Reovirusul oncolitic ca agent combinat antiviral și antitumoral pentru tratamentul cancerului hepatic

Adel Samson 1 ,Matthew J Bentham 1 ,Karen Scott 1 ,Gerard Nuovo 2 ,Abigail Bloy 1 ,Elizabeth Appleton 1 ,Robert A Adair 1 ,Rajiv Dave 1Adam Peckham-Cooper 1 ,Giles Toogood 1 ,Seishi Nagamori ,Matthew Coffey 3 , 4 ,Richard Vile 1 , 5 , 6 ,Kevin Harrington 6 ,Peter Selby 1 ,Fiona Errington-Mais 1 ,Alan Melcher 6 ,
http://orcid.org/0000-0002-7233-5243Stephen Griffin 1
Corespondență cu Dr. Stephen Griffin și Prof. Alan Melcher, Facultatea de Medicină și Sănătate, Institutul de Cancer și Patologie Leeds, Universitatea din Leeds, Clădirea Wellcome Trust Brenner, Spitalul Universitar St James, Leeds LS7 9TF, Marea Britanie; sdcgriffin@leeds.ac.uk și aamelcher@leeds.ac.uk

Abstract

Obiectiv Virușii oncolitici (OV) reprezintă tratamente proinflamatoare pentru cancer. Aici, am explorat dacă răspunsurile imune înnăscute induse de OV ar putea inhiba simultan HCV în timp ce suprimă carcinomul hepatocelular (HCC). În plus, am extins acest exemplu la alte modele de cancer asociat virusului.

Design și rezultate Ortoreovirusul oncolitic de grad clinic (Reo) a provocat activarea imună înnăscută în țesutul hepatic primar uman în absența citotoxicității și independent de replicarea genomului viral. Pe lângă realizarea terapiei în modelele preclinice de HCC prin activarea celulelor imune degranulante înnăscute, răspunsurile citokinelor induse de Reo au suprimat eficient replicarea HCV atât in vitro, cât și in vivo. În plus, răspunsurile înnăscute induse de Reo au fost, de asemenea, eficiente împotriva modelelor de HCC asociate VHB, precum și a unui model endogen alternativ de limfom asociat virusului Epstein-Barr. Interesant, Reo a părut superior majorității OV în capacitatea sa de a provoca răspunsuri inflamatorii înnăscute din țesutul hepatic primar.

Concluzii Propunem că Reo și alte OV proinflamatorii selectate pot fi utilizate în tratamentul cancerelor multiple asociate cu infecții cu virus oncogene, reducând simultan atât impulsul oncogen asociat virusului, cât și sarcina tumorală. În cazul HCC asociat cu HCV (HCV-HCC), Reo ar trebui să fie considerat un agent alternativ pentru a suplimenta și a sprijini terapiile actuale HCV-HCC, în special în acele țări în care accesul la noi tratamente antivirale HCV poate fi limitat.

Acesta este un articol cu acces deschis distribuit în conformitate cu termenii licenței Creative Commons Attribution (CC BY 4.0), care permite altora să distribuie, să remixe, să adapteze și să construiască pe această lucrare, pentru uz comercial, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată corespunzător. . Consultați: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2016-312009

permisiuni

Dacă doriți să refolosiți unul sau tot acest articol, vă rugăm să utilizați linkul de mai jos, care vă va duce la serviciul RightsLink al Centrului de clearance-ul drepturilor de autor. Veți putea obține un preț rapid și permisiunea instantanee de a reutiliza conținutul în multe moduri diferite.

Solicitați permisiuni

Semnificația acestui studiu

Ce se știe deja pe acest subiect?

Majoritatea carcinoamelor hepatocelulare (HCC) sunt legate de o infecție cu virus oncogen subiacent, și anume HBV (54%) sau HCV (31%), care determină oncogeneza atât prin mecanisme inflamatorii indirecte, cât și prin mecanisme carcinogene directe. În consecință, suprimarea infecțiilor cu VHB/VHC poate îmbunătăți rezultatele clinice ale HCC, dar puțini pacienți cu HCC din întreaga lume sunt vindecați de infecțiile cu hepatită din cauza costurilor, complianței și problemelor de toxicitate a tratamentului.
Terapia pentru pacienții cu HCC avansat este limitată; Sorafenib îmbunătățește supraviețuirea medie doar cu 2-3 luni, este asociat cu efecte secundare semnificative și nu a fost recomandat de Institutul Național pentru Excelență în Sănătate și Îngrijire din Marea Britanie.
Virușii oncolitici (OV) prezintă potențial ca terapii pentru cancer, ucigând celulele maligne prin mecanisme directe și mediate imun.

Care sunt noile descoperiri?

Ortoreovirusul oncolitic de grad clinic (Reo) a provocat secreția de interferon (IFN) și activarea imună înnăscută în țesutul hepatic primar uman în absența citotoxicității și independent de replicarea genomului viral.
Reo a realizat terapia în modele de linie celulară și murină de HCC pozitiv pentru virusul hepatitic/negativ pentru virusul hepatitic și a suprimat eficient replicarea HCV in vitro prin efectele replicării reprimate in vitro și in vivo, prin efectele IFN-urilor de tip I.
Efectele antivirale ale Reo au fost aplicabile și modelelor endogene in vitro de HBV-HCC și limfom asociat virusului Epstein-Barr. Dintre celelalte OV testate, doar tulpina Edmonston a virusului rujeolic a recapitulat efectele antivirale puternice ale Reo.

Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul apropiat?

Se preconizează că desfășurarea unor OV selecționate concentrate pe IFN la pacienții cu cancer care adăpostesc infecții subiacente cu virus oncogeni, fie ca agenți unici, fie în terapie combinată, va suprima infecțiile patogene, îmbunătățind sănătatea organelor și extinzând supraviețuirea specifică cancerului.

Introducere

Carcinomul hepatocelular (HCC) este printre cele mai mari cauze de mortalitate asociată cancerului și are opțiuni terapeutice limitate. Majoritatea HCC sunt legate de o infecție cu virus oncogen subiacent, și anume HBV (54%) sau HCV (31%). 1 HCC asociat VHC (HCV-HCC) are un risc deosebit de mare de recidivă în urma intervențiilor chirurgicale, în comparație fie cu HCC-VHB, fie cu alte tipuri de HCC. 2 , 3 Tratamentul antiviral de succes înainte de rezecția hepatică și/sau transplantul de ficat reduce semnificativ acest risc, 4totuși, toxicitatea asociată terapiei convenționale pentru VHC pe bază de interferon sistemic (IFN) a exclus din trecut mulți pacienți nou diagnosticați cu HCC-VHC de la un astfel de tratament. Noile antivirale cu acțiune directă (DAA) cu profiluri de siguranță îmbunătățite revoluționează terapia HCV, totuși problemele de conformitate sunt comune 5 , iar costul ridicat al AAD limitează profund utilizarea lor în țările mai sărace, unde prevalența HCV-HCC este cea mai mare.

Semnificația acestui studiu

Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul apropiat?
Se preconizează că desfășurarea unor OV selecționate concentrate pe IFN la pacienții cu cancer care adăpostesc infecții subiacente cu virus oncogeni, fie ca agenți unici, fie în terapie combinată, va suprima infecțiile patogene, îmbunătățind sănătatea organelor și extinzând supraviețuirea specifică cancerului.

Pentru pacienții cu HCC avansat, puține sunt cunoscute cu privire la impactul terapiei antivirale asupra tumorilor existente. Dogma atribuie apariția și progresia HCV-HCC unui fenomen observator, determinat de inflamația hepatică cronică. Cu toate acestea, dovezile tot mai mari indică faptul că VHC este, de asemenea, direct oncogen, susținând și mai mult necesitatea terapiei combinate antivirale și antitumorale. Mai exact, terapia antivirală îmbunătățește rezultatele pacientului în limfomul asociat VHC; 6 HCC este mai frecvent în ficatul VHC-pozitiv comparativ cu hepatita autoimună; 7 Proteinele VHC sunt direct oncogene în modelele preclinice 8iar HCV-HCC este mai probabil să mențină expresia miRNA122 supresor tumoral, un cofactor esențial al HCV, evidențiind un rol critic pentru HCV în oncogeneză. 9 Terapia pentru pacienții cu CHC avansat este limitată; Sorafenib îmbunătățește supraviețuirea medie doar cu 2-3 luni, este asociat cu efecte secundare semnificative și nu a fost recomandat de Institutul Național pentru Excelență în Sănătate și Îngrijire din Marea Britanie. 10–12 Chimioterapia trans -arterială este utilizată în mod obișnuit pentru pacienții cu boală avansată local/ca terapie de legătură cu transplant și a fost, de asemenea, testată ca tratament sistemic, dar este frecvent complicată de reactivarea/exacerbarea infecțiilor subiacente cu VHC/VHB. 13 , 14Astfel, având în vedere prognosticul prost pentru majoritatea pacienților cu HCC, o terapie combinată antiviral și antitumoral ar putea aduce beneficii semnificative pentru pacient.

Virușii oncolitici (OV) prezintă potențial ca terapii pentru cancer; în mod clasic, uciderea selectivă a tumorii apare din liza celulară directă accelerată de trăsăturile asociate virusului care favorizează replicarea în celulele maligne. Cu toate acestea, OV sunt, de asemenea, inductori puternici ai imunității gazdei, care este din ce în ce mai recunoscut ca fiind componenta majoră a eficacității lor antitumorale. 15 Răspunsuri încurajatoare au fost observate în testele clinice în stadiu avansat fără toxicitate semnificativă, primul OV recent licențiat pentru tratamentul melanomului 16 („T-Vec”, virusul herpes simplex tip 1 (HSV-1) care codifică colonia de macrofage granulocite umane. factor de stimulare (GM-CSF)). Ficatul și HCC au făcut obiectul mai multor studii clinice OV, 17inclusiv JX-594, un virus vaccinia modificat (VV) care codifică GM-CSF, 18 și propriile noastre investigații folosind Orthoreovirus oncolitic (Reo) în tratamentul cancerului colorectal metastatic (CRC). 19

Am emis ipoteza că natura proinflamatoare a imunoterapiei OV poate exercita beneficii concomitente atât asupra cancerului, cât și asupra infecției cu virus oncogen subiacent prin stimularea răspunsurilor înnăscute, și anume IFN. În consecință, răspunsurile imune înnăscute induse de Reo în țesutul hepatic primar au efectuat simultan distrugerea tumorii și suprimarea replicării HCV in vitro și in vivo. Aceste răspunsuri nu au necesitat replicare productivă Reo și au fost aplicabile altor modele de tumori asociate virusului. Propunem că acest mod dublu de acțiune, combinat cu un record de siguranță excelent, poate favoriza desfășurarea rapidă a OV, cum ar fi Reo, pentru pacienții dezavantajați cu HCC avansat, asociat virusului.

Rezultate

Răspunsurile imune înnăscute induse de reo apar atât în ficatul normal, cât și în ficatul canceros

Am confirmat anterior că Reo vizează eficient metastazele hepatice CRC după perfuzia intravenoasă, în ciuda anticorpilor de neutralizare a pacientului. 19 Transportul virusului mediat de celule a permis replicarea Reo în cadrul tumorilor și recuperarea virusului infecțios din explantele tumorale. Cu toate acestea, colorarea țesutului hepatic normal din jur a fost, de asemenea, demonstrată la un număr de pacienți, dar virusul infecțios nu a putut fi izolat. Acest lucru ne-a determinat să reexaminăm țesutul normal al pacientului cu ficat, confirmând expresia proteinei Reo la 5 din 10 subiecți ( figura 1 A).

figura 1

Reo ajunge la țesutul hepatic normal după injectarea intravenoasă și stimulează secreția de interferon (IFN) din celulele hepatice ex vivo. (A) Imunohistochimie (IHC) pentru proteina capsidei Reo σ3 (maro) din țesut hepatic normal derivat de la un pacient tratat intravenos cu Reo (stânga) sau un martor netratat (dreapta). Lamele sunt reprezentative pentru seria de studii clinice sau pentru șase martori netratate. (B) Test de viabilitate pentru hepatocite îmbogățite ex vivo tratate utilizând soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau 10 PFU/celulă Reo timp de 72 de ore și analizată pentru integritatea membranei prin colorare cu albastru tripan. (C) transcriptază inversă cantitativă (qRT)-PCR pentru Reo σ3. Hepatocitele umane primare au fost tratate folosind 1 PFU/celulă Reo sau uv-Reo și incubat timp de 24 sau 48 de ore înainte de extracția ARN. (D) Western blot pentru Reo σ3 și β-actină. Hepatocitele umane primare au fost tratate folosind 1 PFU/celulă Reo sau uv- Reo și incubate timp de 24 sau 48 de ore. Hepatocitele tratate cu simulare (M) și ARN purificat din stocurile de reolizină (+) au servit drept martori negativi și pozitivi. (E) Hepatocitele umane au fost infectate cu Reo sau uv -Reo ca mai sus și supuse analizei de imunofluorescență pentru proteina capsidei Reo σ3, cu colorant nuclear Hoechst. (F) ELISA pentru IFN-α, IFN-β, interleukină (IL)-28b/IL-29 și IFN-γ derivate din celule hepatice mixte ex vivo, hepatocite îmbogățite și celule mononucleare hepatice (LMC) după stimularea cu Reo sau PBS Control. * semnifică p<0,005.

Apoi, am examinat infecția cu Reo a țesutului hepatic uman ex vivo normal, generând suspensii unicelulare. Celulele hepatice mixte au fost fracționate în subpopulații de hepatocite și celule mononucleare hepatice (LMC) îmbogățite (a se vedea figura suplimentară online S1a ). Important, expunerea populațiilor de hepatocite primare îmbogățite la Reo nu a provocat toxicitate celulară ( figura 1 B), dar a dus la transcrierea limitată a ARN viral ( figura 1 C) și expresia proteinei la 24 de ore după infecție (figura 1 D, E) în absența producției de virion infecțios de novo (a se vedea figura suplimentară online S1b). Interesant, expresia ARN-ului și proteinei a scăzut între 24 și 48 de ore, ceea ce sugerează inducerea mecanismelor antivirale celulare ( figura 1 D, E). În schimb, Reo s-a replicat eficient într-o gamă largă de linii HCC in vitro, producând noi virioni infecțioși (vezi figura suplimentară online S1c ) și inducând citotoxicitate (vezi figura suplimentară online S1d ), în primul rând prin apoptoză (vezi figura suplimentară online S1e ). Foarte important, au fost observate răspunsuri puternice ale citokinelor la ex vivo la Reo a celulelor hepatice mixte, a fracțiilor îmbogățite cu hepatocite sau LMC la Reo ( figura 1).F). Toate tipurile de celule au exprimat IFN-β, în timp ce IFN-α și IFN-y s-au segregat în principal în fracția LMC, iar IFN-λ (interleukina (IL)-28b/IL-29) a fost mai proeminent în fracțiile îmbogățite cu hepatocite. Astfel, Reo are potențialul de a stimula imunitatea înnăscută într-o proporție semnificativă a ficatului, mai degrabă decât să fie limitat la celulele tumorale și/sau LMC asociate tumorii.

Material suplimentar

[gutjnl-2016-312009supp.pdf]

Răspunsurile imune înnăscute induse de reo mediază terapia anti-HCC

Pentru a evalua eficacitatea lui Reo împotriva modelelor de HCC cu/fără VHC, am folosit șoareci cu imunodeficiență combinată severă (SCID) imunocompromiși, purtând xenogrefe subcutanate de celule Huh7 sau Huh7-JFH1, purtând un replicon subgenomic de VHC (izolat de genotip 2a, JFH1). O singură injecție de Reo în tumorile palpabile (ziua 5 postimplantare) a întârziat creșterea tumorii pe parcursul unui experiment de 3-4 săptămâni, producând tumori mici, mai puțin vasculare macroscopic ( figura 2 A). Examenul histologic al tumorilor a confirmat expresia proteinei nestructurale (NS)5A a VHC și asocierea antigenului Reo cu necroza și caspaza 3 scindată ( figura 2 B). Cu toate acestea, șoarecii imunodeficienți tratați cu Reo au dezvoltat o toxicitate considerabilă evidențiată de pierderea în greutate (vezi figura suplimentară online S2a), necesitând sacrificii premature.

Figura 2

Răspunsurile imune înnăscute induse de reo sunt suficiente pentru terapia anti-carcinom hepatocelular (HCC). (A) Tumorile de flanc subcutanate excizate de la șoareci SCID după o singură injecție Itu de PBS sau 1 x 106 ^PFU Reo. (B) Colorare reprezentativă IHC (maro) pentru proteina nestructurală a VHC (NS) 5A, proteina capsidei Reo σ3 și caspaza 3 scindată în xenogrefe subcutanate Huh7 și Huh7-JFH1 la șoarecii SCID tratați cu o singură injecție Itu de 1 x ¹⁰⁶ PFU Reo în a 6-a zi după implantarea tumorii. (C) Volumul tumorii de xenogrefe subcutanate de flanc Huh7 (stânga) și Huh7-JFH1 (dreapta) la șoareci SCID tratați cu injecții Itu de 3 ori pe săptămână de PBS sau 1 x ¹⁰⁶PFU uv-Reo timp de 4 săptămâni începând cu a 6-a zi după implantarea tumorii. (D) ELISA pentru interferon (IFN)-α, IFN-p, IFN-y și interleukină (IL)-28b/IL-29 derivate din celule hepatice mixte ex vivo după stimularea cu control UV-Reo sau PBS. (E) Creșterea tumorii a tumorilor singeneice subcutanate 1MEA la șoareci BALB/c tratați cu Itu PBS de 3 ori pe săptămână, injecții 1 x 106 ^PFU Reo sau 1 x 106 ^PFU uv-Reo, începând cu a șasea zi după implantarea tumorii. * semnifică p<0,005.

Pentru a evita problemele de toxicitate și pentru a delimita terapia imună, mai degrabă decât terapia litică, am revizuit studiile anterioare în modele de melanom, în care Reo ( uv -Reo) inactivat cu UV (vezi figura suplimentară online S2b ) a amorsat răspunsurile imune antitumorale în comparație cu virusul viu. 20 În consecință, uv -Reo a provocat o întârziere semnificativă atât a creșterii tumorii HCV-pozitive, cât și a HCV-negative ( figura 2 C). uv -Reo a provocat, de asemenea, răspunsuri înnăscute de citokine din suspensiile primare de celule hepatice mixte umane, deși acest lucru a fost mai concentrat pe IFN-β ( figura 2).D). În cele din urmă, un model subcutanat de HCC imunocompetent (celule 1MEA la șoarecii Balb/c singenici) a evidențiat reduceri similare ale creșterii tumorii pentru Reo și uv -Reo, susținând un mecanism de acțiune condus de imun, mai degrabă decât un mecanism de acțiune oncolitic ( figura 2 E). Luată împreună, imunitatea înnăscută indusă de Reo pare suficientă pentru efectele anti-HCC în modelele preclinice, independent de replicarea genomică Reo, indicând un rol major pentru un astfel de mecanism la oamenii care urmează tratament cu virus viu de grad clinic.

Răspunsurile anti-HCC induse de reo necesită activarea mediată de IFN a limfocitelor ucigașe naturale

Examinarea histologică a tumorilor 1MEA tratate cu Reo a evidențiat o infiltrație semnificativă de celule natural killer (NK), indicând faptul că acestea pot reprezenta o componentă efectoră a răspunsului antitumoral ( figura 3 A), așa cum se observă pentru alte OV. 21 , 22 În consecință, tratamentul cu uv -Reo a fost ineficient împotriva xenogrefelor Huh7 în cadrul șoarecilor SCID/Beige cărora le lipsește degranularea funcțională a celulelor imune, în concordanță cu o cerință terapeutică pentru activitatea celulelor NK ( figura 3 B). Interesant, creșterea tumorală crescută nu a fost observată în SCID/Beige în comparație cu contextul SCID, sugerând că celulele degranulante nu ar putea controla eficient creșterea tumorii în absența stimulării exogene.

Figura 3

Interferonul reostimulat (IFN) conduce răspunsurile imune anti-carcinomului hepatocelular (HCC) prin activarea celulelor natural killer (NK). (A) Colorare reprezentativă IHC (maro) pentru celule NK în tumori singeneice subcutanate 1MEA la șoareci BALB/c tratați cu injecții Itu de 3 ori pe săptămână cu PBS sau 1 x 106 PFU ^Reo . (B) Creșterea tumorii a xenogrefelor subcutanate Huh7 la șoareci SCID/bej tratați cu injecții Itu de 3 ori pe săptămână cu PBS sau 1 x ¹⁰⁶PFU uv-Reo. (C) Diagrama de suprapunere a citometriei în flux (stânga) și cuantificarea (dreapta) a intensității mediane a fluorescenței (MFI) pentru expresia NK CD69 în celulele mononucleare hepatice (LMC) tratate folosind PBS, 1 PFU/celulă Reo, 1 PFU/celulă Reo și tip I Anticorpi blocanți IFN sau 1 PFU/celulă Reo și anticorpi izotip. (D) Similar cu (C), dar LMC-urile au fost tratate cu PBS, 1 PFU/celulă Reo sau 1 PFU/celulă uv-Reo. (E) Test de degranulare care arată procentul de celule NK hepatice CD107-pozitive. LMC-urile au fost pretratate cu PBS sau 1 PFU/celulă Reo timp de 24 de ore, apoi au fost coincubate cu ținte Huh7 sau Huh7-JFH1 timp de 4 ore. (F) Test de eliberare ^{a 51} Cr folosind LMC-uri pretratate cu PBS sau 1 PFU/celulă Reo timp de 24 de ore, apoi spălate și coincubate cu ținte Huh7 sau Huh7-JFH1 marcate cu ^{51 Cr timp de 4 ore.}Datele sunt ⁵¹Eliberarea de Cr ca procent din maximul potențial. *semnifica p<0,005.

În conformitate cu modelele murine și cu datele noastre anterioare, Reo a stimulat eficient celulele NK derivate din ficat uman ex vivo printr-un mecanism dependent de IFN de tip 1 (figura 3 C) , activând astfel o fracțiune majoră în cadrul populației LMC (a se vedea figura suplimentară online S1a ) . De asemenea, stimularea UV -Reo a LMC a dus, de asemenea, la activarea celulelor NK ( figura 3 D), la fel ca și Reo, ducând, de asemenea, la uciderea îmbunătățită a țintelor Huh7 HCV-pozitive și HCV-negative ( figura 3 E, F). Mai mult, epuizarea celulelor NK din celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) a prevenit uciderea HCC stimulată prin Reo (vezi figura suplimentară online S3a), susținând în continuare celulele NK ca efectori înnăscuți majori în terapia mediată de OV. Astfel, imunitatea anti-HCC indusă de Reo depinde de IFN de tip 1, care, la rândul său, activează celulele NK, permițându-le să recunoască și să omoare ținte tumorale.

Imunitatea indusă de reo exercită efecte anti-HCV puternice in vitro

Având în vedere inducerea puternică a citokinelor inflamatorii la ex vivo la Reo a celulelor hepatice umane ex vivo, am considerat că supernatanții de cultură condiționate rezultați ar trebui să exercite efecte antivirale. Mediile condiționate filtrate (CM) au fost preparate în urma stimulării controlului sau Reo (reovirus-CM (RCM)) a celulelor hepatice mixte, a populațiilor fracționate îmbogățite cu hepatocite și LMC sau a celulelor HCC primare mixte. Toate RCM au exercitat efecte inhibitoare dependente de doză asupra replicării HCV în celulele Huh7 ( figura 4 A). Comparația cu IFN-α, IFN-β sau IL-29 purificat, derivat din leucocite sau cu combinații ale acestora, a evidențiat un model compatibil cu un mecanism mediat în principal de IFN-β (vezi figura suplimentară online S4a); IFN-p a fost semnificativ mai puternic în capacitatea sa de a inhiba replicarea HCV comparativ cu IFN-a sau IL-29, iar combinațiile de citokine nu au inhibat replicarea HCV mai mult decât IFN-p singur. Blocarea IFN a atenuat în mod semnificativ efectul inhibitor al HCV al celulelor hepatice mixte RCM ( figura 4 B), fără efecte citotoxice sau de inhibiție a creșterii măsurabile asupra celulelor Huh7-JFH1 (a se vedea figura suplimentară online S4b ).

Figura 4

Interferonul reostimulat (IFN)-β inhibă puternic HCV in vitro. (A) Testul luciferazei folosind celule Huh7-JFH1 tratate timp de 24 de ore cu o serie de diluții de mediu condiționat (CM) sau reovirus-CM (RCM) derivat din celule hepatice mixte, celule mononucleare hepatice (LMC), hepatocite îmbogățite sau primare mixte celule de carcinom hepatocelular (HCC). Activitatea luciferazei a fost calculată ca procent din valorile mediului de control. (B) Testul luciferazei utilizând celule Huh7-JFH1 tratate timp de 4 ore cu RCM de celule hepatice mixte (diluție 1:16), RCM de celule hepatice mixte și anticorpi de blocare a IFN de tip I sau RCM de celule hepatice mixte și anticorpi izotip. Celulele au fost apoi incubate în mediu de creștere complet fără tratament timp de încă 20 de ore înainte de analiză. (C) ELISA pentru secreția de IFN-p (stânga) și interleukină (IL)-28b/IL-29 (dreapta) dintr-un panou de linii celulare HCC după tratament timp de 72 de ore cu PBS sau 1 PFU/celulă Reo. (D) Testul luciferazei folosind celule Huh7-JFH1 tratate timp de 24 de ore cu o gamă de diluții de CM sau RCM derivate din celule JHH1, HLE sau JHH2. Liniile roșii punctate reprezintă procentul estimat al activității luciferazei în funcție de concentrațiile RCM IFN-β, așa cum este prezis din ecuația liniei de tendință pentru inhibarea repliconului folosind IFN-β purificat (vezi onlinefigura suplimentară 4SA ). (E) Imunofluorescență reprezentativă pentru proteina nestructurală (NS)5A a VHC în celulele Huh7-JFH1 tratate timp de 24 de ore cu CM sau RCM la o diluție de 1:16 derivată din celule JHH1, HLE sau JHH2. (F) Testele luciferazei folosind celule Huh7 infectate cu HCV, tratate timp de 24 de ore cu CM sau RCM derivat din celule JHH1, HLE sau JHH2 la o diluție de 1:16. * semnifică p<0,005.

Expunerea mai multor linii de HCC la Reo a dus la modele variabile de inducție a citokinelor, lipsită de IFN-α, dar cu cantități semnificative de IFN-β și IFN-λ ( figura 4 C). Am definit RCM derivat din celulele stimulate JHH1, HLE și JHH2 ca reținând un conținut ridicat, mediu și, respectiv, scăzut de IFN-β. Efectele antivirale s-au corelat direct cu nivelurile RCM IFN-β, oglindând ecuația liniei de tendință pentru citokină purificată derivată din leucocite (corelația de rang Spearman de 0,929, p = 0,001) (figura 4 D, vezi figura suplimentară online S4a ) . Scăderea concomitentă a expresiei proteinei VHC a fost observată atât prin imunofluorescență ( figura 4 E), cât și prin western blot (vezi figura suplimentară online S4c).), din nou fără efecte citotoxice perceptibile (a se vedea figura suplimentară online S4d ). În mod critic, activitatea antivirală a RCM a fost aplicabilă și la VHC infecțios de lungime completă, din nou cu corelație directă cu nivelurile de IFN-β, măsurate prin reduceri ale activității reporterului NS5A-luciferazei (figura 4 F, vezi figura suplimentară online S4e), ARN genomic al VHC ( vezi figura suplimentară online S5a ) și fluorescența genei reporter NS5A-Green Fluorescent Protein (GFP) (vezi figura suplimentară online S5b, c ).

Imunitatea indusă de reo eradică HCV din cultura celulară și exercită efecte antivirale in vivo

Apoi am examinat dacă expunerea la RCM ar putea vindeca în mod eficient celulele Huh7-JFH-1. Huh7-JFH-1 au fost expuși la RCM sau medii de control timp de 14 zile în absența selecției. Reprovocarea cu G418 a condus la o lipsă de colonii viabile în celulele tratate cu JHH1 RCM sau cu IFN-β, cu activitate luciferazei nedetectabilă în populațiile în vrac ( figura 5 A).

Figura 5

Răspunsurile inflamatorii induse de reo eradicează HCV din cultura celulară și exercită efecte antivirale in vivo. (A) Celulele Huh7-JFH1 au fost tratate timp de 14 zile cu reovirus-CM (RCM) sau mediu condiționat (CM) derivat din celule JHH1 la o diluție de 1:16 sau cu medii de control sau interferon purificat (IFN)-β la 50 pg/mL. Celulele au fost apoi fie cuantificate pentru activitatea luciferazei (dreapta jos), fie însămânțate la densitățile afișate în dreapta sus și cultivate în mediu care conține G418 timp de 4 zile înainte de fixare și colorare în albastru de metilen (stânga). (B) Imagini reprezentative ale sistemului de imagistică in vivo (IVIS) ale activității repliconului luciferazei HCV în xenogrefele subcutanate Huh7-JFH1 la șoarecii SCID. Șoarecii au fost tratați cu injecții Itu de două ori pe săptămână cu PBS sau 1× ¹⁰⁵ PFU uv-Reo, începând imediat după evaluarea inițială. (C) (stânga) Cuantificarea intensității luciferazei IVIS din (B). Graficul arată activitatea luciferazei procentuale în raport cu valorile inițiale din ziua 0 post-tratament. (Dreapta) Volumul tumorii xenogrefe prezentate în (B).

Apoi, am testat dacă imunitatea stimulată cu UV -Reo ar putea exercita un efect antiviral în modelul preclinic SCID Huh7-JFH-1. Xenogrefele subcutanate palpabile Huh7-JFH-1 au fost tratate intratumoral fie cu uv -Reo în doză mică, fie cu PBS pe o perioadă de 9 zile, măsurând creșterea tumorii, precum și luciferaza exprimată de HCV în tumori folosind un sistem de imagistică in vivo (IVIS). Tumorile au fost normalizate și separate în grupuri echivalente de control/tratament pe baza citirilor IVIS din ziua 0. În timp ce citirile luciferazei au scăzut în mod natural la controale din cauza lipsei de G418, tratamentul cu doze mici de UV-Reo a condus la o reducere suplimentară semnificativă a citirilor IVIS . , independent de creșterea tumorii ( figura 5B, C). Mai mult, examinarea histologică a tumorilor Huh7-JFH-1 suplimentare tratate cu o singură injecție de Reo viu a evidențiat reduceri marcate ale expresiei proteinei NS5A a VHC în zone ale tumorii distincte de cele care suferă modificări necrotice sau colorații pentru antigenul Reo, care susțin un trans- efect antiviral mediat de citokine (a se vedea figura suplimentară online S6a ). În consecință, RCM generată din expunerea la UV -Reo a celulelor hepatice de murină mixte a păstrat activitatea anti-HCV în celulele HUH7-JFH1 (a se vedea figura suplimentară online S6b), deși redus semnificativ în comparație cu RCM uman. Prin urmare, în timp ce RCM/IFN murin stimulează parțial receptorii IFN Huh7, modelele de xenogrefă murine subestimează probabil magnitudinea inhibării potențial realizabilă într-un context uman.

Răspunsurile antivirale induse de reo sunt realizabile în alte modele de cancer asociat virusului

Am motivat că o eficacitate antivirală similară poate fi obținută în alte modele de cancer asociat virusului. Am evaluat efectele imunității reostimulate împotriva celulelor PLC/PRF/5 care conțin HBV integrat și celulelor Daudi, care sunt derivate dintr-un limfom Burkitt pozitiv pentru virusul Epstein-Barr (EBV), cunoscut ca fiind rezistent la citotoxicul indus de Reo. efecte. 23

Secreția de antigen de suprafață PLC/PRF/5 HBV (HBsAg) servește ca un marker al expresiei genei virale. 24 RCM derivat atât din celulele LMC primare, cât și din celulele JHH-1 au obținut reduceri ale secreției de HBsAg comparabile cu IFN-β purificat pe o perioadă de 5 zile (figura 6 A, vezi figura suplimentară online S7a), fără efecte observabile de inhibare a creșterii (a se vedea figura suplimentară online S7b ). Apoi am testat capacitatea lui Reo de a suprima reactivarea EBV din celulele Daudi tratate cu tetradecanoilphorbol-13-acetat (TPA)/butirat. Atât tratamentul direct cu Reo al celulelor Daudi, cât și expunerea la RCM derivat din PBMC au condus la o reducere semnificativă a celulelor pozitive pentru antigenul timpuriu (EA) EBV ( figura 6).B, C). Deoarece celulele Daudi nu sunt gazde permisive, acest efect a fost probabil atribuit citokinelor induse de Reo.

Figura 6

Răspunsurile antivirale induse de reo inhibă HBV și virusul Epstein-Barr (EBV) in vitro. (A) ELISA pentru antigenul de suprafață al HBV (HBsAg) secretat din celulele PLC/PRF/5 tratate timp de 5 zile folosind o gamă de diluții de mediu condiționat (CM) sau reovirus-CM (RCM) derivat din celulele mononucleare hepatice (LMC) ( sus) sau celule JHH1 (jos). (B) Imunofluorescență reprezentativă (stânga) pentru antigenul timpuriu EBV (EA) și cuantificarea celulelor Daudi EA-pozitive (dreapta). Celulele au fost tratate folosind PBS timp de 48 de ore, 1 PFU/celulă Reo timp de 48 de ore, inhibitor de histon deacetilază (HDI) timp de 24 de ore sau 1 PFU/celulă Reo timp de 48 de ore, urmat de HDI timp de 24 de ore. (C) (stânga) ELISA pentru interferon (IFN)-α, IFN-p, IFN-y și interleukina (IL)-28b/IL-29 derivat din sângele periferic MC (PBMC) după stimularea cu control Reo sau PBS. (Dreapta) Cuantificarea celulelor Daudi pozitive EA tratate timp de 24 de ore folosind medii de control, PBMC CM, PBMC RCM, toate urmate de un tratament suplimentar de 24 de ore folosind fie PBS, fie HDI. (D) Testul luciferazei folosind celule Huh7-JFH1 tratate timp de 24 de ore cu o gamă de diluții de CM sau 10 PFU/celulă virus oncolitic (OV)-CM derivat din celule hepatice mixte. * semnifică p<0,005.

În cele din urmă, am evaluat dacă Reo a fost unic în capacitatea sa de a genera răspunsuri puternice de citokine anti-HCV din celulele hepatice mixte primare umane. Dintr-un grup de OV cercetate în mod obișnuit, numai CM generată de expunerea la virusul rujeolic tulpina Edmonston (MV-Edm) a recapitulat eficacitatea anti-HCV observată pentru Reo împotriva celulelor Huh7-JFH-1 (figura 6 D ) . Expunerea la concentrații foarte mari de HSV-1 CM a generat doar efecte modeste, în timp ce VV nu a provocat răspunsuri antivirale apreciabile. În plus, corelația dintre efectele antivirale și cele prezise a fi atribuibile inducerii IFN-β (vezi figura suplimentară online S7c) a fost semnificativ (p<0,05) pentru toate OV, cu excepția VV; niveluri scăzute de citokine au fost prezente în VV CM la concentrații similare cu cele eliberate din celulele hepatice tratate simulat, dar niciunul nu a exercitat efecte antivirale asupra celulelor Huh7-JFH-1. Prin urmare, alți factori prezenți în mediile de control pot ameliora efectele IFN de nivel scăzut sau aceste niveluri scăzute pot să nu corespundă cu ecuația predictivă (a se vedea figura suplimentară online S7c ). Luat împreună, Reo pare capabil să inducă răspunsuri antivirale puternice, conduse de IFN-β, care sunt eficiente atât împotriva virusurilor tumorale ARN, cât și împotriva ADN-ului, dar această capacitate nu este omniprezentă printre OV.

Discuţie

Aici, am furnizat primele dovezi că răspunsurile inflamatorii înnăscute induse de OV vizează simultan infecțiile cu virus oncogene, precum și tumorile asociate, folosind în primul rând exemplul de HCV-HCC, dar cu dovezi suplimentare de principiu pentru alte modele. Inducerea IFN de tip I a fost un mecanism cheie, unificator, care determină atât eficacitatea antivirală, cât și antitumorală în sistemele noastre model, iar eficacitatea obținută folosind uv -Reo pledează împotriva unui rol semnificativ pentru țintirea/liza directă a tumorii. În plus, astfel de calități nu erau omniprezente în rândul OV-urilor, făcând selecția agentului pentru aplicații viitoare o considerație importantă.

IFN-ul reo-indus a exercitat atât efecte antivirale directe asupra replicării virusului in vitro, cât și efecte antitumorale in vivo prin activarea celulelor imune înnăscute degranulante, cel mai probabil celule NK. Prin urmare, șoarecii SCID/bej nu au putut să răspundă la terapia UV- Reo, dar acest lucru nu a fost compromis de lipsa imunitații adaptive în contextul SCID. Celulele NK sunt activate indirect de IFN, 25 și probabil contribuie, de asemenea, la efecte antivirale in vivo prin uciderea celulelor tumorale/hepatocitelor infectate. 26

Efectele antivirale și antitumorale mediate de IFN-β în modelele preclinice nu au fost dependente de replicarea Reo, deoarece uv -Reo a generat răspunsuri similare din celulele hepatice umane. Acest lucru amintește de alte studii OV, în care capacitatea de a finaliza un ciclu infecțios complet este nelipsită pentru amorsarea imunității antitumorale mediată de IFN. 20 , 22 , 27 Cu toate acestea, este probabil ca virusul competent de replicare să ofere alte avantaje clinice atunci când se tratează pacienți umani preimuni, cum ar fi potențiala amplificare la situsurile tumorale, 19 și transportul mediat celular 28 pentru a atenua răspunsurile anticorpilor existente; dacă acesta din urmă apare pentru uv-virusul inactivat este necunoscut, iar acest lucru ar fi în prezent imposibil de testat in vivo, având în vedere absența reactivului de grad clinic. Genomii ortoreovirusului uman dsRNA sunt recunoscuți de receptorii de recunoaștere a modelelor, inclusiv RIG-I, 29 , deși nu este clar dacă acest lucru este valabil și pentru uv -Reo. Alți reovirusuri, cum ar fi reovirusul Carp, sunt, de asemenea, cunoscuți că declanșează răspunsuri prin căile receptorilor Toll-like, 30 totuși măsura în care acestea sunt activate de uv- Reo în celulele hepatice umane este necunoscută. Nu putem exclude o contribuție a imunității adaptive la terapie în modelele singeneice 1MEA, dar aceasta ar fi probabil în plus față de răspunsul anti-tumoral înnăscut esențial.

Acest studiu oferă o nouă dimensiune antivirală răspunsurilor înnăscute induse de OV, care, la rândul lor, mediază o mare parte din eficacitatea lor antitumorală. Acest lucru ar putea avea beneficii semnificative pentru cancerele precum HCC, pentru care opțiunile terapeutice sunt limitate și majoritatea apar ca urmare a infecției cu VHB sau VHC. Modelele preclinice disponibile pentru studiul infecției/replicației cu VHC sau într-adevăr cu VHB rămân sever limitate și toate sunt stabilite în medii genetice modificate sau imunocompromis indus. 31 , 32În plus, sistemele murine transgenice care dezvoltă spontan HCC într-un context HCV exprimă în mod necesar proteine virale sub promotori autologi, mai degrabă decât într-un context replicativ, făcându-le inadecvate pentru testarea terapiei mediate de OV. Modelele de xenogrefă Huh7-JFH1 folosite în studiul de față sunt, de asemenea, limitate, dar oferă avantajul de a replica HCV într-un context HCC, unde răspunsurile la semnalizarea imună înnăscută rămân intacte.

Noile AAD care vizează HCV s-au dovedit recent a fi bine tolerate la pacienții cu HCV-HCC. 33 În mod interesant, s-a demonstrat recent că răspunsurile DAA susținute la pacienții cu VHC cronic se corelează cu restabilirea homeostaziei de semnalizare a IFN hepatic de tip I și expresia crescută a unei serii definite de gene stimulate de IFN (ISG) la încetarea tratamentului. 34Tratamentul cu OV combinat cu DAA ar putea îmbunătăți rata la care are loc o astfel de expresie intrahepatică a ISG, îmbunătățind în mod eficient clearance-ul viral la pacienții cu HCC. Cu toate acestea, probabilitatea este ca majoritatea pacienților cu acces la AAD să aibă infecția cu VHC vindecată înainte de apariția HCC, iar dovezile acumulate că VHC este direct oncogen oferă o justificare solidă pentru adoptarea aceleiași practici pentru pacienții cu HCC avansat. . Astfel, Reo ar putea avea o relevanță deosebită în țările care nu sunt capabile să susțină administrarea pe scară largă a AAD, unde atât prevalența HCV, cât și deci și HCC pot fi mai mari. În plus, efectele Reo anti-HCC ar putea susține sau servi ca terapie de linia a doua la standardul de îngrijire Sorafenib sau să formeze combinații cu trans-chimioterapia arterială. Acest lucru poate deveni din ce în ce mai relevant în lumina recentelor studii controversate care susțin că terapia DAA poate să nu fie la fel de eficientă ca IFN în prevenirea reapariției HCV-HCC după intervenția chirurgicală, deși acest lucru așteaptă confirmarea în cohorte mult mai mari de pacienți. 35 , 36

Am demonstrat anterior că imunitatea indusă de Reo este aplicabilă unui număr de scenarii tumorale variate, iar aici arătăm că această activare imună înnăscută prezintă eficacitate antivirală. Cu toate acestea, această trăsătură nu a fost comună tuturor celorlalte OV testate, doar MV-Edm împărtășind capacitatea Reo de a induce puternic expresia IFN de tip I în celulele hepatice umane primare. Poate deloc surprinzător, acest lucru sugerează că OV provenind din diferite familii de virusuri pot varia în principalul mecanism prin care exercită efecte anti-tumorale. Interesant, VV, platforma pentru JX-594 modificat, a fost un activator slab al răspunsurilor înnăscute în țesutul hepatic primar; este posibil ca o gamă considerabilă de antagonişti imuni înnăscuţi codificaţi de VV să contribuie la acest rezultat. 37În mod interesant, terapia cu JX-594 a redus încărcările cu VHB la o cohortă mică de pacienți cu HCC într-un substudiu de probă, dar acest lucru nu a fost atribuit direct stimulării imune hepatice. 38

Potențialul clinic al Reo de a acționa ca terapie antivirală și antitumorală combinată în contextul HCV-HCC este susținut de descoperirea noastră că virusul poate accesa țesutul hepatic normal, precum și tumorile, după livrarea intravenoasă la pacienți. În consecință, ex vivo celulele hepatice primare ex vivo la Reo a dus atât la transcripția ARN viral, cât și la exprimarea proteinei, deși acest lucru nu a culminat cu secreția de particule infecțioase de novo. Aceasta s-a corelat cu inducerea puternică de IFN în celulele hepatice umane normale în absența toxicității evidente; prin urmare, deducem că astfel de răspunsuri limitează, mai degrabă decât previn, replicarea virală în țesutul normal in vivo, în timp ce acest lucru este mai puțin probabil să apară într-un context tumoral, modificând astfel subtil modelul clasic pentru specificitatea tumorii OV. Ca atare, profilul de siguranță favorabil al Reo este potrivit pentru starea avansată de boală hepatică la pacienții cu HCC, majoritatea având ciroză subiacentă. În mod încurajator, biopsiile HCC de la pacienții injectați cu OV în studiile clinice au arătat infiltrație difuză de limfocite,18 care susțin în continuare utilizarea OV ca imunoterapii combinate antivirale și anti-HCC. Pe baza înregistrărilor lor excelente de siguranță, propunem ca desfășurarea unor OV selectați la pacienții cu cancer care adăpostesc infecții subiacente cu virusul oncogen să fie explorată în studiile clinice. Cercetările viitoare ar trebui să combine OV concentrat pe IFN, cum ar fi Reo, cu alți agenți imunostimulatori, inclusiv inhibitori ai punctelor de control imune (CI). Interesant este că aplicarea inversă a CI ca antivirale este explorată pentru infecțiile cronice precum HIV, 39 sugerând că atât OV-uri asemănătoare Reo, cât și CI pot forma terapii combinate antivirale/antitumorale eficiente.

Materiale și metode

Standarde etice

Țesuturile hepatice normale și maligne ex vivo au fost obținute de la pacienții supuși unei intervenții chirurgicale de rutină planificate legate de cancer la Spitalul Universitar St. James, Leeds, Marea Britanie. Consimțământul informat scris a fost obținut în conformitate cu revizuirea și aprobarea etică instituțională locală.

Imunohistochimie

Am folosit un sistem automat Bond Max (Leica Biosystems) așa cum este descris. 40 anticorpi Reovirus σ3 și caspaza 3 scindați au fost diluați la 1:1000. Detectarea HCV NS5A a inclus extragerea antigenului și diluarea anticorpilor de 1:100. CD117 a reprezentat un marker specific celulei NK. 41

Microscopia cu fluorescență

Ser policlonal de oaie anti-NS5A (1:2000, de la Mark Harris, Leeds), 42 clone de șoarece anti-EBV EA-D (0261) (Santa Cruz, 1:100), anticorpi secundari conjugați Alexa Fluor (Invitrogen, 1: 200) sau fluorescența directă GFP a fost fotografiată folosind un sistem de imagistică celulară EVOS FL sau un zoom Incuyte. 4F2 (anticorp reovirus σ3) a fost depus pe DSHB de către Dermody, TS (DSHB Hybridoma Product 4F2 (reovirus)). Celulele Huh7-JFH1 au fost tratate cu CM sau RCM diluat 1:16 timp de 24 de ore. Celulele Daudi au fost tratate cu 20 ng/mL TPA și 3 mM butirat de sodiu.

Prepararea și cuantificarea ARN-ului VHC

ARN total a fost extras din celulele Huh7 care conțin HCV utilizând reactiv TRIzol (Ambion), urmând protocolul producătorului. Transcripția inversă a fost efectuată folosind un kit de sinteză SensiFAST cDNA (Bioline). Cuantificarea transcriptelor HCV a fost efectuată utilizând SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Applied Biosystems) pe un sistem Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System, folosind condiții standard, cu o temperatură de recoacere de 63°C. Secvențele primerului au fost specifice pentru 5′ UTR HCV; Fwd, 5′-agcgtctagccatggcgt-3′ și Rev, 5′-ggtgtactcaccggttccg-3′, rezultând un amplicon de 95 bp.

Generarea de (virus-)CM

CM și virus-CM (RCM) au fost derivate din celule hepatice mixte sau hepatocite îmbogățite tratate cu reovirus oncolitic, MV-Edm, VV sau HSV-1 la 10 PFU/celulă sau PBS, timp de 72 de ore. Liniile de hepatom, LMC și PBMC au fost tratate cu Reo la 1 PFU/celulă timp de 72 de ore. Supernatanții au fost clarificați la 400 x g timp de 5 minute, apoi au fost filtrati de două ori (2 µm (Corning) urmat de OptiScale 25 Capsule (Millipore) pentru a îndepărta virusul rezidual) și stocați la -80°C.

Blocarea IFN de tip I

Celulele Huh7-JFH1 au fost tratate cu 1,25% (v/v) lanțul receptorului IFN-α/β anti-uman sau 1,25% (v/v) izotip IgG2a, sisteme de cercetare și dezvoltare, iar RCM este amestecat cu 0,75% (v/v) antiuman IFN-a și 0,75% (v/v) IFN-p anti-uman, sisteme de cercetare și dezvoltare sau 1,5% (v/v) control ser de oaie inactivat la căldură, Sigma și incubat separat timp de 1 oră înainte de amestecare. După 4 ore, mediul a fost înlocuit fără tratament. Testele MTT/luciferazei au fost efectuate după încă 20 de ore. LMC-urile au fost tratate cu 1 oră înainte de stimularea Reo și incubate timp de 24 de ore înainte de citometria în flux.

Excluderea Trypan Blue

Hepatocitele primare îmbogățite au fost tratate cu PBS sau 10 PFU/celulă Reo timp de 72 de ore, diluate 1:1 cu 0,4% albastru tripan (Sigma) și viabilitatea a fost determinată din trei replici a 200 de celule numărate.

Citometrie în flux

Citometria în flux a fost efectuată folosind un citometru în flux BD LSRII și datele au fost analizate pe software-ul FACSDiva (BD Biosciences). Toți anticorpii au cuprins IgG1 monoclonal de șoarece conjugat fluorescent.

Celula NK hepatică CD69 : LMC-urile spălate au fost marcate cu anticorpi IgG1 PerCP-CD3 și PE-CD69 (toți BD Biosciences) cu izotiocianat de fluoresceină (FITC)-CD56. Martorii au fost marcați cu izotipul IgG1 conjugat cu PE.

Degranulare CD107 a/b : LMC-urile au fost incubate timp de 24 de ore cu 1 PFU/celulă reovirus sau PBS, spălate de două ori în soluție de sare echilibrată Hanks (HBSS) (Sigma) și coincubate cu celule țintă într-un raport de 5:1 timp de 4 ore . La 1 oră, celulele au fost marcate cu anticorpi FITC-CD107a, FITC-CD107b (BD Biosciences), PE-CD56 (AbD Serotec) și PerCP-CD3 (BD Biosciences), cu soluție de Brefeldin A (Biolegend).

ELISA

IFN-a (Mabtech), IFN-p (Verikine Human IFN Beta ELISA Kit (PBL)), IFN-y (BD Biosciences) și IL-28b/IL-29 (R&D Systems) au fost detectate folosind perechi de anticorpi HBsAg potrivite. Celulele PLC/PRF/5 au fost tratate cu RCM timp de 5 zile cu înlocuire zilnică, urmată de un tratament final de 3 ore evaluat pentru HBsAg folosind kitul Monolisa HBsAg ULTRA (Bio-Rad), conform instrucțiunilor producătorului.

Testul luciferazei

Sistemele de testare Luciferaza Firefly (VHC subgenomic) sau Renilla (VHC infecțios) (Promega) au fost evaluate conform protocoalelor producătorului utilizând un luminometru MITHRAS (Berthold Technologie).

⁵¹ Test de eliberare a cromului

⁵¹ Eliberarea de crom a fost măsurată conform descrierii. 43 Celulele efectoare (LMC sau PBMC) au fost preincubate timp de 24 de ore cu 1 PFU/celulă de reovirus sau PBS și distribuite în trei exemplare la raporturile efector/țintă stabilite.

Experimente in vivo

Șoarecii CB17-Prkdc ^SCID (SCID) au fost furnizați de Serviciul Biomedical St. James (SBS). Șoarecii BALB/c și CB17 (Prkdc ^SCID , Lyst ^bg „SCID/Beige”) au fost achiziționați de la Charles River Laboratories International. Șoarecii SCID și SCID/Beige au fost găzduiți în cuști izolatoare, în timp ce șoarecii BALB/c au fost găzduiți în cuști ventilate individual. S-au confirmat linii celulare lipsite de agenți patogeni murini (Charles River Laboratories). Șoarecii au fost examinați în mod regulat pentru semne de deteriorare a sănătății sau pierdere în greutate.

Liniile celulare au fost recoltate, spălate de două ori în PBS și resuspendate în 100 ui PBS pentru injectare subcutanată. Toate tratamentele au fost în 50 uL de fluid vehicul (PBS pentru Reo/ uv -Reo sau pentru Sorafenib prin gavaj oral în vehicul; PBS, 25% polietilen glicol 400 (Sigma), 5% Tween-20, 5% etanol).

Creșterea tumorii a fost măsurată în două dimensiuni folosind șublere și șoarecii au fost sacrificați în mod obișnuit când s-a atins 15 mm în orice dimensiune. Volumele tumorii au fost calculate conform formulei elipsoidale modificate. 44

Pentru IVIS (Caliper Life Sciences), șoarecii SCID au fost anesteziați prin inhalare de izofluoran 1,5% și injectați intraperitoneal cu 80 uL de 150 mg/mL Firefly D-luciferin sare de potasiu (Caliper Life Sciences) dizolvată în PBS. Activitatea luciferazei a fost măsurată după 10 minute. Datele au fost analizate folosind Living Image Software pentru IVIS (Perkin Elmer) prin cuantificarea luminiscenței totale emise într-o zonă circulară corespunzătoare locului de injectare a tumorii și scăzând emisia de fond.

Statistici

Valorile p au fost calculate prin testul t pereche pe două fețe pentru puncte sau grupuri unice, iar semnificația statistică este notată cu *p<0,05. Celulele sau supernatanții au fost testați în trei exemplare atunci când este posibil și datele reprezintă media și SEM între experimentele repetate sau probe de la diferiți donatori.

Mulțumiri

Recunoaștem sprijinul Consiliului European de Cercetare, Centrului de Medicină Experimentală a Cancerului Leeds și Institutul Național de Cercetare în Sănătate (NIHR) Leeds Clinical Research Facility. KH recunoaște sprijinul din partea Institutului de Cercetare a Cancerului (ICR)/RM NIHR Biomedical Research Facility. De asemenea, suntem recunoscători profesorului Graham Cook (Universitatea din Leeds) și Dr. Andrew Macdonald (Universitatea din Leeds) pentru discuțiile utile. De asemenea, mulțumim lui Teklu Egnuni, Martyna Michniewicz, Jan Bilton și Debra Evans de la serviciile biomedicale St James pentru asistență cu modelele preclinice.

Referințe

↵
1. Boyle P ,
2. Levin B
. Raportul mondial asupra cancerului 2008 . Lyon : Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului , 2008 .Google Academic
↵
1. Franssen B ,
2. Alshebeeb K ,
3. Tabrizian P , şi colab
. Diferențele de rezultate chirurgicale între carcinomul hepatocelular legat de hepatita B și hepatita C: o analiză retrospectivă a unui singur centru nord-american . Ann Surg 2014 ; 260 : 650 – 6 ; discuție 656–8 . doi:10.1097/SLA.0000000000000917Google Academic
↵
1. Utsunomiya T ,
2. Shimada M. _
3. Kudo M , şi colab.
. O comparație a rezultatelor chirurgicale la pacienții cu carcinom hepatocelular HBV-pozitiv, HCV-pozitiv și non-B non-C: un studiu la nivel național pe 11.950 de pacienți . Ann Surg 2015 ; 261 : 513 – 20 . doi:10.1097/SLA.0000000000000821Google Academic
↵
1. Hsu CS ,
2. Chao YC ,
3. Lin HH , şi colab
. Revizuire sistematică: impactul terapiei pe bază de interferon asupra carcinomului hepatocelular legat de VHC . Sci Rep 2015 ; 5 : 9954 . doi:10.1038/srep09954Google Academic
↵
1. Hagan H ,
2. Campbell J ,
3. Thiede H , şi colab
. Starea anticorpilor împotriva virusului hepatitei C auto-raportate și comportamentul de risc la tinerii injectați . Public Health Rep 2016 ; 121 : 710 – 19 .Google Academic
↵
1. Viswanatha DS ,
2. Dogan A
. Virusul hepatitei C și limfomul . J Clin Pathol 2007 ; 60 : 1378 – 83 . doi:10.1136/jcp.2007.051870Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. diavolul A ,
2. Weinmann A ,
3. Centner C , şi colab
. Carcinom hepatocelular la pacienții cu hepatită autoimună . World J Gastroenterol 2009 ; 15 : 578 – 82 .CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Wang AG ,
2. Lee DS ,
3. Moon HB și colab.
. Proteina nestructurală 5A a virusului hepatitei C induce o serie de patologii hepatice la șoarecii transgenici . J Pathol 2009 ; 219 : 253 – 62 . doi:10.1002/path.2592CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Bandiera S. _
2. Pfeffer S ,
3. Baumert TF , şi colab
. miR-122 – un factor cheie și țintă terapeutică în boala hepatică . J Hepatol 2015 ; 62 : 448 – 57 . doi:10.1016/j.jhep.2014.10.004CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Llovet JM ,
2. Ricci S ,
3. Mazzaferro V , şi colab
. Sorafenib în carcinomul hepatocelular avansat . N Engl J Med 2008 ; 359 : 378 – 90 . doi:10.1056/NEJMoa0708857CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Cheng AL ,
2. Kang YK ,
3. Chen Z , şi colab
. Eficacitatea și siguranța sorafenibului la pacienții din regiunea Asia-Pacific cu carcinom hepatocelular avansat: un studiu de fază III randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo . Lancet Oncol 2009 ; 10 : 25 – 34 . doi:10.1016/S1470-2045(08)70285-7CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵FRUMOS . Sorafenib pentru tratamentul carcinomului hepatocelular avansat | Îndrumări și orientări | GROZAV. Publicat online primul: 2010. http://www.nice.org.uk/guidance/TA189 (accesat la 6 iulie 2014 ).Google Academic
↵
1. Lao XM ,
2. Luo G ,
3. Ye LT , și colab.
. Efectele terapiei antivirale asupra reactivării virusului hepatitei B și asupra funcției hepatice după rezecție sau chemoembolizare pentru carcinomul hepatocelular . Liver Int 2013 ; 33 : 595 – 604 . doi:10.1111/liv.12112Google Academic
↵
1. Mahale P_ _
2. Kontoyiannis DP ,
3. Chemaly RF , şi colab
. Acute exacerbation and reactivation of chronic hepatitis C virus infection in cancer patients. J Hepatol 2012;57:1177–85. doi:10.1016/j.jhep.2012.07.031CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
↵
1. Melcher A,
2. Parato K,
3. Rooney CM, et al
. Thunder and lightning: immunotherapy and oncolytic viruses collide. Mol Ther 2011;19:1008–16. doi:10.1038/mt.2011.65CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵
1. Andtbacka RHI,
2. Kaufman HL,
3. Collichio F , şi colab
. Talimogene laherparepvec îmbunătățește rata de răspuns durabil la pacienții cu melanom avansat . J Clin Oncol 2015 ; 33 : 2780 – 8 . doi:10.1200/JCO.2014.58.3377Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Jebar A.H. _
2. Errington-Mais F ,
3. Vile RG , şi colab
. Progrese în terapia clinică pe bază de virus oncolitic pentru carcinomul hepatocelular . J Gen Virol 2015 ; 96 (Pt 7 ): 1533 – 50 . doi:10.1099/vir.0.000098Google Academic
↵
1. Hei J ,
2. Reid T ,
3. Ruo L și colab
. Studiu clinic randomizat de determinare a dozei de vaccinia imunoterapeutică oncolitică JX-594 în cancerul hepatic . Nat Med 2013 ; 19 : 329 – 36 . doi:10.1038/nm.3089CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Air UK ,
2. Roulstone V ,
3. Scott KJ , şi colab
. Transportul celular, livrarea și replicarea selectivă a unui virus oncolitic în tumoare la pacienți . Sci Transl Med 2012 ; 4 : 138ra77 . doi:10.1126/scitranslmed.3003578Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Prestwich RJ ,
2. Ilett EJ ,
3. Errington F , şi colab
. Activitatea antitumorală mediată imun a reovirusului este necesară pentru terapie și este independentă de oncoliza și replicarea virală directă . Clin Cancer Res 2009 ; 15 : 4374 – 81 . doi:10.1158/1078-0432.CCR-09-0334Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Prestwich RJ ,
2. Errington F ,
3. Steele LP , şi colab
. Interacțiunile reciproce dintre celulele dendritice umane și celulele ucigașe naturale induc activitate antitumorală în urma infecției celulelor tumorale cu reovirusul oncolitic . J Immunol 2009 ; 183 : 4312 – 21 . doi:10.4049/jimmunol.0901074Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Zhang J ,
2. Tai LH _
3. Ilkow CS , şi colab
. Virusul Maraba MG1 îmbunătățește funcția celulelor ucigașe naturale prin intermediul celulelor dendritice convenționale pentru a reduce boala metastatică postoperatorie . Mol Ther 2014 ; 22 : 1320 – 32 . doi:10.1038/mt.2014.60CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Alain T_ _
2. Hirasawa K ,
3. Pon KJ , şi colab
. Terapia cu reovirus a tumorilor maligne limfoide . Blood 2002 ; 100 : 4146 – 53 . doi:10.1182/blood-2002-02-0503Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Yamashita Y ,
2. Koike K ,
3. Takaoki M , şi colab
. Suprimarea producției de HBsAg în linia celulară de hepatom uman PLC/PRF/5 de către interferoni . Microbiol Immunol 1988 ; 32 : 1119 – 26 . doi:10.1111/j.1348-0421.1988.tb01476.xPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Tu Z ,
2. Bozorgzadeh A. _
3. Pierce RH , şi colab
. Discuție încrucișată dependentă de TLR între celulele Kupffer umane și celulele NK . J Exp Med 2008 ; 205 : 233 – 44 . doi:10.1084/jem.20072195Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Creme B ,
2. boabe C ,
3. Kebschull M , şi colab.
. Expresia ridicată a natural killer p46 definește un subset de celule natural killer care este potențial implicat în controlul replicării virusului hepatitei C și în modularea fibrozei hepatice . Hepatologie 2012 ; 56 : 1201 – 13 . doi:10.1002/hep.25804CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Wongthida P ,
2. Diaz RM ,
3. Galivo F și colab
. Viroterapia oncolitică VSV în modelul B16 depinde de semnalizarea MyD88 intactă . Mol Ther 2011 ; 19 : 150 – 8 . doi:10.1038/mt.2010.225CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Illett E ,
2. Kottke T ,
3. Donnelly O , şi colab
. Condiționarea cu citokine îmbunătățește livrarea sistemică și terapia unui virus oncolitic . Mol Ther 2014 ; 22 : 1851 – 63 . doi:10.1038/mt.2014.118CrossRefGoogle Academic
↵
1. Loo YM ,
2. Fornek J ,
3. Crochet N , şi colab
. Semnalizarea distinctă RIG-I și MDA5 de către virusurile ARN în imunitatea înnăscută . J Virol 2008 ; 82 : 335 – 45 . doi:10.1128/JVI.01080-07Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Rao Y. _
2. Su J
. Perspective asupra imunității antivirale împotriva reovirusului crapului ierb (Ctenopharyngodon idella) (GCRV) la crapul ierb . J Immunol Res 2015 ; 2015 : 670437 . doi:10.1155/2015/670437CrossRefGoogle Academic
↵
1. Dorner M ,
2. Horwitz JA ,
3. Robbins JB , şi colab.
. Un model de șoarece umanizat genetic pentru infecția cu virusul hepatitei C. Natura 2011 ; 474 : 208 – 11 . doi:10.1038/nature10168CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Mercer DF ,
2. Schiller DE ,
3. Elliott JF , şi colab
. Replicarea virusului hepatitei C la șoareci cu ficat uman himeric . Nat Med 2001 ; 7 : 927 – 33 . doi:10.1038/90968CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Curry MP ,
2. Forns X ,
3. Chung RT , şi colab
. Sofosbuvir și ribavirina previn reapariția infecției cu VHC după transplantul de ficat: un studiu deschis . Gastroenterologie 2015 ; 148 : 100 – 7.e1 . doi:10.1053/j.gastro.2014.09.023CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Meissner EG ,
2. Wu D ,
3. Osinus A , şi colab
. IFN-uri intrahepatice endogene și asocierea cu rezultatul tratamentului VHC fără IFN . J Clin Invest 2014 ; 124 : 3352 – 63 . doi:10.1172/JCI75938CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Reig M ,
2. Marino Z ,
3. Perelló C și colab
. Rată ridicată neașteptată de recidivă tumorală precoce la pacienții cu HCC legat de VHC, supuși terapiei fără interferon . J Hepatol 2016 ; 65 : 719 – 26 . doi:10.1016/j.jhep.2016.04.008Google Academic
↵
1. Conti F ,
2. Buonfiglioli F ,
3. Scuteri A, et al
. Apariția precoce și reapariția carcinomului hepatocelular în ciroza legată de VHC tratată cu antivirale cu acțiune directă . J Hepatol 2016 ; 65 : 727 – 33 . doi:10.1016/j.jhep.2016.06.015CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Smith GL ,
2. CTO Benfield ,
3. Maluquer de Motes C , et al
. Evaziunea imună a virusului Vaccinia: mecanisme, virulență și imunogenitate . J Gen Virol 2013 ; 94 : 2367 – 92 . doi:10.1099/vir.0.055921-0CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic
↵
1. Liu TC ,
2. Hwang T ,
3. Park BH , și colab
. Poxvirusul oncolitic țintit JX-594 demonstrează activități antitumorale, antivasculare și anti-HBV la pacienții cu carcinom hepatocelular . Mol Ther 2008 ; 16 : 1637 – 42 . doi:10.1038/mt.2008.143CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. om de afaceri DE ,
2. Walker BD
. Căile de cosemnalizare inhibitoare PD-1 și CTLA-4 în infecția cu HIV și potențialul de intervenție terapeutică . J Immunol 2009 ; 182 : 5891 – 7 . doi:10.4049/jimmunol.0803771Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵
1. Nuovo GJ,
2. Garofalo M,
3. Valeri N, et al
. Reovirus-associated reduction of microRNA-let-7d is related to the increased apoptotic death of cancer cells in clinical samples. Mod Pathol 2012;25:1333–44. doi:10.1038/modpathol.2012.95CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵
1. Hughes T,
2. Becknell B,
3. McClory S, et al
. Celulele ucigașe naturale umane imature din stadiul 3 găsite în țesutul limfoid secundar exprimă constitutiv și selectiv citokina TH17 interleukina-22 . Sânge 2009 ; 113 : 4008 – 10 . doi:10.1182/blood-2008-12-192443Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Macdonald A ,
2. Crowder K ,
3. Strada A , și colab
. Proteina nestructurală NS5A a virusului hepatitei C inhibă activarea funcției proteinei-1 prin perturbarea semnalizării căii ras-ERK . J Biol Chem 2003 ; 278 : 17775 – 84 . doi:10.1074/jbc.M210900200Rezumat / Text complet GRATUITGoogle Academic
↵
1. Errington F ,
2. Jones , J.
3. Merrick A , şi colab
. Fuziunea celulelor tumorale mediată de glicoproteină membranară fuzogenă activează celulele dendritice umane pentru producția îmbunătățită de IL-12 și amorsarea celulelor T. Gene Ther 2006 ; 13 : 138 – 49 . doi:10.1038/sj.gt.3302609CrossRefPubMedGoogle Academic
↵
1. Tomayko MM ,
2. Reynolds CP
. Determinarea dimensiunii tumorii subcutanate la șoarecii atimici (nuzi) . Cancer Chemother Pharmacol 1989 ; 24 : 148 – 54 . doi:10.1007/BF00300234CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Academic

Note de subsol

AM și SG au contribuit în mod egal.
Contributori Experimente concepute și planificate: SG, AM, FE-M și AS; experimente efectuate: AS, MJB, KS, GN, AB, EA, RAA, RD și AP-C; au furnizat reactivi cheie: GT, SN și MC; manuscris revizuit: RV, KH, PS și FE-M; a scris manuscrisul: SG, AM și AS.
Finanțarea AS a fost beneficiarul unei burse clinice Cancer Research UK acordată de Cancer Research UK Leeds Center către SG/AM.
Interese concurente MC este angajat al Oncolytics Biotech, Calgary, Canada. SG și AM au primit granturi de cercetare de la Oncolytics.
Aprobare etică Comitetul de etică din North East Leeds, Spitalul Universitar St. James, Leeds, Marea Britanie. Modelele animale in vivo au fost aprobate de comitetul local de evaluare etică al Universității din Leeds.
Proveniență și evaluare inter pares Nu este comisionat; revizuit extern.