Selectivitatea tumorală a parvovirusurilor oncolitice: de la modele in vitro și animale la pacienții cu cancer

Assia L. Angelova¹ , Karsten Geletneky^1,2 , Jürg PF Nüesch¹ și Jean Rommelaere¹ *

¹ Programul de infecții și cancer, Divizia de Virologie Tumorală, Centrul German de Cercetare a Cancerului (DKFZ), Heidelberg, Germania
² Departamentul de Neurochirurgie, Universitatea din Heidelberg, Heidelberg, Germania

Viroterapia oncoliticăde cancer se numără printre modalitățile inovatoare aflate în curs de dezvoltare și mai ales promițătoare pentru țintirea tumorilor, care sunt rezistente la tratamentele convenționale. În prezent, cel puțin o duzină de viruși, aparținând la nouă familii diferite de virusuri, sunt testați în cadrul diferitelor studii clinice la pacienții cu cancer. Dovezile preclinice în continuă creștere care arată că parvovirusul autonom de șobolan H-1 (H-1PV) este capabil să omoare celulele tumorale care rezistă tratamentelor convenționale și să obțină o vindecare completă a diferitelor tumori umane pe modele animale, argumentează pentru includerea sa în arsenalul de oncolitice. viruși cu un potențial deosebit de promițător de traducere de la preclinic la clinic. Administrarea sigură a parvovirusului oncolitic la om se bazează pe preferința intrinsecă a acestor agenți pentru proliferarea rapidă, metabolică,selectivitate tumorală sau oncotropism ). Prezenta revizuire rezumă și discută (i) dovezile preclinice ale inocuității H-1PV pentru celulele normale și țesuturile sănătoase in vitro și, respectiv, la animale, (ii) evaluările toxicologice ale terapiei mono- sau combinate cu H-1PV în virusul purtător de tumori- modele animale permisive, precum și (iii) rezultate istorice ale infecției experimentale a pacienților cu cancer uman cu H-1PV. În total, aceste date pledează împotriva riscului ca H-1PV să inducă efecte toxice semnificative la pacienții umani. Acest profil de siguranță extrem de favorabil a permis traducerea cercetării preclinice H-1PV într-un studiu clinic de fază I/IIa aflat în curs de desfășurare.

Conceptul de viroterapie oncolitică pentru tratamentul cancerului

Viroterapia oncolitică este una dintre modalitățile inovatoare în curs de dezvoltare pentru a viza tumorile care sunt refractare la tratamentele chirurgicale convenționale și radio/chimioterapice. În timp ce posibilitatea utilizării unor viruși pentru a lupta împotriva cancerului a fost propusă la începutul secolului al XX-lea, domeniul a cunoscut o revigorare izbitoare în ultimele trei decenii, odată cu dezvoltarea virologiei moleculare și a ingineriei genetice. Termenul „viruși oncolitici” (OV) desemnează virușii vii nepatogeni care pot infecta și ucide celulele maligne fără a provoca daune țesuturilor normale. Din cauza constrângerilor de spațiu, conceptul de viroterapie oncolitică va fi subliniat pe scurt mai jos, iar citările vor fi limitate la unele articole de recenzie recente ( Liu și colab., 2007 ; Haseley și colab., 2009).; Meerani și Yao, 2010 ; Wong și colab., 2010 ; Friedman și colab., 2012 ; Russel și colab., 2012 ; Singh și colab., 2012 ; Ahmed, 2013 ; Bartlett și colab., 2013 ; Goldufsky și colab., 2013 ; Vacchelli şi colab., 2013 ; Lichty et al., 2014 ; Vähä-Koskela și Hinkkanen, 2014 ; Woller et al., 2014 ), la care cititorii sunt consultați pentru mai multe detalii.

Viroterapia cancerului se bazează pe patru proprietăți principale ale OV, așa cum este prezentat în Figura 1 .

(i) Oncoselectivitatea este o condiție sine qua non- evidentă pentru viroterapie oncolitică. Selectivitatea infecției cu OV și a replicării celulelor tumorale este o caracteristică inerentă a anumitor specii de virus sau un rezultat al adaptării virusului sau al ingineriei genetice țintite. Acest oncotropism reflectă dependența etapelor distincte ale ciclului de viață OV de modificările moleculare (epi)genetice specifice tumorii. Rezultă în special din faptul că, pe de o parte, majoritatea tumorilor au dezvoltat mecanisme de suprimare a răspunsurilor utilizate de celulele normale pentru a limita infecția cu virus și, pe de altă parte, căile de semnalizare care promovează creșterea celulelor tumorale favorizează și replicarea virusului.

(ii) Oncoliza poate fi indusă într-un mod direct de către OV ca rezultat al replicării virusului și/sau al exprimării produselor genice citotoxice virale în celulele tumorale infectate. Un atu major al OV constă în modul lor multimecanistic de ucidere a celulelor maligne, care diferă de procesele de moarte celulară declanșate de agenții convenționali anti-cancer. Această particularitate poate fi raționalizată de nevoia virusului de a preveni interferarea efectelor citopatice premature (CPE) cu producerea virusului și este exploatată terapeutic pentru a depăși rezistența dezvoltată de multe celule tumorale la terapiile convenționale.

(iii) Efecte oncolitice indirecte ale observatorilor contribuie, de asemenea, într-o măsură semnificativă la activitatea oncosupresivă a OV, care poate media în acest fel uciderea celulelor canceroase neinfectate. Aceste efecte oncolitice indirecte induse de OV pot rezulta din perturbarea vasculaturii tumorale și angiogeneză, eliberarea de citokine toxice din celulele imune infectate rezidente tumorale sau infiltrate și chiar mai important, din răspunsurile imune sistemice antitumorale. Într-adevăr, moartea celulelor tumorale cauzată de OV este adesea imunogenă, ceea ce duce la activarea celulelor imune înnăscute și la prezentarea eficientă a antigenelor asociate tumorii care provoacă imunitate adaptivă antitumorală. Viroterapia oncolitică poate fi considerată fie din punct de vedere virocentric, fie din punct de vedere imunocentric, în funcţie de faptul dacă se pune accent pe oncoliza directă indusă de virus sau pe stimularea mediată de virus a răspunsurilor imune antitumorale. La modelele animale, ambele mecanisme par să acționeze în combinație, având în același timp greutăți relative diferite în funcție de tumora țintă individuală.

(iv) OV-urile competente pentru replicare sunt utilizate în speranța de a obține amplificarea intratumorală a inoculului inițial și producerea de virioni descendenți, care se pot răspândi la celulele tumorale neinfectate, inclusiv metastazele la distanță, până când întregul țesut tumoral este afectat. În timp ce această multiplicare a fost observată în unele modele de tumori animale, răspândirea extinsă a OV la locurile de creștere a tumorii rămâne să fie documentată în mediile clinice.Figura 1

FIGURA 1. EFECTELE ANTITUMORALE DIRECTE ȘI INDIRECTE ALE VIRUSURILOR ONCOLITICE (OV). Celulele normale rezistă infecției cu OV din cauza blocării ciclului de viață viral înainte de inducerea efectelor citopatice. În schimb, OV-urile pot perturba cel puțin trei tipuri de celule în cadrul tumorii. Celulele canceroase infectate suferă un tip de moarte imunogenă (oncoliză directă), care este uneori (de exemplu, figura), dar nu întotdeauna însoțită de producția de virus; această oncoliză duce la activarea diferitelor celule imunitare (verzi), indiferent de infecția lor directă cu virusul, generând astfel răspunsurile imune anti-cancer. În plus, infecția cu OV (avortivă) a celulelor imune și endoteliale din interiorul tumorii are ca rezultat producerea de citokine citotoxice și, respectiv, efecte anti-vasculare/angiogenice, care ambele contribuie la oncoliza mediată de virus într-un mod indirect. Celulele tumorale neinfectate pot servi și ca ținte pentru aceste efecte oncolitice indirecte.

Potențialul abordării viroterapeutice oncolitice este susținut de dovezi substanțiale ale efectelor oncosupresive induse de OV atât la nivel preclinic, cât și la nivel clinic. Peste o mie de pacienți au fost tratați acum cu OV prin injecție intratumorală și/sau perfuzie intravenoasă în timpul studiilor clinice de fază I-III. Dovezi convingătoare ale imunității anti-cancer induse de OV au fost obținute pentru un virus herpes simplex oncolitic recombinant, arătând că administrarea sa intratumorală la pacienții cu melanom malign metastatic a condus la regresia completă a tumorilor injectate și neinjectate la 8/50 de pacienți tratați (Kaufman et . al., 2010 ). De asemenea, s-a demonstrat că un virus oncolitic vaccinia poate ajunge la locurile tumorale prin extravazarea din vasele de sânge tumorale ( Breitbach et al., 2013).), acordând credit utilizării administrării sistemice de OV pentru țintirea metastazelor. Într-adevăr, într-un studiu clinic anterior, autorii au arătat că un poxvirus oncolitic derivat din vaccinul vaccinului, utilizat ca vehicul pentru livrarea și exprimarea transgenelor, realizează replicarea selectivă a cancerului după perfuzia intravenoasă la pacienții cu tumori solide avansate, refractare la tratament ( Breitbach și colab., 2011 ). Răspândirea OV la locurile tumorii după administrare sistemică a fost demonstrată clinic cu încă un virus. Un reovirus oncolitic a fost perfuzat intravenos înainte de intervenția chirurgicală pentru a rezeca metastazele hepatice ale cancerului colorectal. S-au realizat transportul și livrarea celulelor imune ale reovirusului, precum și recuperarea virusului replicat din tumoră, confirmând țintirea reovirusului intravenos a carcinomului de colon metastatic (Adair și colab., 2012 ). OV, care sunt cele mai avansate în dezvoltarea clinică, includ herpes simplex oncolitic, vaccinia, reo- și adenovirusurile, acestea din urmă fiind autorizate în China pentru utilizare împotriva cancerului de cap și gât ( Garber, 2006 ). Ritmul activităților clinice în domeniu s-a accelerat considerabil, iar OV-urile aparținând nu mai puțin de nouă familii diferite de virusuri fac în prezent obiectul diferitelor studii clinice la pacienții cu cancer.

Aceste studii clinice au confirmat că OV, așa cum era de așteptat din oncoselectivitatea lor, pot fi administrate în siguranță la oameni. Într-adevăr, tolerabilitatea clinică a OV a fost în general excelentă, iar toxicitățile limitatoare ale dozei au fost observate doar rar. Interesant este că cele mai frecvente efecte adverse – simptome asemănătoare gripei tranzitorii – nu se suprapun cu cele cauzate de alți agenți anticancerigen, susținând posibilitatea combinării viroterapiei oncolitice cu modalitățile terapeutice actuale. Deoarece studiile viitoare vor utiliza probabil doze mai mari de OV, nu este garantat că viroterapie eficientă va fi întotdeauna lipsită de toxicitate. Cu toate acestea, această îngrijorare trebuie să fie echilibrată cu riscul terapiilor curente, care se apropie de limita superioară a tolerabilității. Un risc de siguranță specific OV se referă la răspândirea virală de la pacientul tratat la contacte. In orice caz,Makower şi colab., 2003 ; Pecora și Lorence, 2007 ; Hughes et al., 2014 ).

Printre OV, parvovirusul autonom H-1 de șobolan, subiectul acestei revizuiri, merită o considerație specială ca agent anti-cancer candidat. Dovezile preclinice în continuă creștere demonstrează capacitatea acestui virus de a ucide celulele tumorale care rezistă tratamentelor convenționale anti-cancer și de a obține o vindecare completă a diferitelor tumori pe modele animale, ceea ce este important, fiind în același timp inofensiv pentru celulele netransformate și țesuturile normale (Rommelaere et . al., 2010 ). În prezent, parvovirusul H-1 se află într-un studiu clinic de fază I/IIa conceput pentru a documenta doza maximă tolerată și profilul de siguranță la pacienții cu glioblastom multiform recurent.

Parvovirusul oncolitic H-1

Parvovirusul oncolitic H-1 (H-1PV) aparține familiei Parvoviridae , subfamiliei Parvovirinae , genului Protoparvovirus și speciei Rodent protoparvovirus 1 (Figura 2 ). Ca toate parvovirusurile, H-1PV este un virus mic (25 nm în diametru) neînvelit caracterizat printr-o capsidă icosaedrică și un genom liniar ADN monocatenar de aproximativ 5.000 de nucleotide (Tattersall, 2006 ) . ADN-ul genomic viral cuprinde două unități de transcripție care sunt controlate de promotorii P4 și P38 și codifică proteinele virale nestructurale (NS) și structurale (VP), respectiv (Cotmore și Tattersall, 2014 ; Cotmore și colab., 2014).). Proteina NS NS1 joacă un rol major în ciclul de viață viral, fiind esențială pentru replicarea ADN-ului viral, expresia genelor și efectele citotoxice induse de virus (Nüesch, 2006; Hristov și colab., 2010; Nüesch și colab . , 2012 ) . Li și colab., 2013 ). H-1PV se replică autonom în celulele țintă, în strânsă dependență de proliferarea celulară și factorii de diferențiere ( Cornelis și colab., 2006 ). Gazda naturală a H-1PV este șobolanul, infecția căruia poate fi fie patogenă și chiar letală (la fetușii și nou-născuții neprotejați imunologic) sau inaparentă clinic (la animalele adulte). După cum se documentează mai jos, sub in vitroîn condiții, virusul se replică de preferință în și ucide culturi de celule umane și de șobolan transformate sau derivate din tumori, fără a induce citotoxicitate în omologii lor corespunzători netransformați/nemaligni (Rommelaere și colab., 2005 , 2010 ) . Mai mult decât atât, observațiile de mai sus care ilustrează oncoselectivitatea parvovirusului H-1 au fost extinse în continuare la modelele animale, în care s-a raportat că H-1PV suprimă eficient formarea tumorii și provoacă o regresie izbitoare a tumorilor stabilite ( oncosupresie , vezi mai jos) ( Rommelaere și Cornelis ). , 1991 ).Figura 2

FIGURA 2. CARACTERISTICILE PARVOVIRUSULUI H-1 . (A) MODEL in silico al suprafeței capsidei H-1PV care arată cele două, trei și cinci axe de simetrie ( Allaume et al., 2012 ). (B) Harta simplificată a expresiei genelor virale. Genomul ADN viral monocatenar (ss) se termină în secvențe palindromice unice (Pal), care servesc ca origini auto-amorsante ale replicării pentru sinteza formelor de replicare dublu catenară/șabloane de transcripție. Transcripția este controlată de promotorii P4 și P38 care sunt indicați prin săgeți și expresia directă a proteinelor nestructurale (NS) și respectiv a capsidei (VP). (C)Schema simplificată a ciclului de viață viral care descrie pașii principali care conduc la producerea virusului și inducerea efectelor citopatice (CPE). Pașii stimulați de transformare oncogenă cunoscuți și presupusi sunt indicați prin cercuri roșii întregi și, respectiv, întrerupte.

Mecanisme de oncoselectivitate a protoparvovirusului rozătoarelor

Oncoselectivitatea intrinsecă a parvovirusului este un fenomen complex bazat parțial pe mai mulți determinanți specifici celulei tumorale, care sunt subreprezentați în celulele nemaligne. Disponibilitatea factorilor de replicare și transcripție celulară, supraexprimarea proteinelor celulare cunoscute că interacționează cu cele parvovirale (în special cu NS1), activarea căilor metabolice implicate în reglarea funcțională a NS1, toate contribuie la preferința parvovirusului pentru tumoră, si nu pentru celulele normale. Căile moleculare implicate în țintirea celulelor tumorale H-1PV sunt trecute în revistă într-o publicație recentă a laboratorului nostru ( Nüesch et al., 2012 ), în timp ce cele mai importante in vitroși studiile pe animale care oferă dovezi ale oncoselectivității și inofensiunii parvovirusului într-un mediu non-malign sunt rezumate în prezenta revizuire (vezi secțiunile următoare). Deși este fezabilă atenuarea PV prin inginerie genetică ( Daeffler și colab., 2003 ), utilizarea acestor viruși ca agenți anti-cancer nu se bazează pe această strategie, deoarece inocuitatea PV de tip sălbatic pentru țesuturile normale evită necesitatea de a atenuează toxicitatea nedorită.

Din cunoștințele noastre, nu există dovezi care să indice că preferința PV pentru infectarea celulelor tumorale rezultă dintr-o competență mai mare a acestor celule pentru legarea și internalizarea virusului. În schimb, celulele neoplazice par să ofere un mediu intracelular care este deosebit de permisiv pentru cel puțin o parte sau întregul curs al ciclului de viață PV. Această permisivitate mai mare a celulelor tumorale nu poate fi urmărită la un singur factor, ci mai degrabă implică mai mulți factori celulari care controlează diferiți pași ai ciclului de viață PV și fiecare dă infecție un impuls distinct (Figura 2) .). Astfel, acești factori sunt probabil să coopereze în promovarea infecției cu virus, impactul factorilor care acționează mai târziu depinzând de finalizarea etapelor anterioare din ciclul viral. Un număr de celule tumorale furnizează toți factorii necesari pentru replicarea completă a virusului, rezultând în producția de particule descendente și liza celulară. Alte celule tumorale sunt semi-permisive (și sunt ucise în absența eliberării de virioni descendenți), iar câteva rămân rezistente la infecție. De asemenea, trebuie precizat că omul nu este gazda naturală a rozătoarelor PV, iar celulele umane normale pot prezenta restricții diferite și/sau suplimentare pentru infecția cu PV, în comparație cu celulele rozătoarelor.Lachmann şi colab., 2008 ; Bär et al., 2015 ). În consecință, activarea constitutivă a acestei cascade printr-un mecanism neconvențional în celulele tumorale umane reprezintă un determinant specific uman al oncoselectivității PV.

Majoritatea determinanților celulari ai oncoselectivității PV, așa cum au fost identificați până acum, controlează ciclul de viață viral într-un mod pozitiv (Figura 3 ).

• Unii dintre acești factori nu sunt strict specifici tumorii, ci caracteristici celulelor în proliferare. Exemple ale acestora sunt ciclina A/CDK2 ( Bashir și colab., 2000 ; Adeyemi și Pintel, 2012 ) și E2F ₍ Deleu și colab., 1999).), care sunt markeri celulari de fază S și controlează conversia genomului ADN monocatenar PV în forme replicative dublu catenar/șabloane de transcripție și, respectiv, activarea promotorului precoce PV P4. Ambii factori sunt astfel esențiali pentru debutul replicării PV, contribuind la dependența de faza S a acestor viruși. Deși o parte din celulele tumorale poate fi latente și unele țesuturi normale se auto-reînnoiesc rapid, componenta proliferativă a multor tumori le diferențiază de țesuturile normale din jur, în mod esențial repaus, oferind o țintă pentru infecția PV și contribuind astfel la îmbunătățirea replicării virusului și CPE în țesuturile neoplazice versus normale.

• Alți determinanți ai oncoselectivității PV sunt mai specifici pentru celulele transformate malign în care sunt supraexprimați sau activați ca urmare a modificărilor (epi)genetice care apar în aceste celule. S-a demonstrat că câțiva factori de acest tip promovează pași distincti ai ciclului de viață PV. Acești pași includ:

(i) intrare virală : ruperea anvelopei nucleare dependentă de PKCα și CDK1 ( Porwal și colab., 2013 ).

(ii) expresia genei virale : activarea promotorului PV timpuriu P4 de către Ets și factorii de transcripție ATF ( Perros și colab., 1995 ; Fuks și colab., 1996 ).

(iii) amplificarea ADN viral : activarea proteinei replicative PV NS1 prin fosforilarea mediată de PDK1, PKC și radixină (Rdx) ( Dettwiler și colab., 1999 ; Lachmann și colab., 2003 , 2008 ; Nüesch și colab., 2009). Bär et al., 2015 ); iniţierea dependentă de HMGB1 a amplificării ADN-ului de la originea virală din dreapta ( Cotmore şi Tattersall, 1998 ; Cotmore şi colab., 2000 ); facilitarea replicării virale printr-un răspuns la deteriorarea ADN-ului mediat de kinaza ATM ( Adeyemi și colab., 2010 ).

(iv) ansamblu de capside de descendență virală : transport nuclear dependent de fosforilare Raf-1 al intermediarilor de capside ( Riolobos și colab., 2010 ).

(v) maturarea virionilor : ieșire dependentă de XPO1, PKB, PKC și Rdx ( Eichwald și colab., 2002 ; Nüesch și colab., 2009 ; Bär și colab., 2013 , 2015 ).

(vi) efecte citopatice : expresia țintelor potențiale PV, inclusiv izoforme distincte de tropomiozină (TPM) ( Nüesch și Rommelaere, 2007 ) sau factori de control, de exemplu, ciclina B1 ( Adeyemi și Pintel, 2014 ); producerea de efectori citotoxici, cum ar fi catepsina B (CTSB) ( Di Piazza și colab., 2007 ) și CKII ( Nüesch și Rommelaere, 2006 ); Activarea dependentă de PDK1 și PKCι a funcției citotoxice NS1 ( Nüesch și Rommelaere, 2006 ; Bär și colab., 2015 ).Figura 3

FIGURA 3. DETERMINANȚII CELULARI PRESUPUTIVI AI ONCOSELECTIVITĂȚII PV. Pașii indicați ai ciclului de viață PV (dreptunghiuri) s-au dovedit a fi controlați de factori celulari (cercuri) cunoscuți a fi reglați la amplificarea genelor, expresia și nivelurile funcționale prin proliferarea celulară (albastru) și transformarea oncogenă (roșu). Lista factorilor nu este exhaustivă și exemplifică mediatorii candidați ai permisivității sporite a celulelor neoplazice pentru infecția cu PV. Dovezile privind contribuția acestor factori la oncotropismul PV sunt experimentale pentru câțiva dintre ei (PDK1, PKCη, Ets, ATF, Raf-1), dar circumstanțiale pentru ceilalți. Pentru mai multe detalii, vezi textul principal (pag. 4–5). CDK2, kinaza 2 dependentă de ciclină; PDK1, kinaza 1 dependentă de fosfoinozitide; PKC, protein kinaza C; Rdx, radixină; HMGB1, proteina 1 a grupului cu mobilitate ridicată; ATM, proteină mutantă de ataxie-telangiectazie; Raf-1, proteina fibrosarcom-1 accelerată rapid; XPO1, exportin-1; PKB, protein kinaza B; E2F, factor de transcripție E2F; Ets, factor de transcripție specific transformării E26; ATF, factor de transcripție activator; CKII, cazein kinaza II; TPM, tropomiozină; CTSB, catepsina B.

Rolul jucat de unii dintre acești factori în oncotropismul PV a fost susținut de faptul că funcția lor de ajutor a fost stimulată în celulele transformate, salvând cel puțin într-o oarecare măsură defectul ciclului de viață viral din celulele normale.

Oncoselectivitatea unui număr de OV poate fi urmărită și din deficiența frecventă, în celulele tumorale, a mecanismelor care permit celulelor normale să contracareze infecția cu virus, în special, interferonul de tip I și răspunsurile la stres. De-a lungul acestei linii, s-a demonstrat că Protoparvovirusul MVM de șoarece induce răspunsul la interferon de tip I și este sensibil la acesta în celulele normale de șoarece, în timp ce un mecanism de evaziune încă evaziv părea să fie declanșat de virus în omologii lor transformați, împiedicând interferonii să fie produs ( Grekova et al., 2010a , b). Rezultă că în acest sistem, oncoselectivitatea PV a constat într-o componentă suplimentară, și anume, absența modulatorilor negativi ai infecției PV în celulele transformate. Nu este clar dacă aceste date pot fi extrapolate la celulele neoplazice umane față de cele normale. S-a raportat recent că diferite celule tumorale umane nu reușesc să dezvolte un răspuns cu interferon de tip I la infecția cu PV (inclusiv H-1PV). Cu toate acestea, acest eșec a fost observat și în celulele umane normale ( Paglino și colab., 2014), punând la îndoială dacă răspunsul interferonului joacă vreun rol în oncoselectivitatea protoparvovirusurilor rozătoarelor din celulele umane. Ar trebui reamintit din nou în această privință că omul nu este gazda naturală a protoparvovirusurilor rozătoarelor și, prin urmare, unii dintre factorii care limitează ciclul de viață viral pot diferi între celulele din gazde naturale și heterologe.

Dovezi in vitro a oncoselectivității H-1PV

Observațiile de pionierat care demonstrează că H-1PV nu reușește să inducă CPE în culturi umane normale (de exemplu, rinichi embrionari și amnios) au fost publicate de Toolan și Ledinko (1965) . Inocuitatea H-1PV pentru celulele non-maligne a fost confirmată ulterior într-un număr de studii in vitro , așa cum este rezumat în Tabelul 1 .Tabelul 1

TABELUL 1 . DOVEZI IN VITRO ALE ONCOSELECTIVITĂȚII H-1PV .

De exemplu, infecția cu H-1PV a fost comparată cantitativ într-o serie de culturi nepermanente de fibroblaste (ante)de piele umane normale și omologii lor respectivi transformați cu SV40. Deși virusul a fost adsorbit și preluat atât de celulele normale, cât și de cele transformate, numai în acestea din urmă, H-1PV a fost capabil să inducă uciderea și degenerarea progresivă a culturii. În plus, a fost găsită o diferență izbitoare în capacitatea fibroblastelor normale față de cele transformate de a susține ADN-ul viral și sinteza proteinelor. Doar transformanții SV40, dar nu și omologii lor netransformați, ar putea oferi mediul intracelular necesar pentru a sprijini finalizarea ciclului litic H-1PV și eliberarea virionilor descendenți infecțioși (Chen și colab., 1986; Faisst și colab . , 1989). Observații similare au fost făcute atunci când au fost utilizate linii de celule de keratinocite stabilite derivate din carcinomul cu celule scuamoase umane. Uciderea eficientă indusă de virus și infecția productivă au fost observate în keratinocitele derivate din carcinomul cu celule scuamoase ale limbii umane, obrajilor, supraglotei și feței. În contrast, celulele epidermice umane normale izolate din sânul adult sănătos și utilizate după o trecere in vitro (culturi cu număr redus de treceri) au fost rezistente la infecția cu H-1PV ( Chen și colab., 1989 ; Faisst și colab., 1989 ). Într-un alt studiu, s-au stabilit linii sau culturi in vitro cu număr redus de treceri derivate fie din specimene de tumoră mamară umană, fie din țesut mamar peritumoral normal.de la același pacient au fost utilizate pentru a evidenția oncoselectivitatea H-1PV. Efectele citotoxice izbitoare induse de virusul oncolitic observate în culturile derivate din tumori au fost absente în respectivele controale normale derivate din ţesut ( Dupressoir şi colab., 1989 ; Van Pachterbeke şi colab., 1993 , 1997 ). În plus, în celulele derivate din carcinomul mamar invaziv, spre deosebire de epiteliul normal de sân, a fost documentat un model distinct de fosforilare a proteinei citotoxice virale majore NS1 ( Muharram et al., 2010 ). De asemenea, a fost raportată uciderea selectivă indusă de H-1PV a celulelor de carcinom hepatic uman față de hepatocite normale. Culturi cu număr de trecere scăzut stabilite din țesut hepatic sănătosnu a reușit să susțină expresia NS1 și, prin urmare, au fost refractare la infecția litică ( Moehler și colab., 2001 ). În scopul pregătirii unei platforme preclinice pentru aplicarea clinică a H-1PV la pacienții cu tumori cerebrale și la pacienții cu alte tumori originare din sistemul nervos, toxicitatea virusului a fost evaluată în astrocitele umane primare normale , celulele gliale și neuronii corticali.de asemenea. Datele au arătat că morfologia, activitatea metabolică și integritatea membranei celulelor de mai sus au rămas nemodificate chiar și după infecția cu H-1PV în doză mare. În timp ce în celulele de neuroblastom maligne, s-a observat o expresie abundentă a NS1 și sa constatat că are ca rezultat stoparea celulară a G2, nu au putut fi detectate niveluri scăzute de NS1 în astrocite normale și culturi gliale mixte. Într-adevăr, deși acesta din urmă ar putea crește un virus recombinant care transduce EGFP, eficiența transducției a fost de peste 10 ori mai mică decât în linia celulară de neuroblastom raportată a fi cea mai puțin sensibilă la citotoxicitatea indusă de H-1PV (Lacroix și colab., 2010) . , 2014 ). În acord cu aceste date, inocuitatea virusului pentru astrocitele adulte umane normalea fost de asemenea descris. S-a demonstrat că, în timp ce declanșează permeabilizarea membranei lizozomale și moartea mediată de catepsină în celulele derivate din gliom uman, H-1PV a fost netoxic pentru culturile normale de astrocite ( Di Piazza și colab., 2007 ). Datele experimentale care ilustrează absența toxicității induse de H-1PV în celulele normale au provenit și din studii care au folosit modele preclinice de limfom non-Hodgkin. Spre deosebire de celulele derivate din limfomul Burkitt, care erau foarte susceptibile la distrugerea indusă de H-1PV și susțineau niveluri ridicate de producție de virioni descendenți, limfocitele B nemaligne, inclusiv celulele B cu memorie normale, s-a dovedit a rezista infecției, toxicitatea minoră fiind observată numai atunci când culturile au fost infectate cu doze mari de H-1PV. Deoarece limfocitele B normale nu au putut să exprime EGFP după transducția cu un virus recombinant care transduce EGFP, acest efect toxic minim nu a avut legătură cu expresia genei virale ( Angelova și colab., 2009a ). Rezistența normală a celulelor imune umane la infecția cu PV a fost raportată și de alți autori. S-a demonstrat că celulele și monocitele dendritice imature sau mature își păstrează viabilitatea după provocarea cu H-1PV ( Moehler și colab., 2003 ), în timp ce, în contrast, linia celulară de monocite U937 derivată din limfomul histiocitar uman este printre cele in vitro .sistemele fiind cele mai sensibile la efectele litice H-1PV ( Rayet et al., 1998 ). Dovezile inofensivității PV pentru celulele mononucleare normale din sângele periferic sunt de o importanță deosebită având în vedere aplicațiile clinice actuale și viitoare ale H-1PV. S-a demonstrat că, deși nivelurile bazale ale formelor replicative ADN virale au fost detectate în ultimele celule, nu a putut fi observată nicio infecție productivă, chiar și după stimularea mitogenului ( Grekova și colab., 2010a , b ). Rezultate similare au fost raportate de Moralès et al. (2012) și Raykov și colab. (2013) .

Dovezi in vivo a oncoselectivității H-1PV

După ce experimentele in vitro folosind diferite culturi primare și cu număr de trecere scăzut au demonstrat că infecția cu H-1PV a celulelor umane normale este abortivă, nu duce la moartea celulelor și nu induce CPE sau nu induce CPE minor (vezi mai sus), diferite modele de tumori animale au fost explorat apoi în laboratorul nostru pentru a testa oncoselectivitatea PV sub in vivoconditii. Cele mai extinse studii pe animale au fost efectuate folosind două modele tumorale, și anume gliom și adenocarcinom ductal pancreatic (PDAC), care se disting printr-un prognostic sumbru și reprezintă ținte potențiale pentru aplicațiile clinice de viroterapie oncolitică bazată pe H-1PV. Șobolanii, adică gazda permisivă naturală a virusului, au fost grefați cu tumorile respective și s-a efectuat o urmărire pe termen lung a animalelor după tratamentul cu H-1PV, pentru a evalua capacitatea de suprimare a tumorii a virusului. și pentru a dezvălui orice semne de toxicitate indusă de virus și/sau alte efecte adverse.

Gliom

Doar aproximativ 50% dintre pacienții cu tumori cerebrale maligne de origine glială supraviețuiesc la 1 an de la diagnosticul inițial. În plus, opțiunile de tratament standard duc doar la îmbunătățiri modeste ale rezultatului gliomului ( Stummer și colab., 2006 ). H-1PV oncolitic, a cărui capacitate de a ucide selectiv celulele derivate din gliom printr-un mecanism mediat de catepsină a fost demonstrată in vitro ( Di Piazza et al., 2007).), se crede că reprezintă o alternativă terapeutică promițătoare. În acest sens, dovezile experimentale obținute în laboratorul nostru care arată că injecția intracerebrală sau sistemică de H-1PV duce la regresia gliomului la șobolanii imunocompetenți purtători de tumori autologe RG-2 ortotopice și la animalele imunodeficiente implantate cu glioame U87 umane fără a provoca efecte secundare toxice, este de importanță preclinică majoră ( Di Piazza și colab., 2007 ; Geletneky și colab., 2010 ; Kiprianova și colab., 2011)). Aceste efecte nu au putut fi atinse numai prin terapia intratumorală locală directă, ci și după inoculare intravenoasă și chiar intranazală a virusului, deși pentru aplicare sistemică a trebuit să se utilizeze doze semnificativ mai mari de virus. Efectul injecției intracerebrale de H-1PV aplicată la șobolani sănătoși sau purtători de gliom asupra activității CTSB a fost investigat de Di Piazza și colab. (2007) . În creierul sănătos, activitatea CTSB s-a dovedit a fi foarte scăzută și nu este afectată semnificativ de tratamentul cu H-1PV. În schimb, în glioamele tratate cu H-1PV a fost detectată o îmbunătățire izbitoare a activității CTSB, împreună cu o creștere a cantității totale de enzimă asociată tumorii. Examinarea histologică a glioamelor tratate cu H-1PV crescute la șobolani imunocompetenți ( Geletneky și colab., 2010) a demonstrat că, pe lângă cauzarea remisiunii și îmbunătățirea supraviețuirii animalelor, tratamentul cu H-1PV nu a fost asociat cu afectarea normală a țesutului cerebral sau a altor organe și a fost însoțit doar de semne minore de inflamație. În acord cu datele anterioare in vitro și in vivo ( Di Piazza și colab., 2007), activarea CTSB a fost observată numai în celulele tumorale infectate cu H-1PV, dar nu și în țesutul peritumoral din jur. ADN-ul parvoviral a putut fi detectat în tumoră și în țesutul cerebral peritumoral la 48 de ore după infecție (pi). Răspândirea virusului a crescut și mai mult cu timpul și la 72 h pi ADN-ul viral a putut fi detectat suplimentar în emisfera creierului controlaterală, în cerebel și în organe îndepărtate (inima, plămânii, ficat, splină și rinichi), dar doar tranzitoriu, deoarece nu există virusuri. ADN-ul ar putea fi dezvăluit în orice țesut normal 2 săptămâni pi Transcripția virusului și acumularea NS1 au fost puternic limitate la resturile tumorale, deși nedetectabile în țesuturile normale din jur, argumentând astfel replicarea selectivă a H-1PV în celulele tumorale. Pentru a confirma această afirmație, replicarea virusului a fost comparată în două grupuri de animale, adică, la purtători de gliom și la șobolani martor sănătoși. Producția de virus infecțios în creierul șobolanilor purtători de tumori tratați cu H-1PV a fost cu două ordine de mărime mai mare decât în creierul animalelor martor, care nu aveau tumori, dar au fost injectate cu aceeași cantitate de virus. Această replicare preferențială a H-1PV în țesutul neoplazic, fără a induce modificări histopatologice în țesutul normal al creierului, a oferit dovezi convingătoare că H-1PV păstrează oncotropismul afișat în culturile celulare subși în condiții in vivo ( Geletneky și colab., 2010 ).

Într-un model de șobolan cu imunodeficiență de gliom uman, s-au testat atât administrări intratumorale, cât și multiple sistemice (intravenoase) de H-1PV și s-au dovedit a avea ca rezultat suprimarea tumorii fără a fi însoțită de niciun efect secundar asociat tratamentului. Toate animalele supuse viroterapiei H-1PV au rămas active și au crescut în greutate până la sfârșitul perioadei de observație ( Geletneky și colab., 2010).). Expresia proteinei PV NS1 a fost detectată în zonele tumorale necrotice, dar nu în țesutul cerebral normal din jur, în acord cu observațiile făcute la animalele imunocompetente purtătoare de gliom (vezi mai sus). Lucrarea lui Geletneky et al. a ridicat în continuare întrebarea dacă o aplicare intranazală H-1PV ar putea, de asemenea, să obțină eficiență terapeutică și să suprime creșterea xenogrefelor de gliom uman la șobolanii imunodeficienți. După cum au raportat Kiprianova și colab. (2011), o singură instilare intranazală a virusului a condus la o regresie semnificativă a gliomului și la prelungirea supraviețuirii animalelor, fără nicio toxicitate pentru toate, cu excepția țesuturilor tumorale. Într-adevăr, toți markerii de replicare a virusului au fost exprimați exclusiv în tumoră. Aceste rezultate sugerează o alternativă sigură și eficientă la administrarea H-1PV prin calea intracraniană invazivă standard.

Adenocarcinom ductal pancreatic

Adenocarcinomul ductal pancreatic este una dintre cele mai letale afecțiuni gastrointestinale, provocând fiecare al șaselea deces cauzat de cancer în Europa ( Jemal și colab., 2007 ). Boala este foarte rezistentă la tratamentele actuale: rezecția chirurgicală, care realizează cea mai bună supraviețuire pe termen lung de până acum, este fezabilă doar la o minoritate de pacienți ( Finlayson și Birkmeyer, 2003 ). S-a demonstrat că infecția oncolitică cu H-1PV a celulelor derivate din PDAC in vitro are ca rezultat moartea eficientă a celulelor induse de virus, chiar și atunci când celulele au fost rezistente la chimioterapice standard, de exemplu, gemcitabină ( Angelova și colab., 2009b ). Mai mult, capacitatea H-1PV de a suprima PDAC a fost studiată și in vivo. Într-un model de șobolan ortotopic singeneic al PDAC, o singură injecție intratumorală de H-1PV a fost aplicată la 2 săptămâni după implantarea celulelor de carcinom pancreatic de șobolan în pancreas. Evaluarea expresiei virusului a demonstrat că H-1PV a fost exprimat selectiv în tumoră, spre deosebire de țesuturile normale. O explozie inițială a expresiei virusului în tumoră și țesutul pancreatic din jur a fost observată la scurt timp după injectarea virusului. Transcrierile H-1PV au fost de asemenea detectate în organele limfoide. Din ziua 10 încolo, expresia virusului s-a estompat în țesuturile pancreatice normale și în alte țesuturi viscerale îndepărtate, dar a rămas persistentă în tumoră ( Angelova și colab., 2009b ). Într-un mediu imunodeficient, o țintire selectivă similară a tumorii și absența toxicității au fost observate la șobolanii nuzi tratați cu H-1PV purtători de PDAC ( Li și colab., 2013).).

Într-un alt studiu, șobolanii nuzi purtători de xenogrefă de carcinom cervical uman au fost utilizați pentru a demonstra o oprire și regresie a creșterii tumorii dependente de doză de virus. Expresia NS1 a fost detectată numai în rinichi și la niveluri foarte scăzute. În mod remarcabil, nicio pierdere în greutate sau alte efecte adverse nu au fost documentate la niciunul dintre animalele tratate ( Li et al., 2013 ).

Recent, au fost inițiate două experimente pe animale la scară largă folosind șobolani imunocompetenți permisivi de virus pentru a oferi dovezi preclinice suplimentare ale profilului de siguranță favorabil H-1PV. Virusul a fost aplicat intravenos la șobolani sănătoși, fie ca o singură doză mare, fie ca injecții multiple. Dozele de virus au fost considerate echivalente sau mai mari decât cele rezultate din amplificarea virală după infectarea tumorilor cerebrale. Se știe că șobolanul este gazda naturală a H-1PV și acesta din urmă poate persista în populațiile normale de șobolani printr-un mecanism încă necunoscut. Această persistență indică faptul că și șobolanii care nu poartă tumori sunt capabili pentru replicarea parvovirusului, făcând acest model animal o alegere potrivită pentru detectarea posibilelor efecte secundare ale aplicării terapeutice H-1PV. Indiferent de regimul de administrare utilizat, mortalitatea animalelor sau modificări macroscopice ale organelor nu au fost observate. Hiperplazia difuză minimă a tractului biliar și dezvoltarea centrului germinativ în splină au fost detectate după multiple aplicații H-1PV. Cu toate acestea, modificările hepatice au fost reversibile într-o perioadă de recuperare de 2 săptămâni. Nu au putut fi evidențiate efecte toxice induse de virus prin măsurarea parametrilor sanguini (hematologie, chimie, coagulare). In acord cudate in vitro , celulele mononucleare din sânge nu au prezentat modificări funcționale după injectarea virusului și a putut fi detectată eliberarea măsurabilă de citokine. Tratamentul cu H-1PV a condus la dezvoltarea anticorpilor IgG. Virusul a fost eliminat în principal prin fecale ( Geletneky et al., 2015a ). Mai mult, aceiași autori au demonstrat că H-1PV este nepatogen la șobolanii adulți și infecția nu afectează funcțiile sistemului nervos central sau autonom, chiar și după o injecție directă în creier (Geletneky et al., 2015b ) .

Luate împreună, datele descrise mai sus furnizează dovezi experimentale ale oncoselectivității H-1PV la animalele adulte de la gazda sa naturală, șobolanul, rezultând suprimarea tumorii în absența oricăror semne patologice (Tabelul 2 ) . Această inocuitate a fost demonstrată și la șobolanii tineri ( Jacoby și Ball-Goodrich, 1995 ; Gaertner și colab., 1996 ), în concordanță cu studiile anterioare care arătau că efectele patologice ar putea fi observate numai dacă infecția animalelor a avut loc în primele câteva zile. după naștere ( Jacoby și colab., 1979 ). În general, acest profil de siguranță favorabil sprijină traducerea în continuare a aplicațiilor H-1PV în clinică.Masa 2

TABELUL 2 . DOVEZI IN VIVO ALE ONCOSELECTIVITĂȚII H-1PV .

Evaluarea eficacității antitumorale H-1PV utilizând modele de xenogrefe la șoareci nepermisivi

Au fost efectuate studii suplimentare (rezumate în Tabelul 3 ) pentru a testa activitatea supresoare a H-1PV pe xenogrefele tumorale umane la șoarecii primitori imunodeficienți. Deoarece șoarecele este o gazdă nepermisivă pentru H-1PV, aceste studii nu sunt informative în ceea ce privește oncoselectivitatea H-1PV, dar sunt mult relevante pentru evaluarea capacității de suprimare a virusului împotriva țintelor tumorii umane.Tabelul 3

TABELUL 3 . SUPRIMAREA INDUSĂ DE H-1PV A XENOGREFELOR TUMORALE UMANE LA MODELE DE ȘOARECE .

Capacitatea H-1PV de a inhiba creșterea tumorilor umane xenotransplantate la șoarecii primitori imunocompromiți a fost documentată pentru prima dată de Dupressoir și colab. (1989) și susținută în continuare de Faisst și colab. (1998) . Dupressoir et al. au raportat că atât aplicarea locală (intratumorală) cât și cea sistemică (intravenoasă) a virusului duc la suprimarea semnificativă a creșterii carcinomului mamar uman și, în unele cazuri, la revenire, fără efecte secundare dăunătoare detectabile asociate infecției. În munca lui Faisst și colab., carcinoamele subcutanate cu creștere rapidă au fost stabilite prin implantarea carcinomului cervical uman.celule la șoareci SCID imunodeficienți. Animalele purtătoare de tumori au fost ulterior injectate intratumoral cu diferite doze de H-1PV. Au fost observate expresia intratumorală a genei H-1PV și regresia tumorală dependentă de doză. Acest studiu a furnizat dovezi experimentale care arată că o singură injecție locală de H-1PV este suficientă pentru a induce regresia, într-un mediu receptor imunodeficient, a anumitor carcinoame solide umane.

Observații similare au fost făcute de Angelova și colab. (2009a) într-un model de limfom uman. O singură injecție intratumorală de H-1PV la șoarecii SCID purtători de limfom Burkitt umani a dus la o regresie rapidă a tumorii. Mai mult, s-a demonstrat că dozele mici de H-1PV pot obține și un efect terapeutic puternic, chiar și atunci când virusul a fost aplicat în stadii avansate ale bolii. Analizele histochimice au demonstrat răspândirea H-1PV la tumori îndepărtate, netratate cu virus, în plus față de replicarea intratumorală și exprimarea proteinelor în țesuturile tumorale tratate cu virus.

Wang şi colab. (2012) au raportat că într-un model de carcinom gastric uman in vivo , expresia NS1 indusă ex vivo în celulele canceroase gastrice slab diferențiate le împiedică să formeze tumori la șoarecii nuzi. Acest studiu a fost în acord cu un raport anterior ( Zhang et al., 1997 ) care arată că aplicarea intratumorală a H-1PV la șoarecii purtători de carcinom gastric uman are ca rezultat o inhibare eficientă a tumorii. Important este că această oncosupresie nu a fost însoțită de nicio reacție secundară toxică, chiar și atunci când virusul a fost aplicat atât timp cât de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Lipsa similară de toxicitate a fost observată după un tratament intraperitoneal la animale.

Regresia tumorii și remisiunea completă la șoarecii nuzi purtători de carcinom pancreatic uman ( Angelova și colab., 2009b ) sau șoareci NOD/SCID ( Li și colab., 2013 ) au fost observate după ce doza critică de H-1PV a fost atinsă într-o doză de virus- experiment de escaladare. Această regresie nu a fost asociată cu toxicitatea detectabilă. Foarte important, materialul tumoral primar derivat din carcinomul pancreatic a fost utilizat în studiul lui Li și colab. (2013) .

Testarea preclinice a tratamentelor combinatorii pe bază de H-1PV

Pentru a evalua capacitatea de cooperare a H-1PV și a gemcitabinei pentru suprimarea creșterii carcinomului pancreatic într-un model de șobolan ortotopic, animalele purtătoare de tumori au fost tratate secvenţial mai întâi cu gemcitabină și 2 săptămâni mai târziu cu H-1PV într-un protocol în două etape (Tabelul). 4). Deoarece cei doi agenți induc căi diferite de moarte (apoptoză și, respectiv, moartea celulară mediată de catepsină), se așteaptă ca oncoliza declanșată de H-1PV să evite caracteristicile antiapoptotice (adică rezistența la gemcitabină) dobândite de multe celule tumorale în timpul progresiei PDAC. Datele au demonstrat într-adevăr că potențialul anti-PDAC al medicamentului a fost îmbunătățit semnificativ atunci când parvovirusul a fost adăugat la tratament. Tratamentul combinat nu a fost însoțit de toxicitate aditivă, așa cum este ilustrat de rezultatele unei evaluări toxicologice extinse efectuate în acest model ( Angelova și colab., 2009b).). Funcțiile măduvei osoase, ficatului și rinichilor de șobolan au fost monitorizate prin măsurarea factorilor de decizie relevanți clinic. Markerii din sânge ai activității măduvei osoase nu au fost afectați, cu excepția scăderii induse de gemcitabină a nivelurilor reticulocitelor și monocitelor. Nivelurile de bilirubină, aspartat aminotransferază (ASAT) și alanin aminotransferază (ALAT) au fost crescute atât la grupurile de animale netratate, cât și la cele tratate cu gemcitabină, reflectând procesele litice de grad scăzut, tipice ficatului șobolanilor purtători de PDAC. Aplicarea H-1PV ca tratament de linia a doua a restabilit nivelurile acestor markeri la intervalele lor fiziologice normale respective. Nivelurile creatininei au rămas stabile după tratamentul combinatoriu, arătând un clearance renal nealterat.Tabelul 4

TABELUL 4 . SIGURANȚA TRATAMENTELOR COMBINATORII PE BAZĂ DE H-1PV .

Observații similare au fost făcute atunci când celulele PDAC sau carcinom cervical stabilite, precum și materialul tumoral PDAC primar derivat de la pacient, au fost utilizate pentru implantare la șobolani imunodeficienți sau, respectiv, la șoareci NOD/SCID (Li et al., 2013), pentru a evalua eficacitatea antitumorală și biosecuritatea H-1PV combinată cu acid valproic (VPA). VPA aparține clasei de inhibitori ai histon deacetilazei (HDAC) și s-a dovedit că întărește citotoxicitatea multor OV, inclusiv virusul stomatitei veziculoase ( Alvarez-Breckenridge și colab., 2012 ), virusul herpes simplex ( Otsuki și colab., 2008). ), și adenovirusuri ( Van Oosten și colab., 2007), prin inhibarea expresiei genelor celulare implicate în răspunsurile imune antivirale și/sau prin stimularea expresiei genelor necesare pentru ciclul de viață viral ( Nguyen și colab., 2010 ). In vitro , s-a demonstrat că VPA îmbunătățește citotoxicitatea mediată de H-1PV NS1 prin creșterea acetilării proteinelor și a activității transcripționale reglate în sus ( Li și colab., 2013 ). În acord cu datele in vitro , tratamentul cu H-1PV in vivo , urmat de administrarea de VPA, a fost lipsit de pierdere în greutate sau alte semne de toxicitate și a dus la regresia tumorală sinergică și prelungirea supraviețuirii. În plus, această abordare combinatorie a permis reducerea dozelor de H-1PV la un nivel care este suboptim într-un cadru monoterapeutic.

În total, datele preclinice argumentează în mod convingător împotriva unui risc semnificativ ca parvovirusul H-1 oncolitic să inducă efecte toxice severe atunci când este aplicat la pacientul uman. Mai mult decât atât, este puțin probabil ca tratamentul cu H-1PV să prezinte un risc de mutageneză inserțională, deoarece nu se știe că parvovirusurile autonome se integrează în genomul celulei gazdă ( Richards și Armentrout, 1979 ; Ron și Tal, 1985 ). Acest profil de siguranță extrem de favorabil (Figura 4 ) împreună cu activitățile anticancer proeminente justifică luarea în considerare a H-1PV ca alternativă de tratament mono-, combinată sau de linia a doua la strategiile toxice convenționale actuale.Figura 4

FIGURA 4. DOVEZI PRECLINICE ALE SIGURANȚEI H-1PV .

Dovezi clinice ale tolerabilității H-1PV

În ciuda izolării frecvente a H-1PV din țesuturile pacienților cu cancer și din tumorile transplantabile sau ca contaminant al liniilor celulare derivate din tumori umane în anii 1970 ( Toolan și colab., 1960 ), toate încercările de a izola virusul din țesuturile umane normale nemaligne au eșuat. ( Toolan şi colab., 1962 ; Rommelaere şi Tattersall, 1989 ). Nicio dovadă experimentală convingătoare a unei asocieri între vreo boală umană și o infecție anterioară cu H-1PV nu a putut fi găsită. Indicațiile inițiale ale unui posibil rol al H-1PV în problemele gestaționale nu au fost confirmate de studiile ulterioare, care nu au reușit să dezvăluie prezența anticorpilor specifici H-1PV sau a virionilor H-1PV în seruri sau probe de țesut obținute după avorturi umane spontane ( Monif şi colab., 1965 ;Neuman şi colab., 1970 ).

Dovezi clinice timpurii importante care arată că aplicarea H-1PV la oameni este bine tolerată și lipsită de toxicitate secundară au fost furnizate după infecția experimentală a pacienților cu cancer uman, în cadrul unui acord de utilizare compasivă. În studiul de pionierat al lui Toolan și colab. (1965) , doi pacienți (o fată de 12 și 13 ani) cu osteosarcom diseminat avansat au fost inoculați intramuscular cu H-1PV la o doză de aproximativ 1 × ¹⁰⁹unități formatoare de plăci (pfu) ale unei formulări de virus non-GMP. La unul dintre pacienți a fost aplicată și o injecție directă de virus în tumora din zona șoldului drept. Unul dintre pacienți a dezvoltat febră de până la 38,5°C în primele 10 zile după administrarea virusului, dar nu a fost în mod clar atribuită inoculării virusului din cauza prezenței unei infecții concomitente a tractului urinar. Temperatura corpului a revenit la normal după 5 zile. Pacienta a fost externată în ziua 15 fără simptome clinice suplimentare, dar a murit din cauza progresiei tumorii la scurt timp după readmisia la spital în ziua 38 după tratamentul cu H-1PV. Al doilea pacient care suferă de boală metastatică avansată nu a prezentat efecte secundare asociate tratamentului viral. La ambii pacienti, Injecția cu H-1PV a condus la o viremie extinsă și la producerea de anticorpi neutralizanți specifici H-1PV. În general, nu au putut fi observate efecte secundare specifice de organ induse de virus și siguranța și tolerabilitatea H-1PV au fost considerate bune la ambii pacienți.

Într-un studiu ulterior, care a avut loc în Franța în cadrul unui studiu clinic intitulat „Studiu clinic de fază I privind posibila utilizare a parvovirusului H-1 în tratamentul cancerului”, 12 pacienți cu metastaze cutanate provenite din diferite tipuri de tumori solide (de sân). adenocarcinomul, melanomul, carcinomul pulmonar cu celule mari, carcinomul pancreatic și leiomiosarcomul renal) au fost supuse unei creșteri intralezionale a dozei (1 × 10 8 , 1 × ¹⁰ 9 ^, 1 × 10 ¹⁰ pfu) tratament cu H-1PV ( Le Cesne și colab. ., 1993). Virusul a fost administrat în mod repetat, cu intervale de 10 zile fără tratament. Seroconversia a fost detectată în zilele 10-15 după prima injecție cu virus. Doar o febră moderată până la aproximativ 38°C (la 3 din cei 12 pacienți), o creștere izolată a creatininei și gamma-glutamil transferazei (GGT), dar nu au putut fi observate alte reacții adverse toxice asociate cu H-1PV, argumentând pentru un profil excelent de siguranță al acestui virus oncolitic la om. De asemenea, este de remarcat faptul că la doi din șapte pacienți cu carcinom mamar boala stabilă a fost documentată pe toată perioada de observație. Prezența ADN-ului/proteinelor virale în extractele tumorale a fost investigată la patru subiecți și la toți au putut fi găsite genomi/proteine virale după administrarea de H-1PV atât în leziunile țintă (metastaze la care a fost administrat virusul), cât și în leziunile martor. (metastaze la distanță de locul injectării). Aceasta a confirmat o expunere sistemică la virus, așa cum a demonstrat deja viremie.

Cu sprijinul acestor date încurajatoare privind siguranța la om, a fost planificat și inițiat un următor studiu clinic cu H-1PV la pacienții cu tumori cerebrale maligne ( Geletneky et al., 2012 , 2014a , b) .). Acest studiu a folosit trei moduri de aplicare a virusului care nu au fost testate în rapoartele din 1965 și 1993, și anume injectarea intratumorală, injectarea direct în parenchimul cerebral care mărginește tumora și injecțiile intravenoase. Din punct de vedere al siguranței și tolerabilității, aceste căi de administrare a parvovirusului au fost potențial mai dificile, deoarece particulele virale active din sistemul nervos central (SNC) ar putea duce la encefalită sau meningită, iar o perfuzie intravenoasă ar putea duce la o expunere sistemică mai rapidă în comparație cu eliberarea H-1PV în circulație după injectare intramusculară, subcutanată sau intracutanată. Studiul a fost planificat ca un studiu de creștere a dozei la intervale de doze de 1 × 10 ⁶ , 5 × 10 ⁷ și 1 × 10 ⁹pfu. Preparatul H-1PV a fost produs conform standardelor GMP, oferind astfel concentrații și puritate certificate de virus.

Tratamentul inițial a fost prin injectarea intratumorală a jumătate din doza totală per pacient, urmată de o perioadă de observație de 9 zile în care virusul ar putea interacționa cu tumora. Rezecția tumorii a fost efectuată în ziua 10 și a doua jumătate a dozei a fost administrată prin injecții multiple în creierul din jurul tumorii. Au fost tratați trei pacienți per grup de doză și, din motive de siguranță, a fost permis un interval de timp de 28 de zile (între primul și al doilea pacient) sau de 18 zile (între al doilea și al treilea pacient dintr-un grup). Toate injecțiile cu virus au fost bine tolerate, fără efecte secundare sau patologie asociate virusului. Au fost detectate unele efecte adverse, dar acestea au fost evaluate fără legătură cu tratamentul cu virus și nu a fost găsită nicio toxicitate care limitează doza. Nu am detectat niciun semn de febră sau simptome asemănătoare gripei și în special niciun semn de patologie a SNC. Măsurătorile genomilor virali din sânge au arătat rezultate pozitive în grupul cu doze intermediare și cu doze mari, indicând pătrunderea H-1PV prin bariera hematoencefalică, din nou fără semne de toxicitate sistemică.

După ce datele de siguranță ale brațului pacientului intratumoral au fost revizuite de experți externi și de agenția federală responsabilă (Institutul Paul-Ehrlich, Langen, Germania), a fost acordată permisiunea de a trece la brațul de testare intravenoasă (Geletneky și colab. , 2014a , b ). Aici, pacienților li s-a injectat o doză totală de 5 × 10 ⁷ sau 1 × 10 ⁹pfu de H-1PV. Toți pacienții au primit zilnic infuzii virale de 10% din doza totală în zilele 1 până la 5, urmate de o perioadă de recuperare de 4 zile. În ziua 10, au fost efectuate intervenții chirurgicale și injectarea intraparenchimatoase a celei de-a doua jumătate a dozei planificate de H-1PV, ca și în primul braț de studiu. De asemenea, după injectarea intravenoasă, nu am observat niciun efect secundar, în special, nicio febră și niciun semn de infecții cu virus tipice. Măsurătorile farmacocinetice au arătat concentrații măsurabile de H-1PV în primele 5 zile (și la unii pacienți pentru încă una), iar ADN-ul virusului a fost prezent constant în perioada de 22 de ore dintre injecțiile zilnice indicând expunere continuă.

Un alt aspect important al siguranței tratamentului cu H-1PV este biosecuritatea și posibila eliminare a virusului de către pacienții tratați. Prin urmare, pacienții au fost internați în condiții de carantină până când au generat un răspuns cu anticorpi sau s-au dovedit a fi negativi pentru H-1PV în probele de evacuare (fecale, urină și salivă). Doar cantități mici de ADN virus au putut fi detectate în unele sonde de fecale, în timp ce saliva și urina au fost în mod constant negative. Încă nu se știe dacă rezultatele pozitive ale testului indică virusul activ și infecțios sau numai acizii nucleici virali.

În concluzie, pe baza a trei aplicații la om, H-1PV poate fi considerat sigur și bine tolerat cel puțin la o doză cumulată de 1 × 10 ⁹ pfu. Simptomele asemănătoare gripei pot apărea în timpul tratamentului, dar acest lucru nu a putut fi confirmat în ultimul studiu cu virusul GMP. Astfel, nu se poate exclude ca aceste simptome să fie legate de impuritățile preparatului viral și nu cauzate de virusul în sine. O altă consecință a datelor actuale de siguranță este că necesitatea ca pacienții să fie ținuți în izolare ar trebui reconsiderată pentru studiile viitoare.

Declarație privind conflictul de interese

Jean Rommelaere a primit granturi de cercetare de la ORYX GmbH & Co.KG. Assia L. Angelova, Karsten Geletneky și Jean Rommelaere au un interes de proprietate (inclusiv brevete) în Centrul German de Cercetare a Cancerului. Jürg PF Nüesch nu are niciun conflict de interese de declarat.

Mulțumiri

AA a fost susținută de un grant de cercetare de la ORYX GmbH & Co.KG. Primul studiu clinic de fază I/IIa cu parvovirus H-1 la pacienții cu glioblastom multiform (ParvOryx01) a fost finanțat de ORYX GmbH & Co.KG. Autorii ar dori să-i mulțumească dr. Jacek Hajda pentru evaluarea datelor de siguranță ParvOryx01 și dr. Michael Dahm pentru discuțiile utile.

Referințe

Adair, RA, Roulstone, V., Scott, KJ, Morgan, R., Nuovo, GJ, Fuller, M. și colab. (2012). Transportul celular, livrarea și replicarea selectivă a unui virus oncolitic în tumoare la pacienți. Sci. Transl. Med. 4, 138ra77. doi: 10.1126/scitranslmed.3003578

Pubmed Rezumat | Text complet Pubmed | CrossRef Full Text | Google Academic

Adeyemi, R. și Pintel, DJ (2012). Replicarea virusului minut al șoarecilor în celulele murine este facilitată de epuizarea p21 indusă viral. J. Virol. 86, 8328–8332. doi:10.1128/JVI.00820-12

Pubmed Rezumat | Text complet Pubmed | CrossRef Full Text | Google Academic

Adeyemi, RO, Landry, S., Davis, ME, Weitzman, MD și Pintel, DJ (2010). Virusul parvovirus minut al șoarecilor induce un răspuns la deteriorarea ADN-ului care facilitează replicarea virală. PLoS Pathog. 6:e1001141. doi:10.1371/journal.ppat.1001141

Pubmed Rezumat | Text complet Pubmed | CrossRef Full Text | Google Academic

Adeyemi, RO și Pintel, DJ (2014). Depleția ciclinei B1 indusă de parvovirus previne intrarea mitotică a celulelor infectate. PLoS Pathog. 10:e1003891. doi:10.1371/journal.ppat.1003891

Pubmed Rezumat | Text complet Pubmed | CrossRef Full Text | Google Academic

Ahmed, M. (2013). Virușii oncolitici ca agenți terapeutici pentru cancerul de prostată. Adv. Teh. Biol. Med. 1, 107. doi:10.4172/atbm.1000107

Conceptul de viroterapie oncolitică pentru tratamentul cancerului

Parvovirusul oncolitic H-1

Mecanisme de oncoselectivitate a protoparvovirusului rozătoarelor

Dovezi in vitro a oncoselectivității H-1PV

Dovezi in vivo a oncoselectivității H-1PV

Gliom

Adenocarcinom ductal pancreatic

Evaluarea eficacității antitumorale H-1PV utilizând modele de xenogrefe la șoareci nepermisivi

Testarea preclinice a tratamentelor combinatorii pe bază de H-1PV

Dovezi clinice ale tolerabilității H-1PV

Declarație privind conflictul de interese

Mulțumiri

Referințe

Evaluează asta:

SPUNE SI ALTORA (click pe butoane):

Apreciază:

Related

Exprimati-va pararea! Anulează răspunsul