intratumoral. În brațul 2, care conținea G2, pacienții au primit inițial cinci perfuzii de virus intravenos în zilele 1-5. În ziua 10, toți pacienții ambelor brațe au suferit rezecție tumorală și virusul a fost reinjectat în jurul cavității de rezecție (figura 1B).

Toleranță la tratament

Indiferent de calea de administrare, tratamentul cu ParvOryx nu a prezentat efecte secundare dependente de doză sau toxicitate limitatoare de doză (DLT). Nu a avut niciun impact asupra parametrilor de laborator de siguranță, cu excepția unei creșteri izolate, ușoare până la moderate a proteinei C reactive, fără simptome clinice, observată la 3 zile după injectarea intratumorală la toți cei trei pacienți G3-L4. Nu au fost observate modificări ale electrocardiogramei sau ale semnelor vitale. Toate evenimentele adverse intercurente (AE) cu excepția unuia au fost legate de boala de bază sau de complicațiile acesteia și nu au avut legătură cu ParvOryx. Douăsprezece reacții adverse au fost clasificate drept „grave”, adică au necesitat spitalizare sau au pus viața în pericol sau au fost relevante din punct de vedere medical ( Tabelele S1 și S2). Singurul eveniment posibil cauzat de ParvOryx a fost observat la pacientul 6-16 (G3-L4), întrunind criteriile unei reacții adverse grave neașteptate suspectate (SUSAR). Acest prim pacient din subgrupul cu cea mai mare doză a prezentat o deteriorare progresivă a nivelului de conștiență începând cu ziua 12 de tratament, la 2 zile după administrarea intracerebrală a ParvOryx. Tomografia computerizată (CT) postoperatorie a fost în concordanță cu noi semne de hidrocefalie care necesită intervenții chirurgicale. În timpul reoperației, totuși, nu a fost observată presiune intracraniană crescută. Analiza lichidului cefalorahidian (LCR) a arătat niveluri ridicate de proteine ​​și lactat, dar nu un număr crescut de celule. Nu au fost găsite particule de virus infecțios în LCR în niciun moment. Pe baza analizelor de laborator și auxiliare (electroencefalogramă, RMN), se poate exclude inflamația activă (de exemplu, encefalită, meningită), deteriorare metabolică și convulsii și nicio cauză directă legată de ParvOryx nu a putut fi stabilită. În timpul evaluării evenimentului, sponsorul a suspendat temporar și voluntar recrutarea pentru probă. Pacientul nu și-a recăpătat niciodată cunoștința și, după 6 luni, suportul de viață a fost suspendat la cererea familiei. După o discuție amănunțită a cazului cu Consiliul de monitorizare a siguranței datelor (DSMB) și autoritatea de reglementare germană (Paul-Ehrlich-Institut [PEI], Langen, Germania), evenimentul nu a fost considerat ca DLT din cauza cauzalității nedovedite, iar procesul a fost continuat conform planului. Următorii doi pacienți G3-L4 nu au prezentat efecte secundare posibil legate de ParvOryx. În timpul evaluării evenimentului, sponsorul a suspendat temporar și voluntar recrutarea pentru probă. Pacientul nu și-a recăpătat niciodată cunoștința și, după 6 luni, suportul de viață a fost suspendat la cererea familiei. După o discuție amănunțită a cazului cu Consiliul de monitorizare a siguranței datelor (DSMB) și autoritatea de reglementare germană (Paul-Ehrlich-Institut [PEI], Langen, Germania), evenimentul nu a fost considerat ca DLT din cauza cauzalității nedovedite, iar procesul a fost continuat conform planului. Următorii doi pacienți G3-L4 nu au prezentat efecte secundare posibil legate de ParvOryx. În timpul evaluării evenimentului, sponsorul a suspendat temporar și voluntar recrutarea pentru probă. Pacientul nu și-a recăpătat niciodată cunoștința și, după 6 luni, suportul de viață a fost suspendat la cererea familiei. După o discuție amănunțită a cazului cu Consiliul de monitorizare a siguranței datelor (DSMB) și autoritatea de reglementare germană (Paul-Ehrlich-Institut [PEI], Langen, Germania), evenimentul nu a fost considerat ca DLT din cauza cauzalității nedovedite, iar procesul a fost continuat conform planului. Următorii doi pacienți G3-L4 nu au prezentat efecte secundare posibil legate de ParvOryx. După o discuție amănunțită a cazului cu Consiliul de monitorizare a siguranței datelor (DSMB) și autoritatea de reglementare germană (Paul-Ehrlich-Institut [PEI], Langen, Germania), evenimentul nu a fost considerat ca DLT din cauza cauzalității nedovedite, iar procesul a fost continuat conform planului. Următorii doi pacienți G3-L4 nu au prezentat efecte secundare posibil legate de ParvOryx. După o discuție amănunțită a cazului cu Consiliul de monitorizare a siguranței datelor (DSMB) și autoritatea de reglementare germană (Paul-Ehrlich-Institut [PEI], Langen, Germania), evenimentul nu a fost considerat ca DLT din cauza cauzalității nedovedite, iar procesul a fost continuat conform planului. Următorii doi pacienți G3-L4 nu au prezentat efecte secundare posibil legate de ParvOryx.

Rezultat clinic

Informațiile despre răspunsurile clinice individuale sunt date înmasa 2şi Figura S1 . În general, în timpul urmăririi regulate a studiului (până la 6 luni după înscriere), 12 pacienți au prezentat boală progresivă sau au murit. PFS la 6 luni a fost de 27%, iar PFS mediană a fost de 111 zile. Cinci pacienți au murit în timpul urmăririi de 6 luni. OS a fost de aproximativ 72%, iar OS mediana a fost de 464 de zile. Deoarece mai puțin de 9 pacienți au murit la 6 luni, calculul OS median s-a bazat pe datele de supraviețuire pentru toți cei 18 pacienți, obținute prin vizite continue la centrul de studiu sau interviuri telefonice. PFS și OS au fost independente de doza sau calea de administrare de ParvOryx.

tabel 2

Răspunsuri clinice individuale la toți cei 18 pacienți

Grup de tratament	ID subiect	Supraviețuire fără progresie (PFS) a		Supraviețuirea generală (OS) b
		Zilele c	Documentare directă d	Zilele c	Documentare directă d
G1-L1	1-01	171	Nu	822	da
	1-02	18	da	464	da
	1-03	170	Nu	770	da
G1-L2	2-04	161	Nu	1226	da
	2-05	19	da	357	da
	2-06	15	da	151	da
G1-L3	3-07	111	da	503	da
	3-08	119	da	492	da
	3-09	53	da	337	da
G2-L2	4-10	55	Nu	97	da
	4-11	28	da	181	da
	4-12	169	Nu	220	Nu
G2-L3	5-13	17	da	543	Nu
	5-14	111	da	507	Nu
	5-15	112	da	196	Nu
G3-L4	6-16	46	Nu	184	da
	6-17	56	da	153	da
	6-18	19	da	101	da

Deschide într-o fereastră separată

^a Conform protocolului de studiu, vizitele de studiu ar putea avea loc într-un interval de 2 săptămâni înainte sau după datele respective. Prin urmare, valorile PFS individuale pot varia ușor față de cele predeterminate.

^b Ori de câte ori a fost cazul, pacienții au fost urmăriți pentru OS dincolo de perioada obișnuită de urmărire a studiului de 6 luni prin interviuri telefonice sau vizite la centrul de studiu. Prin urmare, perioada de cenzură reală pentru sistemul de operare individual poate depăși 6 luni.

^c PFS, zile după operație; OS, la zile după prima administrare de ParvOryx.

^d PFS, boală progresivă documentată prin investigații specifice studiului (scanari RM) versus comunicarea terță parte; OS, data decesului cunoscută versus cenzurarea la sfârșitul studiului.

Farmacocinetica

Concentrațiile sanguine ale genomilor virali H-1PV (Vg) și ale particulelor infecțioase au fost măsurate pentru a determina disponibilitatea virusului sistemic. După administrarea intratumorală, atât Vg, cât și particule de virus infecțios au apărut în sângele a opt dintre cei nouă pacienți din subgrupele G1-L2, G1-L3 și G3-L4, în timp ce nu au fost detectate Vg în sângele niciunui pacient G1-L1. , indicând faptul că H-1PV poate traversa bariera hematoencefalică/tumorală într-o manieră dependentă de doză și la oameni (Figura 2A, panouri superioare). După administrarea intravenoasă, concentrațiile sanguine Vg au crescut continuu în fiecare perioadă de perfuzie. În intervalul de doză investigat a fost observată o subproporționalitate de doză a expunerii sistemice, raportul dintre concentrațiile maxime fiind de aproximativ un ordin de mărime. Acest lucru face ca farmacocinetica virusului să fie previzibilă în mod fiabil. După fiecare vârf post-perfuzie, concentrațiile de Vg au scăzut rapid, cu aproximativ două ordine de mărime în 22 de ore (Figura 2A, panouri inferioare). Acest lucru s-a datorat cel mai probabil distribuției largi a virusului către organele corpului nețintă, în conformitate cu datele preclinice care arată cele mai mari concentrații în ficat și splină. 26 La toți cei șase pacienți administrați intravenos, nivelurile sanguine scăzute de Vg au fost detectabile până în ziua 10, când ParvOryx a fost reinjectat intracerebral după îndepărtarea (sub)totală a tumorii. Încrucișarea dependentă de doză a barierei hematoencefalice/tumorale a fost din nou observată la toți pacienții după injectarea multifocală în jurul cavității de rezecție (la 30-60 de locuri, în funcție de dimensiunea cavității) după rezecția tumorii.

Figura 2

Farmacocinetică și seroconversie

(A) Concentrația în timp, pe cohortă, a genomurilor virusului (Vg; simboluri de contur) și a particulelor infecțioase (PFU; simboluri solide) în sânge. Valorile sub limitele inferioare de cuantificare (LLOQ) sunt notate prin linii punctate. (B) Cursul în timp al anticorpilor antidrog (ADA) pe cohortă, așa cum a fost detectat într-un test de inhibare a hemaglutinării.

Formarea anticorpilor specifici H-1PV

S-a observat o seroconversie anti-H-1PV dependentă de doză de virus. Deși nu au fost detectați anticorpi specifici H-1PV prin testul de inhibare a hemaglutinării (HI) la niciun pacient cu G1-L1, G1-L2 și G2-L2 între zilele 1 și 30, toate G1-L3, G3-L4 și G2 – Pacienții L3 au prezentat seroconversie (Figura 2B). Dozele mai mari au condus la apariția mai timpurie a anticorpilor și la titruri de anticorpi mai mari (G3-L4 versus G1-L3). La aceeași doză totală de virus de unități formatoare de plăci (PFU) 1E9, pacienții tratați intravenos au prezentat seroconversie mai devreme și mai puternică în comparație cu pacienții tratați intratumoral (G2-L3 versus G1-L3). Într-un test de infectivitate, anticorpii au prezentat capacitate de neutralizare (datele nu sunt prezentate).

Transmiterea virusului de la pacienții studiului la terțe persoane: evaluarea riscului

Au fost testate probe de fecale, salivă și urină pentru prezența Vg și, atunci când sunt pozitive, a virusului infecțios. După cum era de așteptat din datele preclinice la rozătoare, 27Vg au fost excretate în principal prin fecale, iar concentrațiile au fost dependente de doză (maxim: 376 Vg/mg la un pacient G3-L4). La pacienții tratați intratumoral, excreția fecală de H-1PV a fost detectată numai la cea mai mare doză de virus (G3-L4), în timp ce toți pacienții tratați intravenos, cu excepția unuia, au fost testați pozitiv la doze mai mici (G2-L2 și G2-L3). Niciun pacient nu a avut Vg detectabilă în fecale după ziua 20. În urină, Vg au fost detectate numai la pacienții G2-L3, dar la concentrații scăzute (maxim: 11 Vg/μL) și nu după ziua 11. Toate probele de salivă au fost testate negative. Este important că nu au fost detectate particule virale infecțioase în nicio probă de fecale sau de urină cu un nivel Vg peste limitele inferioare de cuantificare (LLOQ) (datele nu sunt afișate). Acest lucru exclude riscul transmiterii virusului de la pacienții studiului în intervalul de doze administrate.

Expresia H-1PV în țesutul tumoral

Deoarece virusul a fost suspendat în soluție Ringer cu 48% iodixanol (un agent de contrast cu raze X), a fost posibil să se vizualizeze distribuția inițială a ParvOryx după injectarea locală prin CT efectuată în 30 de minute după operație (Figurile 3A–3D). Distribuția observată a dovedit că injecția lentă (1 ml în 30 de minute) a menținut ParvOryx în principal în țesutul tumoral și că nicio doză de virus nu a fost pierdută prin refluxul de-a lungul cateterului, o problemă comună a injecțiilor locale în creier.

Figura 3

Distribuția intratumorală a virusului și capacitatea de a traversa bariera hemato-encefalică/tumorală

(A-D) Distribuția inoculului H-1PV după injecția intratumorală (scanare CT, pacient 3-08). (A) Verificarea plasării corecte a cateterului într-o tumoră occipitală stângă prin CT intraoperator înainte de injectare. (B) Scanare CT după injectarea a 1 ml de inocul viral (cerc magenta). (C) Segmentarea tridimensională a inoculului viral. (D) Suprapunerea tumorii reconstruite (galben) cu inocul viral (magenta), arătând foarte puțin semnal de virus în afara marginilor tumorii. (E și F) Distribuția virusului după injectarea intratumorală (pacient 3-09). (E) Colorarea FISH împotriva ARN-ului H-1PV al tumorii rezecate în bloc cu urmă de cateter vizibilă (asterisc). Bară de scară, 2.000 μm. O zonă îndepărtată de calea cateterului (caseta albă) este mărită în (F) (săgeata albă). (F) Mărire mai mare (bara de scară a întregii imagini, 50 μm; bara de scară a zonei mărite, 100 μm) care arată un semnal puternic de hibridizare pentru ARN-ul H-1PV (roșu) la o distanță de 7.000 μm de cateter, demonstrând astfel o distribuție largă a virusului prin tumoră după injectarea locală. (G și H) Detectarea intratumorală a transcriptelor H-1PV de către FISH după injecția intravenoasă (pacientul 4-10) indicând traversarea barierei hematoencefalice/tumorale. Semnalele de hibridizare sunt detectate atât în ​​jurul vaselor de sânge intratumorale (G), cât și în zonele tumorale îndepărtate ale vaselor de sânge (H). Bare de scară, 50 μm. Semnalele de hibridizare sunt detectate atât în ​​jurul vaselor de sânge intratumorale (G), cât și în zonele tumorale îndepărtate ale vaselor de sânge (H). Bare de scară, 50 μm. Semnalele de hibridizare sunt detectate atât în ​​jurul vaselor de sânge intratumorale (G), cât și în zonele tumorale îndepărtate ale vaselor de sânge (H). Bare de scară, 50 μm.

Prezența și distribuția H-1PV în țesutul tumoral rezecat au fost determinate prin hibridizare fluorescență in situ (FISH). ADN-ul viral a fost dezvăluit la 11 din 12 tumori ale pacienților tratați intratumoral (Tabelul 3). Acest lucru a fost confirmat de PCR cantitativ în timp real și de detectare a particulelor de virus infecțios. Virionii proveniți din trei tumori rezecate (pacienții 3-07, 3-08 și 3-09) au fost analizați pentru integritatea lor genomică. Nu au fost detectate mutații în comparație cu ADN-ul virusului de intrare (GenBank: JX505432.1 ) prin secvențierea întregului Vg. Tumorile tuturor (cu excepția a doi pacienți G1-L1) au prezentat pozitivitate ParvOryx dependentă de doză pentru transcriptele H-1PV (Figura 4A;Tabelul 3). Semnalele pozitive FISH nu au fost limitate la locul de inoculare a virusului, ci au apărut și în zonele tumorale la distanță de cateter, confirmând faptul că injecția locală cu ParvOryx poate duce la o penetrare semnificativă în țesutul tumoral (Figurile 3E și 3F). Prezența ARN-ului H-1PV a corelat cu cea a proteinei virale citotoxice NS1 (Figura 4B;Tabelul 3). Celulele NS1-pozitive au fost găsite grupate în regiuni ale țesutului tumoral solid confirmat histologic ( Figurile S2 A și S2B). Celulele care acumulează transcriptele H-1PV și NS1 au fost găsite în principal în zonele colorate pozitive pentru expresia proteinei gliale fibrilare acide (GFAP) și a receptorului factorului de creștere epidermic (EGFR), sugerând replicarea virusului în celulele tumorale (Figura 4C). Pentru a evalua posibila replicare a virusului în microglia/macrofage asociate tumorii (TAM), am efectuat colorarea CD68-FISH. Deși s-a observat o transcriere a virusului la nivel scăzut într-o fracțiune minoră TAM, niveluri ridicate de transcriere H-1PV (notat ca +++;Tabelul 3) au fost detectate exclusiv în celule non-macrofage (Figura 4D, stânga). Acest lucru este paralel cu descoperirile anterioare care au stimulat celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC) susțin doar infecția abortivă cu H-1PV. 28 După administrarea intravenoasă de ParvOryx, ARN-ul H-1PV a fost dezvăluit în patru din șase tumori rezecate (Tabelul 3;Figurile 3G și 3H). ADN-ul viral a fost detectat în trei din șase tumori (Tabelul 3). Aceste observații au fost confirmate prin PCR cantitativă în timp real. Împreună cu rezultatele studiilor preclinice de distribuție a virusului la șobolani, aceste date demonstrează că H-1PV poate traversa bariera hematoencefalică/tumorală din sânge în tumoare. Spre deosebire de terapia locală, nicio NS1 nu a putut fi detectată la niciun pacient după injectarea intravenoasă cu ParvOryx (Tabelul 3).

Figura 4

Analiza in situ a tumorilor rezecate după administrarea locală de ParvOryx

(A-E) Replicarea virusului intratumoral și reacția inflamatorie a gazdei (pacient 6-17). (A și B) Transcrierile H-1PV (A) și proteinele NS1 (B) au fost detectate în țesutul tumoral injectat cu virus (stânga), dar nu și în controalele istorice (dreapta). (C) S-a efectuat o colorare dublă pentru ARN viral (stânga) (roșu) și proteina acidă fibrilară glială (verde) sau (dreapta) NS1 virală (roșu) și receptorul factorului de creștere epidermic (verde). (D) Celule tumorale acumulatoare de transcript H-1PV (roșu) colorate negativ pentru markerul macrofag CD68 (verde) (stânga). În schimb, majoritatea celulelor pozitive pentru catepsină B (CTSB) (roșu) au exprimat CD68 (verde) (dreapta). CTSB ⁺ /CD68 ⁻au fost de asemenea detectate celule (săgeată). (E) Expresia crescută a CTSB a fost observată în tumora tratată cu ParvOryx (stânga), în comparație cu controlul istoric (dreapta). (F–I) Infiltrare tumorală cu celule imune activate (pacient 6-16). (F) Două panouri superioare: tumora tratată a prezentat o infiltrație leucocitară (CD45 ^{+ ) crescută (stânga) comparativ cu controlul istoric (dreapta).} Două panouri din mijloc: infiltratele tumorale (CD45, stânga) constau predominant din limfocite T CD3 ⁺ (dreapta). Două panouri inferioare: populația de celule T a inclus atât CD8 ⁺ (stânga) cât și CD4 ⁺(dreapta) limfocite. (G-I) Mai mulți markeri ai activării celulelor imune au fost detectați și în tumora tratată cu ParvOryx: (G) granzima B (stânga) și perforină (dreapta), (H) IFN-γ (stânga) și IL-2 (dreapta). ) și (I) CD25 (stânga) și CD154 (CD40L) (dreapta). Bare de scară, 50 μm.

Tabelul 3

Răspunsuri locale și sistemice la administrarea H-1PV

Pacientul nr.		Țesut analizat
		Tumora a					Sânge periferic b
		Parametri virali			Parametrii gazdei		Răspunsuri specifice celulelor T anti-H-1PV
		ADN	ARN	NS1	CTSB	CD45	Anti-NS	Anti-VP
G1-L1	1-01	+++	−	−	+	++	−	−
	1-02	+	++	+	+++	+++	N / A	N / A
	1-03	−	−	−	+	+	−	++
G1-L2	2-04	++	++	+	+	+	+++	+
	2-05	+	++	+	N / A	N / A	N / A	N / A
	2-06	+	+++	+	+++	++	N / A	N / A
G1-L3	3-07	+(++)	+(++)	+	++	+	N / A	N / A
	3-08	+(+)	+(++)	+(+)	+++	+++	++	+++
	3-09	+(+)	+(++)	+(++)	+++	+++	−	+
G3-L4	6-16	+++	+++	++	+++	+++	−	+++
	6-17	+(+)	+(+)	+(+)	+++	+	N / A	N / A
	6-18	+(+)	+(++)	+	+(+)	+(+)	N / A	N / A
G2-L2	4-10	−	+(+)	−	+++	++	+	++
	4-11	−	−	−	+	+++	−	−
	4-12	+	+	−	N / A	N / A	+	+++
G2-L3	5-13	+	+(+)	−	+	+	+	+++
	5-14	−	+(+)	−	++	++	+	+++
	5-15	+	−	−	+	++	−	−

Deschide într-o fereastră separată

NA, neanalizat.

^a Prezența acizilor nucleici H-1PV și a proteinei NS1, expresia catepsinei B (CTSB) și infiltrarea limfocitară au fost analizate prin FISH și imunofluorescență (IF) în mai multe zone ale aceleiași tumori. Parantezele indică variații, dacă există, în intensitățile semnalului (sau numărul de celule pozitive) între diferite zone.

^b Răspunsurile specifice celulelor T anti-H-1PV au fost analizate utilizând celule mononucleare din sângele periferic ale pacienților izolați și epitopi peptidici virali sau proteine ​​virale complete ca stimuli. Pentru o descriere detaliată a criteriilor de punctare, consultați și 

Materiale și Metode .

Inducerea catepsinei B după administrarea locală de ParvOryx

Pentru a analiza în continuare interacțiunile H-1PV cu celulele glioblastomului și micromediul acestora, am examinat în țesuturile rezecate expresia catepsinei B (CTSB). În acord cu rezultatele noastre dintr-un model de gliom de șobolan, în care infecția cu H-1PV a dus la supraexprimarea CTSB, 29 toți pacienții G1-L3 și G3-L4 au prezentat inducerea CTSB (Tabelul 3;Figura 4E, stânga), spre deosebire de controalele negative istorice (Figura 4E, dreapta). Celulele care supraexprimă CTSB au fost observate în principal în zonele tumorale cu reactivitate NS1 ridicată ( Figura S2 C). Majoritatea celulelor care supraexprima CTSB au fost identificate ca microglia/macrofage (Figura 4D, dreapta). Cu toate acestea, au fost detectate și celule non-macrofage pozitive pentru CTSB (Figura 4D, panoul din dreapta, săgeată) și s-a dovedit a supraexprima EGFR (datele nu sunt afișate), ceea ce sugerează originea tumorii lor. Pentru un pacient G1-L1 (1-02), materialul a fost disponibil din rezecția tumorii primare care nu fusese expusă la ParvOryx. Analizele acestei probe de control nu au reușit să dezvăluie inducerea CTSB și a markerului de competență fagocitară microglia/macrofag Iba1, care a fost de obicei detectat după aplicarea virusului ( Figurile S3 A ​​și S3B). La pacienții injectați intravenos, expresia CTSB a fost mai mică decât la cei tratați intratumoral, deși mai mare decât la controalele istorice testate (n = 10).

Infiltrarea tumorilor cu celule imunitare activate

Au fost prezente infiltrate proeminente de celule imune la pacienții tratați cu ParvOryx (Tabelul 3;Figura 4F, stânga sus), dar nu au fost observate nici la controalele negative istorice (Figura 4F, dreapta sus) nici în materialul tumoral primar ( Figura S3 C). Leucocitele infiltrante tumorale (TIL) exprimau CD45 (Figura 4F, stânga mijloc) și markerul CD3 specific limfocitelor T (Figura 4F, dreapta mijloc). Limfocitele B nu au fost detectate, iar celulele NK au fost rare. Colorarea pentru co-receptorii CD4 și CD8 care se exclud reciproc a demonstrat că CD8 (Figura 4F, stânga jos) și într-o măsură mai mică CD4 (Figura 4Limfocitele T pozitive F, dreapta jos) au fost cele două subpopulații majore. Starea de activare a celulelor T cu infiltrare tumorală (Figurile 4G-4I) a fost evaluat de granzima B (Figura 4G, stânga) și perforină (Figura 4G, dreapta) colorare. Ambii markeri, care indică potențialul citotoxic al celulelor T, au fost detectați împreună cu citokinele imunostimulatoare interferon-γ (IFN-γ) (Figura 4H, stânga) și interleukina (IL)-2 (Figura 4H, dreapta). În consecință, a fost demonstrată și expresia CD25 (lanțul alfa al receptorului IL-2) (Figura 4Am plecat). Exprimarea moleculei co-stimulatoare CD154 (CD40L), un membru al superfamiliei proteinelor factorului de necroză tumorală cu rol major în recunoașterea celulelor prezentatoare de antigen, a fost, de asemenea, observată (Figura 4eu, corect). Analizele in situ FOXP3 au evidențiat doar câteva celule T reglatoare (Treg), împrăștiate ca celule unice în întreaga tumoră, dar nu concentrate în infiltratul imun principal ( Figura S4 ).

Răspunsuri specifice celulelor T în sângele periferic al pacienților tratați cu ParvOryx

Doisprezece pacienți au fost testați pentru inducerea răspunsurilor imune celulare specifice virusului prin măsurarea reactivității celulelor T lor la determinanții antigenici virali în testele IFN-γ ELISpot. Stimulantii utilizați au fost proteine ​​virale de lungime completă (NS1, capside goale din VP1/2) și/sau derivați peptidici prezentați anterior pe un panou de linii celulare de gliom pentru a fi prezentate de HLA-I (Tabelul S3 ) . S-a descoperit că nouă dintre cei 12 pacienți testați prezintă un răspuns antiviral semnificativ al celulelor T împotriva epitopilor NS (6 pacienți) și/sau VP (toți cei 9 pacienți) (Tabelul 3). Celulele T reactive la virus au fost detectate la pacienții din toate grupurile de tratament la toate nivelurile de doză în decurs de 2-8 săptămâni de la primul tratament cu ParvOryx și au persistat timp de câteva luni (Figura 5). Interesant este că cei patru pacienți la care transcrierile virale nu au fost detectate de FISH (pacienții 1-01, 1-03, 4-11 și 5-15) nu au reușit, de asemenea, să dezvolte un răspuns specific al celulelor T NS1 (Tabelul 3). Acest lucru argumentează pentru dependența acestui răspuns de producția de novo de NS1 de către celulele tumorale infectate, deoarece copia preexistentă legată de genom a polipeptidei NS1 prezentă pe suprafața exterioară a virionului de intrare a fost îndepărtată în timpul purificării ParvOryx prin digestia cu ADNază. secvență de atașare situată extern la care NS1 este atașat covalent. Pentru a determina în continuare specificitatea limfocitelor activate, am testat peptide virale mai scurte (9-mer) și unice. Acest lucru a condus la identificarea epitopilor distincti ai limfocitelor T citotoxice specifice virusului (CTL). Deoarece peptidele prezentate de HLA I detectate în liniile celulare de gliom uman infectate cu H-1PV includ o serie de epitopi presupusi de antigen de gliom ( Tabelul S3), am testat reactivitatea celulelor T împotriva acestor peptide de gliom la pacienții al căror tip HLA se potrivea îndeaproape cu cel al liniilor celulare de gliom. După cum este exemplificat înFigura 5A, trei din șase astfel de pacienți au prezentat un răspuns scăzut, dar semnificativ al celulelor T la antigenele de gliom.

Figura 5

Evaluarea răspunsurilor celulelor T la antigenele H-1PV și gliom prin testul IFN-γ ELISpot

(A și B) Răspunsurile imune celulare sunt prezentate pentru doi pacienți tratați cu ParvOryx prin (A) calea intratumorală și intracerebrală (pacientul 2-04) sau (B) calea intravenoasă și intracerebrală (pacientul 5-14). PBMC-urile au fost izolate în zilele indicate înainte de (ziua 0) sau după (zilele 10-120) tratament. După incubarea cu stimulenți corespunzători, au fost numărate celulele formatoare de puncte (SFC) producătoare de IFN-y. Stimulantii de testare au fost peptide virale sau gliom ( Tabelul S3) sau proteine ​​virale de lungime completă (NS1 sau capside goale formate din VP1 și VP2). Fitohemaglutinina (PHA) și citomegalovirusul, virusul Epstein-Barr și grupele de peptide ale virusului gripal (CEF) au servit ca stimuli de control pozitiv. Valorile de control negative (celule nestimulate) au variat de la 0 la 21 SFC per milion de PBMC și au fost scăzute din valorile eșantionului stimulat corespunzătoare. Sunt afișate mediile (coloanele) și SEM (barele) măsurătorilor în trei exemplare. Asteriscurile indică semnificație statistică (*p ≤ 0,05; SFC medie − 2 SEM > 2× control negativ).

Mergi la:

Discuţie

ParvOryx01 a fost primul studiu la om pentru utilizarea H-1PV la pacienții cu glioblastom recurent. În ciuda discrepanțelor din cadrul populației de studiu care erau așteptate de la criteriile de includere destul de largi în ceea ce privește sexul, vârsta, dimensiunea tumorii și tratamentele anterioare, ParvOryx a fost în general bine tolerat pe întreaga gamă de doze investigate. Astfel, obiectivul principal de siguranță și tolerabilitate a fost îndeplinit. Nu au existat semne de inflamație sistemică, activare imunitară excesivă sau toxicitate pentru organul principal. Absența mutațiilor detectabile în genomul virusurilor recuperate din tumorile rezecate a argumentat împotriva apariției unor variante adaptate de H-1PV în intervalul de timp studiat, în concordanță cu rapoartele Vg/PFU similare ale acestora față de virusul de intrare. SUSAR observat la un pacient G3-L4 a rămas un eveniment singular, și deși primele simptome au apărut la scurt timp după a doua administrare de ParvOryx, nu s-a putut stabili o legătură cauzală neechivocă între LCR patologic, diagnosticul radiologic de hidrocefalie și medicamentul de studiu. În special, propagarea intraventriculară a H-1PV și patologia legată de virus, cum ar fi encefalita activă și/sau meningita, ar putea fi excluse și, cel mai probabil, evenimentul sa datorat unui răspuns imun aberant, potențial declanșat de tendința imună individuală a pacientului în SNC. . Prin urmare, nu a fost reglementat ca DLT, iar DSMB precum și organismele de reglementare au permis continuarea procesului. Deoarece nu au mai avut loc evenimente, MTD de ParvOryx nu a fost atins. diagnosticul radiologic al hidrocefaliei și medicamentul de studiu. În special, propagarea intraventriculară a H-1PV și patologia legată de virus, cum ar fi encefalita activă și/sau meningita, ar putea fi excluse și, cel mai probabil, evenimentul sa datorat unui răspuns imun aberant, potențial declanșat de tendința imună individuală a pacientului în SNC. . Prin urmare, nu a fost reglementat ca DLT, iar DSMB precum și organismele de reglementare au permis continuarea procesului. Deoarece nu au mai avut loc evenimente, MTD de ParvOryx nu a fost atins. diagnosticul radiologic al hidrocefaliei și medicamentul de studiu. În special, propagarea intraventriculară a H-1PV și patologia legată de virus, cum ar fi encefalita activă și/sau meningita, ar putea fi excluse și, cel mai probabil, evenimentul sa datorat unui răspuns imun aberant, potențial declanșat de tendința imună individuală a pacientului în SNC. . Prin urmare, nu a fost reglementat ca DLT, iar DSMB precum și organismele de reglementare au permis continuarea procesului. Deoarece nu au mai avut loc evenimente, MTD de ParvOryx nu a fost atins. potenţial declanşat de tendinţa imună individuală a pacientului în SNC. Prin urmare, nu a fost reglementat ca DLT, iar DSMB precum și organismele de reglementare au permis continuarea procesului. Deoarece nu au mai avut loc evenimente, MTD de ParvOryx nu a fost atins. potenţial declanşat de tendinţa imună individuală a pacientului în SNC. Prin urmare, nu a fost reglementat ca DLT, iar DSMB precum și organismele de reglementare au permis continuarea procesului. Deoarece nu au mai avut loc evenimente, MTD de ParvOryx nu a fost atins.

ParvOryx01 a demonstrat pentru prima dată la oameni capacitatea H-1PV de a trece, într-o manieră dependentă de doză, de la o tumoare pe creier în fluxul sanguin și invers. Acest lucru confirmă descoperirile preclinice la șobolani, arătând disponibilitatea sistemică a virusului după injectarea intracerebrală. 22 , 27 Având în vedere că pacienții cu tumori cerebrale au o vasculatură mai scursă decât cea normală, această observație deschide noi oportunități terapeutice, în special pentru glioblastom, care se caracterizează prin migrarea precoce a celulelor tumorale intracerebrale care necesită administrare sistemică suplimentară de terapie.

Analiza noastră a distribuției H-1PV după injectarea locală demonstrează că o singură injecție lentă printr-un cateter standard a dus la o direcționare excelentă a inoculului către zona tumorii și o distribuție largă a H-1PV prin țesutul tumoral. Viitoarele studii clinice care utilizează ParvOryx pentru acest sau alte tipuri de tumori ar putea evita astfel explorarea unor metode mai complicate de administrare locală, cum ar fi livrarea îmbunătățită prin convecție.

Prezența ARN viral în celulele tumorale după perfuzia intravenoasă cu ParvOryx indică faptul că terapia sistemică este o opțiune și ar trebui să ia în considerare faptul că producția de NS1 a fost dependentă de doză și a fost detectată numai după injectarea locală la L2 sau mai sus. Observațiile favorabile terapiei sistemice includ: (1) o bună predictibilitate a farmacocineticii medicamentului, minimizarea riscului de supradozaj neintenționat și a efectelor secundare legate de expunere; (2) un volum mare de distribuție a H-1PV după injectarea intravenoasă, sugerând o diseminare largă în diferite țesuturi, 26și, prin urmare, potențiala aplicabilitate la diferite afecțiuni maligne (deși pierderea necontrolată a H-1PV la organele nețintă ar putea fi un obstacol în calea unui tratament eficient); și (3) absența riscurilor de pericol biologic pentru populația generală după administrarea ParvOryx în intervalul de doze investigat. În studiile viitoare, măsurile de precauție pentru pacienții tratați cu ParvOryx pot fi astfel reduse considerabil.

H-1PV se compară favorabil cu alte OV testate, deoarece anticorpii specifici H-1PV preexistenți sunt absenți în populația generală. În termen de 10 zile de la administrarea ParvOryx la cele mai mari doze testate, au apărut anticorpi specifici H-1PV, oferind o fereastră de cel puțin 10 zile pentru reaplicarea de rapel neinhibată. Cu toate acestea, viitoarele programe de tratament ParvOryx prelungite vor trebui să țină cont de momentul apariției anticorpilor neutralizanți, accelerând clearance-ul H-1PV din sânge.

Estimările eficacității clinice, un obiectiv secundar, trebuie luate în considerare cu prudență deoarece ParvOryx01 a inclus doar 18 pacienți destul de eterogene și a fost realizat ca un studiu de creștere a dozei cu diferite căi de administrare. În cohorta noastră de pacienți, răspunsul clinic nu a depins de doza sau modul de administrare a ParvOryx. În mod obiectiv, o PFS de 15,9 săptămâni și un OS de 464 de zile s-au comparat favorabil cu datele publicate ale meta-analizelor pacienților cu glioblastom recurent și au fost în intervalul rezultatelor pozitive raportate recent dintr-un studiu care a utilizat un retrovirus armat competent pentru replicare. 14 O posibilă confuzie este efectul intervenției chirurgicale repetate, care în mai multe studii mici, unicecentrale și o analiză multicentrică recentă 30părea să îmbunătățească rezultatul. În schimb, într-o analiză mai amplă și cuprinzătoare raportată de North American Brain Tumor Consortium în 2007, acest efect a fost minim: mediana PFS a variat de la 7,9 (fără intervenție chirurgicală) la 8,3 săptămâni (cu intervenție chirurgicală), iar OS la 6 luni a fost de 51% fără sau 56% cu îndepărtarea tumorii. 31

În timpul planificării studiului, a fost luată o decizie împotriva biopsiilor pentru a confirma diagnosticul înainte de injectarea virusului, pe baza unei analize risc-beneficiu. Histologia tumorii rezecate a confirmat glioblastomul recurent în toate cazurile, astfel încât această abordare sa dovedit corectă. Cu toate acestea, prelevarea de probe tumorale înainte de injectarea cu ParvOryx ar fi facilitat compararea și interpretarea constatărilor histologice și imunologice in situ și poate fi luată în considerare în studiile viitoare. Cu toate acestea, a fost posibil să se obțină material tumoral primar de la unul dintre pacienți. Deși ținând cont de faptul că tumora recurentă tratată cu ParvOryx a fost supusă radioterapiei și chimioterapiei înainte de expunerea la virus, acest material tumoral primar a servit ca un control pre-tratament „fără virus”, împreună cu panoul de cazuri istorice de glioblastom recurent examinate.

Examenul histopatologic al tumorilor rezecate a evidențiat prezența mai multor zone necrotice, semn distinctiv al glioblastomului. Grupuri de celule tumorale infectate care exprimă NS1 au fost găsite în apropierea unor astfel de zone, în așa-numitele palisade de țesut tumoral activ, dar dacă virusul contribuie efectiv la inducerea necrozei necesită investigații suplimentare. Tumorile de la pacienții tratați cu ParvOryx care erau pozitivi pentru NS1 și/sau ARN viral au afișat markeri ai activării locale a microgliilor/macrofagelor asociate tumorii, cum ar fi CTSB. 32 Microglia activată poate, la rândul său, să secrete factori care ucid eficient celulele gliomului în cultură, în condiții în care atât neuronii, cât și astrocitele normale prezintă o viabilitate nedeteriorată. 33În plus, producția de CTSB de către microglia activată este asociată cu gliom, dar nu cu apoptoza celulelor normale. 34 În celulele de gliom uman, infecția cu H-1PV duce la dereglarea CTSB care induce moartea celulelor. 29 În consecință, o fracțiune minoră a celulelor care supraexprimă CTSB la pacienții tratați cu ParvOryx au prezentat un fenotip EGFR-pozitiv non-macrofag, sugerând că inducerea endogenă a CTSB poate contribui, de asemenea, la uciderea celulelor tumorale.

Tumorile de la șase pacienți tratați cu ParvOryx au prezentat o infiltrație leucocitară puternică, clar diferită de martorii negativi netratați, iar în toate tumorile, cu excepția uneia, prezența infiltratelor leucocitare dense a coincis cu detectarea ADN-ului, ARN-ului și proteinei NS1 H-1PV. Populațiile de celule leucocitare predominante au fost limfocitele T CD8 ⁺ și CD4 ^{+ .} Se raportează că TIL apar în principal în glioblastoamele din clasa transcripțională mezenchimală, în timp ce depleția semnificativă a TIL a fost observată în cazurile de glioblastom clasic. 35Interesant, niciuna dintre tumorile infectate cu H-1PV puternic infiltrate nu ar putea fi atribuită subgrupului tipic de glioblastom mezenchimal, argumentând în continuare rolul tratamentului cu ParvOryx în inducerea acumulării intratumorale de TIL. Deoarece o populație proeminentă de celule Treg imunoinhibitoare este prezentă în mod obișnuit în micromediul glioblastomului, acțiunea celulelor imune efectoare care infiltrează tumorile este adesea suprimată. 36 În contrast, tumorile CD8 ⁺ T pozitive ale pacienților cu ParvOryx01 au avut foarte puține celule Treg care invadează tumorile, în conformitate cu observațiile recente conform cărora H-1PV poate inhiba activitatea de supresie a celulelor Treg in vitro. 37Un sprijin suplimentar pentru o contribuție a tratamentului cu ParvOryx la stabilirea unui mediu intratumoral imunogen vine din detectarea în tumorile tratate local a mai multor markeri de activare a celulelor imune, și anume perforina, granzima B, IFN-γ, IL-2, CD25 și CD40L. .

Rezultatele testelor IFN-y ELISpot în PBMC au evidențiat o inducere precoce a răspunsurilor CTL persistente la antigenele virale structurale și/sau nestructurale. Chiar dacă răspunsurile imune declanșate de virus ar putea interfera cu replicarea virusului, s-a raportat că reacțiile imune celulare induse de alte OV se corelează cu răspunsul la tratament prin promovarea imunității antitumorale. 38 Prin urmare, răspunsurile observate ale celulelor T specifice H-1PV apar într-o lumină favorabilă din punct de vedere clinic, în special pentru că o populație mică, dar semnificativă de CTL-uri a recunoscut, de asemenea, epitopi peptidici derivați de la antigenele de gliom cunoscute. Deși specificitatea pentru glioamele pacienților nu a putut fi testată, aspectul acestor CTL susține o imunitate celulară antitumorală provocată de H-1PV.

În concluzie, datele studiului ParvOryx01 confirmă siguranța și tolerabilitatea H-1PV. Acestea oferă dovezi ale lipsei de ectotoxicitate, capacității H-1PV de a traversa bariera hemato-encefală/tumorală și supraviețuire favorabilă (fără progresie) în comparație cu martorii istorici. În cele din urmă, acest studiu indică capacitatea H-1PV de a stabili un micromediu tumoral imunogen, făcând H-1PV un candidat interesant pentru dezvoltarea clinică ulterioară.

Mergi la:

Materiale și metode

Design de studiu

ParvOryx01 a fost un studiu deschis, necontrolat, cu trei grupuri, cu escaladare a dozei intra-grup, un singur centru, folosind o formulare farmaceutică de bună practică de fabricație (GMP) a H-1PV (ParvOryx). Designul său este raportat în Geletneky et al. 24 și descris înfigura 1. Obiectivele principale au inclus evaluarea siguranței și tolerabilității ParvOryx, determinarea MTD și investigarea viremiei și a eliminarii H-1PV. Obiectivele secundare au fost dovada de concept, PFS6 și OS6. Ori de câte ori a fost cazul, pacienții au fost urmăriți pentru OS dincolo de perioada obișnuită de urmărire a studiului de 6 luni prin interviuri telefonice sau vizite continue la centrul de studiu.

ParvOryx01 a fost înregistrat în bazele de date de studii clinice (EudraCT: 2011-000572-33 și ClinicalTrials.gov: NCT01301430 ), efectuate conform principiilor Declarației de la Helsinki și aprobate de autoritatea competentă germană PEI și Comitetul de etică al Facultății Medicale. Heidelberg. Un DSMB a revizuit în mod regulat datele privind siguranța pacienților tratați și a oferit recomandări cu privire la progresia studiului.

Inițial, a fost planificat să se trateze un număr egal de pacienți în fiecare braț de tratament. Acest plan a fost revizuit, având în vedere că pacienții care au primit ParvOryx intratumoral la al treilea nivel de doză (G1-L3, 1E9 PFU) au prezentat niveluri de expunere sistemică la H-1PV similare cu cele așteptate (pe baza experimentelor pe animale) pentru cea mai mică doză. subgrupul brațului intravenos. Prin urmare, după aprobarea unei modificări a protocolului, cei trei pacienți programați inițial pentru tratament intravenos la G2-L1 au fost repartizați la G3-L4 și au primit în schimb ParvOryx intratumoral la o doză de virus (5E9 PFU în total) de cinci ori mai mare decât G1-L3. pacienți ( Tabelul S4). Protocolul a necesitat finalizarea tratamentului intratumoral în G1 înainte de a continua cu tratamentul în G2 și G3. Măsurile de igienă au inclus obligația de a rămâne strict izolat în centrul de studiu până la prima apariție a anticorpilor specifici H-1PV sau până când nu au mai fost detectate pierderi de Vg în fecale, urină sau salivă. Personalul medical și vizitatorii au respectat măsuri suplimentare de igienă predefinite. După externarea pacientului, au fost programate patru vizite de urmărire ambulatorie (ziua 28 și lunile 2, 4 și 6) ( Tabelele S5 și S6 ).

Parametrii de siguranță și tolerabilitate investigați au fost: AE (grave), electrocardiograme cu 12 derivații, temperatura corpului, tensiunea arterială, frecvența cardiacă, chimia clinică, hematologia și coagularea. Concentrațiile de Vg în sânge, urină, salivă și fecale au fost determinate prin PCR cantitativă în timp real la screening, zilnic între zilele 1 și 18 de studiu și la fiecare vizită de urmărire. În G2, două probe suplimentare de sânge au fost prelevate în fiecare zi de administrare intravenoasă conform unui program prestabilit. LLOQ-urile au fost de 40 Vg/μL pentru sânge, 20,9 Vg/mg pentru fecale, 8,57 Vg/μL pentru urină și 9E4 Vg/tampon pentru saliva. Titrurile de anticorpi serici au fost măsurate la screening, zilnic între zilele 1 și 18 de studiu și la fiecare vizită de urmărire. Titrurile de anticorpi serici au fost determinate cu un test HI. PFS a fost evaluată după criteriile Macdonald. 39

Hibridizare in situ prin fluorescență

Testul FISH 40 , 41 a folosit sonde de hibridizare a acidului nucleic blocat (LNA) marcate cu digoxină specifică acidului nucleic viral, proiectate personalizat de Exiqon (Vedbaek, Danemarca) (Tabelul S7 ). Sonda sens recunoaște atât genomii virionului, cât și catena negativă a formelor replicative ADN virale. Sonda antisens detectează ARNm viral și catena pozitivă a formelor replicative ADN. Semnalele generate de sonda antisens, fiind în mare parte sensibile la RNază, au fost folosite ca indicatori ai sintezei transcriptului viral. Pentru analiza cantitativă a semnalelor pozitive, pachetul de procesare a imaginilor Fiji 42 ImageJ 43a fost folosit. Macro-urile personalizate au fost dezvoltate de Dr. D. Krunic (Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania), iar analiza imaginilor a fost realizată cu setări de procesare constante. Rezultatele au fost prezentate ca intensități medii ale semnalelor pozitive (în unități arbitrare [au]) pe câmp de observare al microscopului (diametrul câmpului vizual [dFOV] ​​= 1.000 μm). Fluorescența de fond a controalelor negative istorice a definit limita dintre semnalele pozitive și negative. Intensitatea semnalului în intervalele 11.500–30.000 au, 30.000–50.000 au și >50.000 au a fost notată ca +, ++ și, respectiv, +++.

Analiza cantitativă PCR în timp real a tumorilor

Acizii nucleici virali au fost extrași din țesutul tumoral încorporat în parafină (~10 mg) cu Kit-ul AllPrep ADN/ARN FFPE (QIAGEN, Hilden, Germania). Pentru asigurarea calității, s-au folosit controale cu matrice pozitivă (întărite cu ADN și ARN viral definit) și controale cu matrice negativă. Acizii nucleici extrași au fost cuantificați cu un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Darmstadt, Germania). Pentru cuantificarea ADN-ului, probele au fost amestecate cu TaKaRa Premix ExTaq Mastermix (TAKARA Bio, Kusatsu, Japonia) care conține ROX, primeri specifici secvenței și sondă NS care asigură amplificarea ADN-ului (nt 1,079–1,219). 44Pentru cuantificarea ARN, probele au fost amestecate cu TaqMan ARN-to-CT 1-Step Kit Mastermix (Life Technologies, Darmstadt, Germania) care conține transcriptază inversă, primeri specifici secvenței (primer invers: 5′-GGCGTACTTCTCGGAGTCAGA-3′, primer direct: 5′-GAGCGCAGTGGATGACATGA-3′) și sondă (5′-[6FAM]CAAAAAGTTCAATGCGCTCA[MGB]-3′) asigurând amplificarea ADNc (nt 491–2.032 regiune exon-exon). Concentrațiile de acid nucleic viral au fost exprimate ca ADN viral/μg ADN total sau ARN viral/μg ARN total.

Imunofluorescență

Anticorpul monoclonal de șoarece 3D9 specific pentru proteina H-1PV NS1 a fost furnizat de Dr. N. Salomé (DKFZ [Centrul German de Cercetare a Cancerului], Heidelberg, Germania). Au fost utilizați diverși anticorpi primari disponibili comercial pentru a detecta CTSB și markerii (activare) ale celulelor imune ( Tabelul S8)). Celulele NS1-pozitive pe câmp de observație (dFOV = 2.000 μm) au fost numărate, iar abundența lor a fost notată ca +, ++ sau +++, dacă au fost detectate 1–10, 10–50 sau ≥50 celule pozitive, respectiv . Semnalul specific CTSB a fost marcat ca +, ++ sau +++ atunci când numărul de celule pozitive CTSB pe câmp de observare al microscopului (dFOV = 1.000 μm) a fost ≤5, 5–10 sau, respectiv, ≥10. Au fost luate în considerare numai celulele care supraexprimă CTSB (intensitatea medie a semnalului peste limita determinată pe controalele negative istorice). Pentru analiza cantitativă a intensității semnalului CTSB, a fost folosit software-ul Fiji ImageJ (a se vedea mai sus) și a fost efectuată analiza automată cu macrocomenzi dezvoltate special (Dr. D. Krunic, DKFZ) și setări de procesare constante. Infiltrarea tumorii limfocitare a fost notată ca +, ++ sau +++ dacă numărul de TIL-uri pe câmp de observare al microscopului (dFOV = 1,

Imunohistochimie

Protocoale de rutină și o platformă automată de colorare cu acces aleatoriu (Ventana Medical Systems, Basel, Elveția) au fost utilizate pentru detectarea CD45, CD3, CD4, CD8, CD68 și FOXP3.

Testul IFN-y ELISpot

PBMC-urile au fost preparate din sânge integral recoltat de la pacienți înainte și la intervale de timp după administrarea ParvOryx înainte și după rezecție. Celulele T care răspund au fost cuantificate ca celule formatoare de puncte per milion de PBMC, utilizând testul imunospot legat de enzima IFN-γ (ELISpot) (ProImmune, Oxford, Marea Britanie). Stimulantii de testare au inclus proteina H-1PV NS1 purificata, 45 de capside goale din VP1/2 46 (10 μg/mL) si grupuri de peptide sintetice (5 μM) din proteinele H-1PV NS sau VP sau antigeni de gliom cunoscuti (Tabelul S3) . ). Peptidele de testare au fost identificate în prealabil cu ProPresent Antigen Presentation Assay (ProImmun) ca fiind HLA I-prezentate pe un panou de linii celulare de gliom infectate cu H-1PV (U138, U87, A172, U373 și NCH89).

Detectarea H-1PV infecțioasă

Titrurile infecțioase de parvovirus în sânge și tumoră au fost determinate prin analiza plăcii. Probele (200 μL de sânge sau 25 mg de tumoră aduse la un volum total de 500 μL cu mediu MEM fără ser fetal bovin [FBS]) au fost omogenizate prin trei cicluri de îngheț-dezgheț și sonicate la 48 W timp de 1 minut într-un Sonorex Super 10 P. omogenizator cu ultrasunete (Bandelin, Germania). Alicote (500 μl) de diluții în serie au fost inoculate pe monostraturi confluente de 60% de celule renale nou-născute (NB-324K). Culturile au fost procesate în esență așa cum este descris de Tattersall și Bratton, 47iar titrurile de virus au fost exprimate în PFU per mililitru de sânge sau miligram de tumoare. LLOQ a fost de 5 PFU/ml sânge sau 40 PFU/g tumoră. Când titrul a fost sub 3 PFU/200 μL sânge sau 3 PFU/25 mg tumoră, proba originală a fost propagată pe celule de gliom de șobolan RG-2 (trei cicluri de incubare de 5 zile) înainte de titrarea plăcii. Raportul Vg/PFU al virusurilor propagate din tumoră și din sânge a fost determinat după îndepărtarea ADN-ului neambalat prin tratamentul cu DNază și s-a dovedit a fi similar cu cel al virusului de intrare (în jur de 1E3).

Secvențierea ADN-ului H-1PV

După multiplicarea in vitro, virusurile recuperate din omogenate tumorale rezecate au fost supuse extracției ADN-ului utilizând kit-ul QIAamp MinElute Virus Spin (QIAGEN, Hamburg, Germania). Secvențierea cu acoperire de două ori a întregului genom (cu excepția acelor de păr terminale) a fost efectuată în condițiile ISO 17025 de către Eurofins Medigenomix (Ebersberg, Germania), folosind metoda de terminare a lanțului. 48

Cuantificarea Vg în fluidele corporale

ADN-ul extras cu truse comerciale (QIAGEN, Hilden, Germania sau Epicenter, Madison, WI, SUA) din sânge, salivă, urină și fecale a fost analizat prin PCR cantitativă în timp real. Testul a fost validat și efectuat de BSL Bioservice (München, Germania) într-un LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germania). Pentru calibrare, au fost utilizate două controale negative și șapte vârfuri Vg duplicate (genomi 5E1–5E7 per PCR). Primerii și sonda de detecție Vg fluorogenă au fost: primer primer (5′-GCG CGG CAG AAT TCA AAC T-3′), primer invers (5′-CCA CCT GGT TGA GCC ATC AT-3′), sonda (5′- [6FAM]ATG CA*G CCA* GA*CA*GT TA[TAMRA]-3′ [*, LNA funcționalizat]). Reacția a fost inițializată timp de 10 minute la 95°C, urmată de 45 de cicluri de 95°C timp de 15 s și 60°C timp de 60 s, și extensia finală timp de 10 minute la 40°C. Concentrațiile de Vg au fost exprimate pe microlitru (sânge, urină), tampon (salivă),

HI Test

Titrurile de anticorpi au fost măsurate prin inhibarea hemaglutinării mediate de virus. Testul HI a fost validat și efectuat de Labor Enders (Stuttgart, Germania), utilizând diluții în serie 1:2 ale serului pacientului epuizat de factori de hemaglutinare nespecifici prin incubare prealabilă cu 5% (v/v) eritrocite de pui. Probele de testat au fost suplimentate cu H-1PV (aproximativ 5E9 capside/godeu) și eritrocite de pui (0,125%). Titrurile de anticorpi au fost determinate ca fiind cea mai mare diluție a serului care determină HI completă.

Testarea anticorpilor de neutralizare

Anticorpii de neutralizare specifici virusului au fost detectați prin măsurarea capacității serului de a inhiba infecția litică a celulelor permisive NB-324K de către H-1PV. Viabilitatea celulară a fost determinată prin colorarea cu cristal violet și cuantificarea fotometrică a celulelor reziduale la 4 zile după infecție (0,1 PFU/celulă) în prezența și absența serului pacientului diluat în serie. Curbele doză-răspuns au fost calculate cu SigmaPlot și modelul 4PL. Titrul de anticorp neutralizant a fost definit ca diluția serului care provoacă inhibarea cu 50% a toxicității induse de virus.

Planificarea Statistică

Studiul a fost planificat ca un studiu de determinare a dozei cu o schemă de trei o dată, cu escaladare la următoarea doză atunci când nu a avut loc niciun eveniment limitator de doză și trecerea la reevaluarea continuă 49 după primul eveniment limitator de doză .

Analize statistice

Variabilele continue au fost tabulate pe subgrup ca medii cu SD; numărările au fost tabulate ca frecvențe absolute pe subgrup. Datele de timp până la eveniment au fost estimate pe subgrup și pe grup folosind metoda Kaplan-Meier. Au fost generate tabele de schimb pentru toate valorile de laborator per subgrup și vizită. Concentrația genomului viral a fost împrăștiată pe o scară logaritmică în timp pentru G2. Toate analizele au fost pre-specificate într-un plan de analiză statistică, care a fost finalizat înainte ca baza de date a studiului să fie închisă.

Mergi la:

Contribuții ale autorului

J. Hajda, KG, JR, J. Hüsing, KJ, OK, MD și BH au conceput acest studiu. KG, AU, J.-ON și TS au fost responsabili pentru desfășurarea procesului. KG, AU, J. Hajda, BB și AJB au obținut și/sau interpretat date clinice. DC, AvD, VD, BL, IK, ALA, MR, AJ, VF, SL, JF, WB, RB și ET-L. efectuat măsurători de laborator. BL, ALA, JR, IK, DC, KG, J. Hajda, JF, RB, OK și MD au analizat și interpretat rezultatele de laborator. J. Hüsing a fost responsabil de analiza statistică. KG, J. Hajda, ALA, BL, J. Hüsing, JR și AU au scris manuscrisul și/sau au revizuit critic conținutul său intelectual. Toți autorii au aprobat versiunea finală a manuscrisului.

Mergi la:

Conflicte de interes

Studiul clinic ParvOryx01 a fost sponsorizat de ORYX GmbH & Co. KG. Sponsorii nu au avut niciun rol în decizia de publicare sau în scrierea manuscrisului. OK, MD și BH sunt angajați ai ORYX GmbH & Co. KG. KG, ALA, BL, IK și JR sunt co-inventatori în diferite brevete/cereri de brevet referitoare la conținutul acestei lucrări.

Mergi la:

Mulțumiri

Dorim să mulțumim tuturor participanților la studiu și familiilor lor, precum și personalului medical, de asistență medicală și personalului tehnic al Departamentului de Neurochirurgie, Spitalul Universitar Heidelberg. Recunoaștem sprijinul dedicat și expert al lui Bernhard Beigel în neuronavigația intraoperatorie. Mulțumim lui Marcus Müller, Barbara Liebetrau, Silvia Münstermann, Milena Barf (DKFZ, Heidelberg, Germania) și Ludmilei Umansky (Centrul Național pentru Boli Tumorale, Heidelberg, Germania) pentru asistența tehnică excelentă și lui Damir Krunic, Manuela Brom și Felix Bestvater (DKFZ, Light Microscopy Facility) pentru asistență cu imagistica și analiza imaginilor. Îi suntem datori lui Philipp Beckhove (Centrul Național pentru Boli Tumorale, Heidelberg, Germania) pentru efectuarea analizelor de citokine. Suntem recunoscători lui Jörg Schlehofer (DKFZ, Heidelberg, Germania) și Magnus von Knebel Doeberitz (Spitalul Universitar Heidelberg) pentru contribuția lor la inițierea acestui studiu. Mulțumim lui Jürg Nüesch (DKFZ, Heidelberg, Germania) pentru furnizarea proteinei H-1PV NS1, Oliver Rossmann (Eurofins Medigenomix GmbH, Ebersberg, Germania) pentru analiza de secvențiere, Anne Régnier-Vigouroux (Universitatea Johannes Gutenberg, Mainz, Germania) pentru discuții utile și sugestii și Kathleen Broman pentru lectura critică a manuscrisului. Producția GMP a medicamentului (ParvOryx) a fost efectuată de IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Germania). Probele de glioblastom recurent încorporat în parafină pentru a fi utilizate ca controale negative istorice au fost furnizate de banca de țesuturi a Centrului Național pentru Boli Tumorale (NCT, Heidelberg, Germania) în conformitate cu reglementările băncii de țesuturi și cu aprobarea comitetului de etică al Universității Heidelberg. Procesul ParvOryx01 a fost susținut de ORYX GmbH & Co. KG.

Mergi la:

Note de subsol

Informațiile suplimentare includ patru figuri și opt tabele și pot fi găsite cu acest articol online la http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.08.016 .

Mergi la:

Informatii suplimentare

Documentul S1. Figurile S1–S4 și tabelele S1–S8:

Click aici pentru a vizualiza. ^{(28M, pdf)}

Documentul S2. Articol plus informații suplimentare:

Click aici pentru a vizualiza. ^{(30M, pdf)}

Mergi la:

Referințe

1. 

Stupp R., Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC, Ludwin SK, Allgeier A., ​​Fisher B., Belanger K., Organizația Europeană pentru Cercetarea și Tratarea Tumorilor și Radiațiilor Creierului Cancerului Grupuri de oncologie. Grupul de studii clinice de la Institutul Național al Cancerului din Canada Efectele radioterapiei cu temozolomidă concomitentă și adjuvantă comparativ cu radioterapia în monoterapie asupra supraviețuirii în glioblastom într-un studiu randomizat de fază III: analiza pe 5 ani a studiului EORTC-NCIC. Lancet Oncol. 2009; 10 :459–466. [ PubMed ] [ Google Scholar ]2. 

Clarke JL, Ennis MM, Yung WK, Chang SM, Wen PY, Cloughesy TF, Deangelis LM, Robins HI, Lieberman FS, Fine HA, North American Brain Tumor Consortium Este operația la progresie un marker de prognostic pentru îmbunătățirea progresiei la 6 luni -supraviețuire liberă sau supraviețuire globală pentru pacienții cu glioblastom recurent? Neuro-oncol. 2011; 13 :1118–1124. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]3. 

Russell SJ, Peng K.-W., Bell JC Viroterapia oncolitică. Nat. Biotehnologia. 2012; 30 :658–670. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]4. 

Miest TS, Cattaneo R. Viruși noi pentru terapia cancerului: satisfacerea nevoilor clinice. Nat. Rev. Microbiol. 2014; 12 :23–34. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]5. 

Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC Devine virală cu imunoterapie împotriva cancerului. Nat. Rev. Cancer. 2014; 14 :559–567. [ PubMed ] [ Google Scholar ]6. 

Cockle JV, Rajani K., Zaidi S., Kottke T., Thompson J., Diaz RM, Shim K., Peterson T., Parney IF, Short S. Viroimunoterapie combinată cu inhibarea punctului de control pentru tratarea gliomului, în funcție de localizare -profilarea tumorii specifice. Neuro-oncol. 2016; 18 :518–527. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]7. 

Markert JM, Razdan SN, Kuo HC, Cantor A., ​​Knoll A., Karrasch M., Nabors LB, Markiewicz M., Agee BS, Coleman JM Un studiu de fază 1 cu HSV-1 oncolitic, G207, administrat în combinație cu radiații pentru GBM recurent demonstrează siguranța și răspunsurile radiografice. Mol. Acolo. 2014; 22 :1048–1055. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]8. 

Harrow S., Papanastassiou V., Harland J., Mabbs R., Petty R., Fraser M., Hadley D., Patterson J., Brown SM, Rampling R. HSV1716 injectare în creier adiacent tumorii după intervenția chirurgicală rezecția gliomului de grad înalt: date de siguranță și supraviețuire pe termen lung. Gene Ther. 2004; 11 :1648–1658. [ PubMed ] [ Google Scholar ]9. 

Markert JM, Medlock MD, Rabkin SD, Gillespie GY, Todo T., Hunter WD, Palmer CA, Feigenbaum F., Tornatore C., Tufaro F., Martuza RL Mutantul virusului herpes simplex cu replicare condiționată, G207 pentru tratamentul gliom malign: rezultatele unui studiu de fază I. Gene Ther. 2000; 7 :867–874. [ PubMed ] [ Google Scholar ]10. 

Rampling R., Cruickshank G., Papanastassiou V., Nicoll J., Hadley D., Brennan D., Petty R., MacLean A., Harland J., McKie E. Evaluarea toxicității virusului herpes simplex competent pentru replicare (ICP 34.5 mutant nul 1716) la pacienții cu gliom malign recurent. Gene Ther. 2000; 7 :859–866. [ PubMed ] [ Google Scholar ]11. 

Chiocca EA, Abbed KM, Tatter S., Louis DN, Hochberg FH, Barker F., Kracher J., Grossman SA, Fisher JD, Carson K. Un studiu deschis de fază I, cu escaladare a dozei, multi-instituțional de injectare cu un adenovirus E1B-Atenuat, ONYX-015, în regiunea peritumorală a gliomelor maligne recurente, în cadru adjuvant. Mol. Acolo. 2004; 10 :958–966. [ PubMed ] [ Google Scholar ]12. 

Kicielinski KP, Chiocca EA, Yu JS, Gill GM, Coffey M., Markert JM Studiul clinic de fază 1 de perfuzie intratumorală cu reovirus pentru tratamentul gliomelor maligne recurente la adulți. Mol. Acolo. 2014; 22 :1056–1062. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]13. 

Forsyth P., Roldán G., George D., Wallace C., Palmer CA, Morris D., Cairncross G., Matthews MV, Markert J., Gillespie Y. Un studiu de fază I de administrare intratumorală a reovirusului la pacienți cu glioame maligne recidivante confirmate histologic. Mol. Acolo. 2008; 16 :627–632. [ PubMed ] [ Google Scholar ]14. 

Cloughesy TF, Landolfi J., Hogan DJ, Bloomfield S., Carter B., Chen CC, Elder JB, Kalkanis SN, Kesari S., Lai A. Studiul de fază 1 cu vocimagene amiretrorepvec și 5-fluorocitozină pentru hipertensiune recurentă gliom de grad. Sci. Transl. Med. 2016; 8 :341ra75. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]15. 

Cotmore SF, Tattersall P. Parvovirusuri: mic nu înseamnă simplu. Annu. Pr. Virol. 2014; 1 :517–537. [ PubMed ] [ Google Scholar ]16. 

Jacoby RO, Bhatt PN, Jonas AM Viral diseases. În: Baker HJ, Lindsey JR, Weisbroth SH, editori. Şobolanul de laborator (Vol. 1, Biologie şi boli) Academic Press; 1979. p. 271–306. [ Google Scholar ]17. 

Newman SJ, McCallin PF, Sever JL Încercările de a izola virusul H-1 din avorturile umane spontane: un raport negativ. Teratologie. 1970; 3 :279–281. [ PubMed ] [ Google Scholar ]18. 

Le Cesne A., Dupressoir T., Janin N., Spielman M., Le Chevalier T., Sancho-Garnier H., Paoletti C., Rommelaere J., Stehelin D., Tursz T. Intra-lesional administration of un virus viu, parvovirus H1 (PVH-1) la pacienții cu cancer: un studiu de fezabilitate. Proc. Ann. Întâlni. A.m. Soc. Clin. Oncol. 1993; 12 :297. [ Google Scholar ]19. 

Toolan HW, Saunders EL, Southam CM, Moore AE, Levin AG H-1 viremia virusului la om. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965; 119 :711–715. [ PubMed ] [ Google Scholar ]20. 

Geletneky K., Nüesch JP, Angelova A., Kiprianova I., Rommelaere J. Double-faceted mechanism of parvoviral oncosuppression. Curr. Opinează. Virol. 2015; 13 :17–24. [ PubMed ] [ Google Scholar ]21. 

Rommelaere J., Geletneky K., Angelova AL, Daeffler L., Dinsart C., Kiprianova I., Schlehofer JR, Raykov Z. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21 :185–195. [ PubMed ] [ Google Scholar ]22. 

Geletneky K., Kiprianova I., Ayache A., Koch R., Herrero Y Calle M., Deleu L., Sommer C., Thomas N., Rommelaere J., Schlehofer JR Regression of advanced rat and human glioams by tratament local sau sistemic cu parvovirus H-1 oncolitic la modele de șobolan. Neuro-oncol. 2010; 12 :804–814. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]23. 

Nüesch JP, Lacroix J., Marchini A., Rommelaere J. Molecular pathways: rodent parvoviruses—mechanisms of oncolysis and perspectives for clinical cancer treatment. Clin. Cancer Res. 2012; 18 :3516–3523. [ PubMed ] [ Google Scholar ]24. 

Geletneky K., Huesing J., Rommelaere J., Schlehofer JR, Leuchs B., Dahm M., Krebs O., von Knebel Doeberitz M., Huber B., Hajda J. Faza I/IIa studiului intratumoral/ administrarea intracerebrală sau intravenoasă/intracerebrală de Parvovirus H-1 (ParvOryx) la pacienții cu glioblastom multiform progresiv primar sau recurent: protocol ParvOryx01. BMC Cancer. 2012; 12:99 . [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]25. 

Herrlinger U., Schäfer N., Steinbach JP, Weyerbrock A., Hau P., Goldbrunner R., Leutgeb B., Urbach H., Stummer W., Glas M. Studiul randomizat, multicentric GLARIUS care investighează bevacizumab/irinotecan vs temozolomid standard la pacienții nou diagnosticați cu glioblastom nemetilat MGMT: rezultate finale de supraviețuire și calitatea vieții. Neuro-oncol. 2014; 16 :ii23–ii24. [ Google Scholar ]26. 

Geletneky K., Leoni AL, Pohlmeyer-Esch G., Loebhard S., Baetz A., Leuchs B., Roscher M., Hoefer C., Jochims K., Dahm M. Patologia, distribuția organelor și răspunsul imun după injectarea intravenoasă unică și repetată la șobolani cu parvovirus H1 de grad clinic. Comp. Med. 2015; 65 :23–35. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]27. 

Geletneky K., Leoni AL, Pohlmeyer-Esch G., Loebhard S., Leuchs B., Hoefer C., Jochims K., Dahm M., Huber B., Rommelaere J. Bioavailability, biodistribution, and CNS toxicity of parvovirus H1 de grad clinic după injectare intravenoasă și intracerebrală la șobolani. Comp. Med. 2015; 65 :36–45. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]28. 

Grekova S., Aprahamian M., Giese N., Schmitt S., Giese T., Falk CS, Daeffler L., Cziepluch C., Rommelaere J., Raykov Z. Celulele imune participă la activitatea oncosupresivă a parvovirusului H. -1PV și sunt activate ca urmare a infecției lor abortive cu acest agent. Cancer Biol. Acolo. 2010; 10 :1280–1289. [ PubMed ] [ Google Scholar ]29. 

Di Piazza M., Mader C., Geletneky K., Herrero Y Calle M., Weber E., Schlehofer J., Deleu L., Rommelaere J. Cytosolic activation of cathepsins mediates parvovirus H-1-induced killing of cisplatin și celule gliom rezistente la TRAIL. J. Virol. 2007; 81 :4186–4198. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]30. 

Suchorska B., Weller M., Tabatabai G., Senft C., Hau P., Sabel MC, Herrlinger U., Ketter R., Schlegel U., Marosi C. Rezecția completă a volumului tumorii care crește contrastul este asociată cu o supraviețuire îmbunătățită în glioblastom recurent-rezultate din studiul DIRECTOR. Neuro-oncol. 2016; 18 :549–556. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]31. 

Ballman KV, Buckner JC, Brown PD, Giannini C., Flynn PJ, LaPlant BR, Jaeckle KA Relația dintre supraviețuirea fără progresie la șase luni și punctele finale de supraviețuire globală la 12 luni pentru studiile de fază II la pacienții cu glioblastom multiform . Neuro-oncol. 2007; 9 :29–38. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]32. 

Kingham PJ, Pocock JM catepsina B secretată microglial induce apoptoza neuronală. J. Neurochem. 2001; 76 :1475–1484. [ PubMed ] [ Google Scholar ]33. 

Kees T., Lohr J., Noack J., Mora R., Gdynia G., Tödt G., Ernst A., Radlwimmer B., Falk CS, Herold-Mende C., Régnier-Vigouroux A. Microglia izolat de la pacienții cu gliom câștigă activități antitumorale pe stimularea poli (I:C). Neuro-oncol. 2012; 14 :64–78. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]34. 

Hwang SY, Yoo BC, Jung JW, Oh ES, Hwang JS, Shin JA, Kim SY, Cha SH, Han IO Inducerea apoptozei gliomului de către moleculele secretate de microglia: rolul oxidului nitric și al catepsinei B. Biochim . Biophys. Acta. 2009; 1793 :1656–1668. [ PubMed ] [ Google Scholar ]35. 

Rutledge WC, Kong J., Gao J., Gutman DA, Cooper LA, Appin C., Park Y., Scarpace L., Mikkelsen T., Cohen ML Limfocitele cu infiltrare tumorală în glioblastom sunt asociate cu modificări genomice specifice și legate de clasa transcripțională. Clin. Cancer Res. 2013; 19 :4951–4960. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]36. 

Hussain SF, Yang D., Suki D., Aldape K., Grimm E., Heimberger AB Rolul microglia/macrofagelor care infiltra gliom uman în mediarea răspunsurilor imune antitumorale. Neuro-oncol. 2006; 8 :261–279. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]37. 

Moralès O., Richard A., Martin N., Mrizak D., Sénéchal M., Miroux C., Pancré V., Rommelaere J., Caillet-Fauquet P., de Launoit Y., Delhem N. Activation of un răspuns ajutător și nu reglator al celulelor T CD4+ umane de către parvovirusul H-1 oncolitic. Plus unu. 2012; 7 :e32197. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]38. 

Cassady KA, Haworth KB, Jackson J., Markert JM, Cripe TP La infecție și nu numai: mecanismele anti-cancer pe mai multe direcții ale virusurilor oncolitice. Viruși. 2016; 8:43 . [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]39. 

Macdonald DR, Cascino TL, Schold SC, Jr., Cairncross JG Criterii de răspuns pentru studiile de fază II ale gliomului malign supratentorial. J. Clin. Oncol. 1990; 8 :1277–1280. [ PubMed ] [ Google Scholar ]40. 

Nehmé B., Henry M., Mouginot D. Hibridizare combinată fluorescentă in situ și imunofluorescență: factori limitatori și o strategie de substituție pentru secțiuni de țesut montate pe lame. J. Neurosci. Metode. 2011; 196 :281–288. [ PubMed ] [ Google Scholar ]41. 

Silahtaroglu AN, Tommerup N., Vissing H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaluarea diferitor mixmeri LNA/DNA. Mol. Celulă. Sonde. 2003; 17 :165–169. [ PubMed ] [ Google Scholar ]42. 

Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frize E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B. Fiji: an open-source platform pentru analiza biologic-imagine. Nat. Metode. 2012; 9 :676–682. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]43. 

Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW NIH Image to ImageJ: 25 de ani de analiză a imaginii. Nat. Metode. 2012; 9 :671–675. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]44. 

Lacroix J., Leuchs B., Li J., Hristov G., Deubzer HE, Kulozik AE, Rommelaere J., Schlehofer JR, Witt O. Parvovirus H1 induce selectiv efecte citotoxice asupra celulelor neuroblastomului uman. Int. J. Cancer. 2010; 127 :1230–1239. [ PubMed ] [ Google Scholar ]45. 

Nüesch JPF, Corbau R., Tattersall P., Rommelaere J. Activitățile biochimice ale virusului minut al proteinei nonstructurale NS1 de șoareci sunt modulate in vitro de starea de fosforilare a polipeptidei. J. Virol. 1998; 72 :8002–8012. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]46. 

​​Leuchs B., Roscher M., Müller M., Kürschner K., Rommelaere J. Proces de producție standardizat la scară largă H-1PV cu monitorizare eficientă a calității și cantității. J. Virol. Metode. 2016; 229 :48–59. [ PubMed ] [ Google Scholar ]47. 

Tattersall P., Bratton J. Interacțiuni reciproce productive și restrictive virus-celulă ale tulpinilor imunosupresoare și prototip ale virusului minut al șoarecilor. J. Virol. 1983; 46 :944–955. [ Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]48. 

Institutul de standarde clinice și de laborator. (2014). MM09-A2/Metode de secvențiere a acidului nucleic în medicina de laborator de diagnosticare: Ghid aprobat, ediția a doua. document CLSI MM09-A2 (CSLI).49. 

O’Quigley J., Pepe M., Fisher L. Metoda de reevaluare continuă: un design practic pentru studiile clinice de fază 1 în cancer. Biometrie. 1990; 46 :33–48. [ PubMed ] [ Google Scholar ]