Arhive etichetă | glutamina

management metabolic glioblastom multiform Dr. Thomas Seyfried

https://www.facebook.com/metabolichealthsummit/videos/223862208947827/

Glioblastomul (GBM) este printre cele mai agresive tumori cerebrale primare. Este un tip de cancer extrem de invaziv, care crește și se răspândește rapid în tot creierul.La #MHS2020, Dr. Thomas Seyfried a ținut o prelegere despre managementul metabolic al glioblastomului. Dr. Dr. Seyfried este un pionier în înțelegerea metabolismului energetic al cancerului cerebral și modul în care terapiile metabolice pot fi utilizate pentru a exploata caracteristicile care diferențiază aceste celule canceroase de celulele sănătoase.El discută în detaliu despre cum metabolismul acestor celule canceroase este modificat pentru a duce la o dependență sporită de combustibilul fermentabil glucoză și glutamină pentru a genera energie de care au nevoie pentru a crește și răspândi. Pe baza cercetării animalelor, terapiile bazate pe metabolice care restricționează simultan glucoza și glutamina, cum ar fi dietele ketogenice și antagoniștii glutaminei, au potențialul de a exploata metabolismul cancerului. În cetoza nutrițională, energia se obține în primul rând din combustibilii nefermentabili – acizi grași și cetone care necesită mitocondrii pentru a genera energie, căi care sunt suprimate în multe tumori.El abordează, de asemenea, modul în care în modelele de animale, dietele ketogenice restricționate caloric au vizat principalele semne ale cancerului și introduce conceptul terapiei Press-Puls ca o strategie non-toxică și eficientă din punct de vedere al costurilor pentru gestionarea posibilă a GBM. Aceste terapii sunt investigate în prezent în studiile clinice și sperăm să le înțelegem utilitatea potențială la om în curând!Pentru a accesa Dr. Prezentarea completă a lui Seyfried, împreună cu accesul la toate prelegerile #MHS2020, care includ alte 24 conferințe de conferință, 5 discuții aprofundate despre panel și 6 prezentări ale forumului de interes special accesați acest link: https://metabolichealthsummit.com/collections/frontpage/products/mhs-2020-video-presentations-panels-special-interest-forums-package

blocarea căilor metabolice cancer!

Dacă ați citit cartea supraviețuitoarei de cancer a lui Jane McClelland Cum să înfometați cancerul, această postare va avea sens și vă recomand cu mare drag cartea !

Dacă nu ați citit cartea, Jane a făcut o hartă a substanțelor naturale și a eliberat medicamentele de etichetă care înfometează celulele canceroase de combustibil blocând zahărul (glucoza), acizii grași (grăsimea) și un aminoacid (glutamină).

După ce i-am citit cartea, m-am întrebat dacă există substanțe vegetale care funcționau la fel?

Am petrecut săptămâni cercetând și documentând compușii și căile plantelor și când am terminat, am adăugat suplimente aminoacizi în cutia albastră care au fost asociate și cu creșterea celulelor canceroase și remediate prin dietă.

Latura glutaminică a triunghiului; cei care îmi cunosc povestea vor ști că cel mai bun mod în care am găsit să blochez glutamina este dieta. Niciun medicament nu mi-a putut controla simptomele de consumul excesiv de glutamat pe care l-au provocat aditivii și procesarea alimentelor.

Anumiți aditivi alimentari au un nivel ridicat de glutamat liber (genul cauzat de încălzirea sau degradarea unei proteine) care provoacă apariția rapidă a nervilor ȘI, de asemenea, combustibilul celulelor canceroase. Acești aditivi pot fi găsiți chiar și în produsele organice sub anumite denumiri precum „arome naturale”, guma de guar, gumă de xantan și multe altele. Accesați lista mea de nume ascunse pentru MSG , pentru a evita aditivii cu glutamat ridicat.

Grâul și lactatele sunt două alimente cu conținut ridicat de glutamat, forma naturală neprocesată, în mod normal, nu sunt dăunătoare. Oamenii tind să aibă o cantitate mare de lactate și grâu în dietele lor, astfel încât eliminarea celor doi poate pune într-adevăr o proteză în cantitatea de glutamat consumat!

Pe partea de glucoză a triunghiului; Am observat ceva interesant; există compuși în morcovi care blochează zahărul.(la fel si in mere…florentin)!

Asta ar putea explica scăderea glicemiei lui Casey. A fost 110 POST înainte de schimbarea dietei înainte de diagnosticul său. După ce a fost pe Square One o perioadă și a mâncat peste 5 lbs. morcovi, un fel de țelină și un smoothie pe zi, glicemia lui in care NU Postea era de 70 ! Observați că apigenina (țelina) este și pe partea de blocare a zahărului și multe alte substanțe pe care le consumă.

Într-un efort de colaborare cu Chris Wark ( Chrisbeatcancer.com ) am terminat acest grafic, lustruit și gata să fie afișat maselor!

Faceți clic aici pentru a tipări !

STOP Graficul cancerului

Mai jos în graficul STOP Cancer sunt prezentate alte căi și mecanisme care ajută la stoparea cancerului.

Acest grafic vizează căi și mecanisme frecvent reglementate în cancer, cum ar fi:

Angiogeniza -Aprovizionare sanguina tumoare.

IGF-1 – Un hormon natural care poate alimenta cancerul.

Alimente care provoacă apoptoza – Alimente care pot ucide celulele stem cancerului.

Are sens să acoperi toate bazele pe care le poți face ca corpul tău să fie ostil cancerului!

Pentru a tipări, faceți clic aici !

Harta cancerului colorectal

https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05210

Căi comune degradate în cancerul colorectal!

APC (Adenomatous Polyposis Coli) este un   mutație genică asociată cu starea ereditară numită FAP (Familial Adenomatous Polyposis) care determină creșterea polipilor care pot deveni canceroși.

Un studiu a constatat că curcumina combinată cu resveratrol a avut un efect sinergic în prevenirea creșterii celulelor canceroase la pacienții cu FAP!

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6205744/

  • Curcumina și Resveratrolul împreună

Wnt-Beta Catenina este adesea supraexprimată în cancerul colorectal. Acesta controlează proliferarea celulară, migrația celulară și soarta celulelor și excesul de expresie poate provoca mutații genetice. Supraexprimarea căilor de semnal Wnt este asociată cu pierderea funcției regulatorului tumoral APC. Calea Wnt încrucișează, de asemenea, căile Notch și Sonic Hedgehog. S-a descoperit că substanțele de mai jos inhibă activarea căii Wnt.

  • Artemisinin-potent
  • Curcumina
  • Ulei de semințe negre/negrilica
  • morcovi
  • Apigenina (telina)
  • I3C-POTENT (varză de broccoli)
  • Usturoiul proaspat

P13k Reglează supraviețuirea celulelor, proliferarea și creșterea expresiei este asociată cu progresia tumorii. Când este exprimat în exces, reduce apoptoza (moartea celulelor) și permite proliferarea. S-a dovedit că substanțele de mai jos inhibă exprimarea P13k.

  • Ulei de semințe negre
  • Resveratrol (struguri)
  • EGCG (Ceai verde)
  • quercetin
  • Fisetin (capsuni 37 pe zi doza)
  • luteolina
  • Agigenină (țelină)
  • I3C și Sulforafan (varză de broccoli)
  • Acid elagic (boabe)
  • Curcumina
  • morcovi

Iată un studiu minunat cu un grafic frumos- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5736021/

PTEN este o genă supresoare a tumorilor, deci doriți să o activați, astfel încât să poată suprima tumorile. De asemenea, este implicat în integritatea genomică sau controlul calității celulelor. Pierderea expresiei PTEN scade o altă genă supresoare tumorală numită P53. Mai jos este un anunț fantastic de pozitiv despre varza de broccoli și PTEN!

COX-2 este asociat cu inflamația care induce cancer. Promovează angiogeneza (aportul de sânge la tumoră) și invazia țesuturilor de tumori și rezistența la apoptoză (moartea celulelor). Substanțele de mai jos inhibă COX-2.

  • Ulei de semințe negre-POTENT
  • Apigenina (telina)
  • Beta-caroten (Morcovi)
  • Curcumina
  • EGCG (Ceai verde)
  • Sulforafan și I3C (germeni de broccoli)
  • Vitamina C
  • Resveratrol (struguri)
  • Usturoi
  • morcovi
  • Și altele..

PPAR (Peroxisome Proliferator-activ receptors) Aceasta suprimă tumorile, deci doriți să o activați! Când PPAR este activat, COX2 scade permițând apoptoza (moartea celulelor). S-a descoperit că substanțele de mai jos activează PPAR

  • Curcumina
  • EGCG (Ceai verde)
  • Resveratrol (struguri)
  • Beta-caroten (Morcovi)
  • Apigenina (telina)
  • Licopen (roșie gătită)
  • I3C- Brocoli germeni 
  • morcovi

P53 – Aceasta este o genă supresoare a tumorilor, așa că doriți să o activați! Când este activata, oprește divizarea celulelor mutate sau deteriorate, provocând apoptoza (moartea celulelor) împiedicând formarea tumorilor. Substanțele de mai jos s-au dovedit a activa P53.

  • Berberine-POTENT (supliment)
  • Apigenin-POTENT (țelină)
  • Curcumina
  • EGCG (Ceai verde)
  • Resveratrol (struguri)
  • Betacaroten (Morcovi)
  • I3C și sulforafan (varză de broccoli)
  • Ghimbir
  • Usturoi
  • Ulei de semințe negre
  • morcovi

mTOR – este adesea supraexprimat în cancerul colorectal. Supraexpresia mtor determină creșterea și angiogeneza celulelor canceroase. Substanțele de mai jos inhibă mTOR.

  • Eliminați produsele animale
  • Curcumina
  • EGCG (Ceai verde
  • Resveratrol (struguri)
  • Luteolina (Radicchio, Morcovi)
  • Apigenina (telina)
  • quercetin
  • Indol-3 (Broccoli Sprout)
  • Berberine (Supliment)
  • Ulei de semințe negre
  • Usturoi

TGF-Beta – este o genă supresoare a tumorii. Când este activat, aceasta reduce scăderea proliferării celulelor canceroase și crește moartea celulelor canceroase (apoptoză). Substanțele de mai jos activează TGF-Beta.

  • Apigenin-POTENT (telina)
  • Luetolin (morcovi sau radicchio)
  • quercetin
  • Vitamina C
  • I3C (Broccoli Sprout)
  • Berberina (Supliment)
  • Ulei de semințe negre
  • Usturoi

EGFR este de obicei supraexprimat în cancerul colorectal. Reglează diviziunea celulară și moartea.

  • EGCG (Ceai verde)
  • Curcumina

Per tabel- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5327764/

MAPK – supraexprimat în multe tipuri de cancer. Reglează expresia genelor, creșterea celulară și supraviețuirea. Semnalizarea crescută MAPK duce la proliferarea celulară necontrolată și rezistența la apoptoză (moartea celulelor). Substanțele de mai jos inhibă expresia MAPK.

  • EGCG (Ceai verde)
  • berberina
  • I3C (Broccoli Sprout)

VEGF (factorul de creștere endotelială vasculară) este adesea supraexprimat în cancer. VEGF stimulează creșterea, supraviețuirea și proliferarea celulelor vasculare (vasele de sânge spre tumoră).

  • Rădăcină de brusture-POTENT (Ceai esențial)
  • artemisinina
  • EGCG (Ceai verde)
  • Apigenina (telina)
  • I3C și Sulforafan (varză de broccoli)

EGFR (receptorul factorului de creștere a epidermei) este o proteină la suprafața celulelor. În mod normal, ajută celulele să crească și să se împartă. Substanțele de mai jos inhibă EGFR.

  • Curcumina
  • EGCG (Ceai verde)
  • Resveratrol (struguri negrii si inchis colorati afine mure )
  • Luteolina (Radicchio)
  • Apigenina (telina)
  • I3C – (varză , broccoli)
  • Berberine (Supliment)
  • Burdock (Essiac)
  • Ulei de semințe negre
  • Usturoi

Influența deprivării /lipsirii parțiale și complete a glutaminei și glucozei asupra liniilor celulare tumorigene de sân și cervicale

Abstract

fundal

Datorită cerințelor lor proliferative ridicate, celulele tumorigene posedă sisteme metabolice modificate, în care celulele utilizează cantități mai mari de glutamină și glucoză. Aceste cerințe metabolice alternează interesul de a investiga efectele concentrațiilor fiziologice non-tumorigene ale glucozei și glutaminei asupra celulelor tumorigene, deoarece deprivarea fie are ca rezultat un răspuns canonic al aminoacidului în celula de mamifer.

metode

Influența expunerii pe termen scurt a celulelor tumorigene asupra corelării cantităților descrescătoare de glutamină și glucoză a fost demonstrată într-o linie celulară mamăra metastatică înalt glicolitică și o linie celulară de carcinom cervical. Ulterior, celulele s-au propagat în mediu conținând concentrații fiziologice tipice de glutamină 1 mM și glucoză 6 mM timp de 7 zile. Efectele asupra morfologiei au fost investigate prin contrastul polarizării-difuziei optice difuzate prin lumină optică. Citometria de flux a fost utilizată pentru a demonstra efectele înfometării de glutamină și glucoză asupra progresiei ciclului celular și a inducerii apoptozei. De asemenea, s-au efectuat fluorometri pentru a investiga efectele asupra inducției apoptozei intrinseci (mitocaptura), producerii de specii reactive de oxigen (diacetat de 2,7-diclorofluoresceină) și formării veziculei acide (acridină portocalie).

Rezultate

Datele morfologice sugerează că deprivarea de glutamină și glucoză a dus la reducerea densității celulare și a celulelor rotunjite. înrolarea prin glutamina si glucoză au dus, de asemenea, la o creștere a fazei G2M și a unui vârf sub-G1. Înfometarea completă a glutaminei și a glucozei a dus la reducerea potențialului membranei mitocondriale în ambele linii celulare, cu celule MDA-MB-231 afectate mai mult în comparație cu celulele HeLa. Mai mult, celulele infometate nu au putut fi salvate suficient prin propagare, deoarece celulele au avut o creștere a speciilor de oxigen reactiv, a compartimentelor acide și a formării vacuolelor.

Concluzie

Înfometarea de la glutamină și glucoză pentru perioade scurte a dus la scăderea densității celulare, a celulelor rotunjite și la inducerea apoptozei prin generarea de specii reactive de oxigen și disfuncția mitocondrială. În plus, linia celulară metastatică a reacționat mai profund la înfometarea cu glutamină și glucoză datorită naturii lor foarte glicolitice. Salvarea celulară satisfăcătoare nu a fost posibilă deoarece celulele au demonstrat stresul oxidativ și potențialul membranar mitocondrial depolarizat. Acest studiu contribuie la cunoașterea efectelor in vitro și a transducției de semnal a deprivării de glucoză și / sau l-glutamină în liniile celulare tumorigene.

Introducere

Țesutul tumorigen are alte activități metabolice în comparație cu țesutul diferențiat, neproliferativ. Aceste activități metabolice modificate exercitate de tumori sunt necesare pentru natura foarte proliferativă a țesutului transformat și tumorigen [ 1 ]. În celulele tumorigene, apare o schimbare de la producerea de adenozin trifosfat (ATP) prin fosforilare până la generare prin intermediul glicolizei, chiar și în prezența oxigenului [ 2 ]. Glicoliza aerobă asociată cu cancer care are ca rezultat producerea de acid lactic și piruvat a fost descrisă cu aproape 100 de ani în urmă și este cunoscută sub numele de efect Warburg [ 2,3 ]. Inițial sa raportat că efectul se datorează disfuncției mitocondriale, însă cercetările ulterioare indică faptul că celulele canceroase preferă catabolismul glucozei prin glicoliză față de fosforilarea oxidativă, chiar dacă mitocondriile sunt competente [ 3 ]. Din moment ce glucoza este utilizată în principal pentru glicoliză, glutamina este utilizată ca substrat al ciclului acidului tricarboxilic mitocondrial (TCA) și pentru sinteza nicotinamidei adenin dinucleotid fosfat (NADPH) și sinteza acizilor grași [ 4 ].

Pe lângă glicoliza, celulele tumorigene sunt de asemenea dependente de glutaminoliză pentru scopuri de proliferare. Glutaminoliza este definită ca conversia glutaminei în glutamat. Acest proces furnizează carbon și azot utilizate pentru producerea de precursori energetici, biosintetici și reductivi pentru celulele tumorigene [ 5 ]. Astfel, celulele tumorigene utilizează în mod clar cantități mai mari de glutamină și glucoză, comparativ cu celule non-tumorigene și senestive.

Glucoza și glutamina sunt cele mai importante elemente de construcție necesare pentru metabolismul și proliferarea ulterioară și procesele tumorigene1 ]. Totuși, datorită cerințelor metabolice în mare măsură diferite ale celulelor tumorigene, este de interes și de importanță să se investigheze efectele fiziologice ale concentrațiilor non-tumorigene ale glucozei și glutaminei asupra celulelor tumorigene. Acest lucru este deosebit de important deoarece deprivarea rezultă într-un răspuns canonic al aminoacidului (ASS) în celulele mamifere [ 6 ]. În plus, studiile de exprimare a genei efectuate pe tumori primare și metastatice au demonstrat că celulele metastatice sunt mai mult dependente de glicoliză în comparație cu fosforilarea oxidativă [ 7 ].

Acest studiu a investigat astfel influența corelării cantităților descendente de glutamină și glucoză asupra morfologiei, a potențialului membranei mitocondriale, a speciilor de oxigen reactiv (ROS) și a formării veziculelor acide după expuneri pe termen scurt (2 ore, 4 ore, 6 ore) receptorul de estrogen, receptorul metastatic negativ al celulei mamare și o linie celulară de carcinom cervical. În plus, după expunere, mediul a fost înlocuit cu mediu care conține o concentrație fiziologică tipică de glutamină și glucoză (1 mM și, respectiv, 6 mM), prin care celulele au fost lăsate să se prolifereze timp de 7 zile, după care a fost studiată și influența acestei expuneri.

materiale si metode

Linii celulare

Linia celulară de adenocarcinom cervical uman (HeLa) și o linie celulară de adenocarcinom mamar cu metastaze ridicate (MDA-MB-231) au fost alese pentru a demonstra efectele mediului care constă în stări metabolice variabile. Linia celulară HeLa a fost achiziționată prin intermediul Sterilab Services (Pty) Ltd, Johannesburg, Africa de Sud, din Colecția Americană a Culturilor de Țesuturi (ATCC), Maryland, Statele Unite ale Americii. Linia celulară HeLa este cea mai veche și cea mai distribuită linie celulară imortalizată care prezintă o creștere agresivă și se dublează în medie la fiecare 24 de ore [ 8 ]. Principala sursă de energie în celulele HeLa este mai degrabă glutamina decât glucoza, ceea ce demonstrează că fosforilarea oxidativă este preferențială pentru a genera ATP [ 9 ]. În plus, celulele HeLa sunt capabile să-și adapteze rețeaua, structura și funcția mitocondrială, în funcție de baza substratului, pentru a genera energie exclusiv din fosforilarea oxidativă prin remodelarea mitocondriilor sale [ 10 ].

Linia celulară MDA-MB-231 a fost furnizată de Microsep (Pty) Ltd Johannesburg, Africa de Sud. MDA-MB-231 este o linie de celule tumorale tumorale triple negative. Acest lucru indică faptul că celulele MDA-MB-231 nu exprimă receptori pentru hormoni steroizi (estrogen și progesteron), receptorul tirozin kinazei tip II (RTK) Her-2, dar posedă o reglare a citokeratinelor bazale și a răspunsului factorului de creștere epidermal [ 11-13 ]. Mai mult, linia celulară MDA-MB-231 este extrem de metastatică și prezintă activitate glicolitică crescută în condiții normoxice [ 14 ]. Celulele MDA-MB-231 utilizează în principal glicoliză, mai degrabă decât respirația mitocondrială, pentru a produce energia necesară pentru funcționarea și proliferarea celulelor [ 15 ]. În plus, celulele MDA-MB-231 conțin mitocondriile care prezintă mutații ale acidului deoxiribonucleic (ADN), ceea ce duce la scăderea metabolismului oxidativ [ 16 ].

Reactivi generali

(DMEM), precum și glucoză înaltă (25,52 mM, 4500 mg / l ), l- glutamină (4 mM) și piruvat de sodiu (1 mM de glucoză, l- glutamină și piruvat de sodiu) , 110 mg / l) conținând DMEM, bicarbonat, lglutamină, glucoză, tripsină, violet cristal, NaCI, KCI, KH2PO4 și Na2HP04, acridină portocalie și diacetat de 2,7dichlorofluoresceină (DCF-DA) au fost furnizate de Sigma Chemical Co. (St Louis, Statele Unite ale Americii). Serul de vițel fetal inactivat în căldură (FCS), baloane și plăci de culturi sterile sterile au fost obținute prin Sterilab Services (Kempton Park, Johannesburg, Africa de Sud). Penicilina, streptomicina și fungizona au fost achiziționate de la Highveld Biological Ltd (Pty). (Sandringham, Gauteng, Africa de Sud).

Proceduri generale de cultură celulară

Celulele s-au crescut și s-au menținut în baloane de cultură de țesut de 25 cm2 într-o atmosferă umidificată la 37 ° C, 5% C02 într-un incubator cu manșon de apă Forma Scientific (Ohio, Statele Unite ale Americii).Celulele au fost cultivate în DMEM cu glucoză 25,52 mM, l- glutamină 4 mM și piruvat de sodiu 1 mM suplimentat cu 10% ser fetal de vițel inactivat termic (56 ° C, 30 min), 100 U / ml penicilină G, 100 pg / ml streptomicină și fungizonă (250 μg / l). Mediile în funcție de starea metabolică au fost preparate 24 ore înainte de expunere și au fost autoclavate pentru a asigura sterilitatea.

Celulele au fost expuse la diferite condiții metabolice, după cum se descrie mai jos:

Control: DMEM cu glucoză 25,52 mM, l- glutamină 4 mM și piruvat de sodiu 1 mM suplimentat cu FCS inactivat termic 10% (56 ° C, 30 min), 100 U / ml penicilină G, 100 pg / ml streptomicină și fungizonă (250 pg / l).

Condiția experimentală 1: DMEM cu glucoză 6 mM, l- glutamină 1 mM și piruvat de sodiu 0 mM suplimentat cu FCS inactivat termic 10% (56 ° C, 30 min), 100 U / ml penicilină G, 100 ug / ml streptomicină și fungizonă (250 pg / l).

Condiția experimentală 2: DMEM cu glucoză 3 mM, l- glutamină 0,5 mM și piruvat de sodiu 0 mM suplimentat cu FCS inactivat termic 10% (56 ° C, 30 min), 100 U / ml penicilină G, 100 pg / ml streptomicină și fungizonă (250 pg / l).

Condiția experimentală 3: DMEM cu glucoză 0 mM, l- glutamină 0 mM și piruvat de sodiu 0 um suplimentat cu FCS inactivat termic 10% (56 ° C, 30 min), 100 U / ml penicilină G, 100 pg / ml streptomicină și fungizonă (250 pg / l).

Control pozitiv: Mediul de creștere care conține 0,1 pg / ml actinomicină D a fost utilizat drept control pozitiv pentru a induce moartea celulelor prin apoptoză.

Proceduri experimentale generale pentru expuneri pe termen scurt și experimente de recuperare:

Expunere pe termen scurt: Celulele au fost însămânțate la 500 000 de celule pe flacon de 25 cm2 sau 5000 celule / godeu în plăci cu microunde Nunc F96 (AEC-Amersham Soc (Ltd), Kyalami, Africa de Sud).După 24 de ore, celulele au fost expuse la diferite condiții metabolice timp de 2 ore, 4 ore și 6 ore. Ulterior, toate metodele experimentale s-au desfășurat așa cum este descris mai jos.

Experimentul de recuperare: Celulele au fost însămânțate la 60 000 de celule pe flacon de 25 cm2 sau 850 celule / godeu în plăci cu microunde Nunc F96 (AEC-Amersham Soc (Ltd), Kyalami, Africa de Sud).După 24 de ore, celulele au fost expuse la diferite condiții metabolice timp de 2 ore, 4 ore și 6 ore. Ulterior, celulele au fost spălate cu PBS și mediu a fost înlocuit cu DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină. Mediul a fost ulterior înlocuit la fiecare 2 zile. Ulterior, toate metodele experimentale s-au desfășurat așa cum este descris mai jos.

Polarizare – contrast optic de interferență diferențial luminos

Contrastul de interferență diferențială difuză prin contrast polarizator (PlasDIC) este o metodă de contrast utilizată pentru vizualizarea morfologiei. PlasDIC afișează profilul de fază necesar, care este relativ la produsul grosimii secțiunii și diferența dintre indicele de refracție dintre mediul înconjurător și indicele mediu de refracție al cuarțului. PlasDIC are imagistică DIC de înaltă calitate a celulelor individuale, a clusterelor celulare și a celulelor individuale groase în vasele de culturi de celule plastice [ 16 , 17 ].PlasDIC s-a efectuat în conformitate cu Visagie și colab. 17 ].

Progresia ciclului celular și inducerea apoptozei

Citometria de flux a fost utilizată pentru a măsura conținutul de ADN al celulelor după expunerea la diferitele condiții metabolice și pentru a monitoriza efectul asupra progresiei ciclului celular [ 18 ]. Aceasta din urmă a fost realizată prin fixarea etanolului și colorarea cu iodură de propidiu care a fost realizată conform lui Mqoco și colab. 16 ]. Ciclul ciclului Fluorescența de iodură de propidiu a fost măsurată cu ajutorul citometrului de debit al sistemului de fluorescență (FACS) FC500 (Beckman Coulter South Africa (Pty) Ltd). Datele din cel puțin 10 000-30 000 de evenimente au fost analizate cu ajutorul softului CXP (Beckman Coulter South Africa (Pty) Ltd. (Pretoria, Gauteng, Africa de Sud) Distribuțiile ciclului celular au fost calculate cu Cyflogic 1.2.1 lansat 2008/11/19 (Perttu Terho & Cyflo Ltd) prin atribuirea conținutului relativ de ADN pe celulă la fracțiunile sub-G1, G1, S și G2M.

Potențialul membranei mitocondriale

O reducere a potențialului membranei mitocondriale este un indicator timpuriu al inducției apoptozei [ 19 ].Modificările în potențialul membranei mitocondriale au fost investigate folosind anticorpul mitocaptural BIOCOM biotech Pty (Ltd) (Clubview, Africa de Sud.) Mitocapture este un colorant cationic care se acumulează în mitocondriile celulelor sănătoase, însă Mitocapture nu este capabil să se acumuleze în mitocondriile celulele apoptotice datorită potențialului membranei mitocondriale modificate și prin urmare Mitocaptura rămâne în citoplasmă în forma sa monomerică (verde) [ 20 ]. După ce s-au urmat procedurile experimentale generale menționate mai sus, soluția diluată Mitocapture (amestecată conform instrucțiunilor furnizorilor) a fost au fost incubate timp de 60 de minute într-o atmosferă umidificată (37 ° C, 5% C02), probele fiind apoi incubate, fluorescența a fost măsurată la lungimea de undă de excitație de 485 nm și lungimea de undă de emisie de 520 nm utilizând fluorometria Departamentul de Farmacologie, Universitatea din Pretoria).

Generarea peroxidului de hidrogen

Generarea peroxidului de hidrogen a fost măsurată utilizând diacetat de 2, 7-diclorofluoresceină (DCFDA).DCFDA, o sondă nefluorescentă, care, după oxidare prin ROS și peroxizi, este transformată în DCF derivat puternic fluorescent [ 21 ]. După ce au fost urmate procedurile experimentale generale menționate mai sus, DCF-DA (200 pl, 10 uM) a fost pipetată la toate probele și apoi a fost incubată timp de 60 de minute într-o atmosferă umidificată (37 ° C, 5% CO2. la lungimea de undă de excitație de 485 nm și lungimea de undă de emisie de 520 nm utilizând fluorometria (Departamentul de Farmacologie, Universitatea din Pretoria).

Colorarea portocaliei de acridină

Acidina portocalie este un compus fluorescent lizosomotrop care se mișcă liber în membranele celulare atunci când este descărcat [ 22 ]. Cu toate acestea, acridina portocalie se acumulează în forma sa protonată în compartimentele acide și astfel servește ca un marker pentru organele veziculare acide, inclusiv vacuolele autofagice și lizozomii [ 22 ]. După ce s-au urmat procedurile experimentale generale menționate mai sus, s-a adăugat PBS conținând acridină portocală (200 pl, 5 mg / ml) la toate probele și probele au fost incubate timp de 60 de minute într-o atmosferă umidificată (37 ° C, 5% . Fluorescența a fost măsurată la lungimea de undă de excitație de 485 nm și lungimea de undă de emisie de 520 nm folosind fluorometria (Departamentul de Farmacologie, Universitatea din Pretoria).

Statistici

Au fost efectuate cel puțin trei experimente independente pentru toate tehnicile. Fiecare experiment independent fluorometric a avut o dimensiune a probei de 3. Valorile medii ale fiecărui experiment au fost reprezentate în bare grafice, cu barele T referindu-se la deviațiile standard. Valorile P <0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic și au fost indicate printr-un asterisc (*). Datele privind progresia ciclului celular de la cel puțin 10 000-30 000 de evenimente au fost analizate utilizând software-ul CXP (Beckman Coulter Africa de Sud (Pty) Ltd. (Pretoria, Gauteng, Africa de Sud)).Distribuțiile ciclului celular au fost calculate cu Cyflogic 1.2.1 lansat în 2008/11/19 (Perttu Terho & Cyflo Ltd).

Rezultate

Degradarea glucozei și l- glutaminei duce la scăderea densității celulare și a celulelor rotunjite

Contrastul de interferență diferențială a difuziei optice difuzate prin contrastul polarizării (PlasDIC) a fost utilizat pentru a demonstra efectele deprivării glucozei și glutaminei asupra morfologiei liniei celulare epiteliale HeLa cervicală și a liniei celulare de celule mamare negative a receptorului estrogen metastatic.Deprivarea de glucoză și glutamină, indiferent de concentrațiile medii individuale, timp de 2 ore, a condus la o ușoară scădere a densității celulare în ambele linii celulare în comparație cu celulele propagate în mediu de creștere (Figura 1 ). Celulele erau încă atașate cu cele mai multe celule prezente în metafază.Celulele rotunjite și scintilate au fost de asemenea observate în celulele propagate în mediu cu glucoză 0-3 mM și glutamină 0-0,05 mM. În plus, cu cât sunt mai mici cantitățile de glucoză și glutamină, cu atât densitatea celulară este mai mică comparativ cu celulele propagate în mediul de creștere, ceea ce implică faptul că atât glucoza, cât și glutamina au roluri esențiale în proliferare și morfologie.

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig1_HTML.jpg

Imaginile PlasDIC după expuneri pe termen scurt (2 ore, 4 ore, 6 ore) de foame de glutamină și de glucoză.Imaginile PlasDIC ale celulelor HeLa și MDA-MB-231 propagate în medii în funcție de starea metabolică și celule expuse actinomicinei D timp de 2 ore, 4 ore și 6 ore. Expunerea la DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 2 ore a dus la scăderea densității celulare. Expunerea la DMEM conținând glucoză 0 mM-3 mM și l -glutamină 0 mM-0,5 mM timp de 2 ore a determinat scăderea densității celulare și a celulelor scutite rotunjite. După 4 h, celulele propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină au prezentat o densitate scăzută a celulelor și celule rotunjite scrâșnite. Celulele propagate în mediu care conține cantități mici de glucoză și glutamină sau fără glucoză și glutamină timp de 4 ore au demonstrat densitatea celulară descrescătoare și numărul crescut de celule care apar rotunjite și scintilate în comparație cu celulele expuse la DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină și celule propagate în mediu de creștere.Celulele propagate în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 6 ore au demonstrat densitatea celulară scăzută și prezența unor celule rotunjite scrâșnite. Acesta din urmă a fost de asemenea observat cu celulele propagate în DMEM conținând glucoză 3 mM și l- glutamină 0,5 mM timp de 6 ore.Celulele propagate în DMEM conținând 0 mM glucoză și 0 mM glutamină timp de 6 ore au demonstrat, de asemenea, prezența unor celule rotunjite și scăderea densității celulare. Acesta din urmă a fost mai pronunțat în comparație cu celulele propagate în DMEM conținând glucoză 3-6 mM și mediu de creștere de l- glutamină 0,5-1 mM timp de 6 ore. După o expunere de 6 ore, celulele au fost în cea mai mare parte prezente în interfază cu celule încă atașate. Bara de scală în toate imaginile reprezintă 50 μm

PlasDIC a fost, de asemenea, utilizat pentru a demonstra deprivarea de glucoză și glutamină timp de 4 ore pe morfologia celulelor în celule HeLa și MDA-MB-231 (figura 1 ). După o expunere de 4 ore la DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină, densitatea celulară este scăzută cu prezența unor celule rotunjite în ambele linii celulare. Alte reduceri la glucoză 3 mM și l- glutamină 0,5 mM însoțită de expunere timp de 4 ore au demonstrat scăderea densității celulare și a numărului crescut de celule rotunjite și scintilate. Deprivarea completă a glutaminei și a glucozei timp de 4 ore a dus la o reducere suplimentară a densității celulare, însoțită de prezența celulelor rotunjite și scutite. Cu toate acestea, toate celulele au rămas atașate după expunere și majoritatea celulelor au ocupat interfața. Mai mult, densitatea celulară a fost redusă mai proeminent după expunerea timp de 4 ore la mediul metabolic în comparație cu expunerea de 2 h.

Efectele deprivării glutaminei și glucozei asupra morfologiei au fost, de asemenea, investigate după 6 h (Figura 1 ). Celulele propagate în DMEM conținând glucoză 3-6 mM și l- glutamină 0,5-1 mM timp de 4 ore au demonstrat scăderea densității celulare și prezența unor celule rotunjite scrâșnite. Celulele propagate în mediu care nu conține glutamină și glucoză au demonstrat, de asemenea, prezența unor celule rotunjite și scăderea densității celulare. Acesta din urmă a fost mai pronunțat în comparație cu celulele propagate în DMEM conținând glucoză 3-6 mM și l- glutamină 0,5-1 mM. Ca și în cazul expunerilor timp de 2 ore și 4 ore, celulele au fost în cea mai mare parte prezente în interfaza cu celulele încă atașate.

Morfologia celulelor a fost, de asemenea, investigată în ceea ce privește posibilele recuperări și efectele pe termen lung ale concentrațiilor fiziologice tipice de glucoză și L-glutamină. Celulele HeLa și MDA-MB-231 au fost expuse în funcție de condiții metabolice variabile timp de 2 ore și 4 ore și 6 ore după care celulele au fost spălate și ulterior mediul a fost înlocuit cu DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 7 zile (Fig.2). Morfologia și densitatea celulară după 7 zile, prezentate cu celule scintite și formă alungită adesea însoțite de proeminențe de celule. Celulele MDA-MB-231 și HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 2 ore și 4 ore și lăsate 7 zile înainte de recuperare au demonstrat o dimensiune redusă a celulei și celulele MDA-MB-231 au fost alungite. Celulele propagate în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 6 ore și lăsate 7 zile înainte de recuperare au demonstrat o dimensiune mai mare a dimensiunilor celulare și morfologia celulară alungită în ambele linii celulare. Celulele expuse la mediu care conține 0-0,5 mM L-glutamină și 3 mM glucoză au demonstrat, de asemenea, scăderea densității celulare și mărirea dimensiunii celulei în ambele linii celulare. Celulele MDA-MB-231 expuse la aceste condiții au demonstrat, de asemenea, celule alungite.Această tendință a devenit din ce în ce mai proeminentă, având o expunere crescută la ambele stări metabolice, atât cu cele două linii celulare, care au o morfologie alungită la 4 ore și 6 ore de expunere după 7 zile de recuperare, când au fost însoțite anterior cu celule neatasate.

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig2_HTML.jpg

Salvarea nereușită a HeLa și MDA-MB-231 după 7 zile. Celulele HeLa și MDA-MB-231 propagate în mediu în starea metabolică timp de 2 ore, 4 ore și 6 ore, cu 7 zile în urmă, după care celulele au fost spălate și mediu a fost înlocuit cu DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină . Efectele scăderii concentrațiilor de l-glutamină și glucoză au fost mai pronunțate la 7 zile după expunere în comparație cu cele din ziua expunerii.Efectele asupra densității celulare scăzute au fost, de asemenea, mai severe. Caracteristicile morfologice observate includ scăderea densității celulare, dimensiunea redusă a celulei și alungirea. Toate caracteristicile morfologice menționate mai sus au fost mai proeminente în DMEM conținând glucoză 0 mM și l- glutamină 0 mM în comparație cu celulele propagate în DMEM conținând glucoză 3 mM-6 mM și l -glutamină 0,5 mM-1 mM. Același lucru este valabil și pentru expunerile de 6 ore comparativ cu expunerile de 2 ore și 4 ore. Totuși, toate efectele menționate anterior au apărut mai devreme în linia celulară MDA-MB-213 în comparație cu linia de celule HeLa (mărire de 20x). Bara de scală în toate imaginile reprezintă 50 μm

Toate caracteristicile morfologice ale mărimii scurte a celulelor și alungirii au crescut cu cantități scăzute de L-glutamină și glucoză și perioade de expunere mai lungi. Totuși, toate efectele menționate anterior au apărut mai devreme în linia de celule MDA-MB-213 în comparație cu linia de celule HeLa care indică faptul că stările metabolice influențează linia celulară foarte metastatică mai proeminent. Mai mult, aceste date morfologice sugerează că există efecte de durată după ce celulele sunt lipsite de nutrienți, chiar și după ce mediul a fost înlocuit cu mediu care conține concentrații fiziologice ale nutrienților.

Dependența de glucoză dependentă de glucoză și deprivarea de l- glutamină determină apariția apoptozei și modificarea ciclului celular

Influența acestor medii diferite asupra progresiei ciclului celular a fost investigată utilizând fixarea etanolului, colorarea cu iodură de propidiu și citometria de curgere. Expunerea celulelor Hela și MDA-MB-231 la mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină a dus la creșterea numărului de celule în faza sub-G1, la scăderea numărului de celule care ocupă faza G1 și la un creșterea celulelor în faza G2M cu modificări nesemnificative statistic între expunere timp de 2 ore, 4 ore și 6 ore (tabelul 1 și figura 3 ).Schimbările în progresia ciclului celular au fost progresiv mai pronunțate atunci când celulele au fost expuse la mediu conținând cantități mai scăzute de glucoză și l- glutamină. În plus, influența mediilor în funcție de starea metabolică asupra progresiei ciclului celular a fost progresiv mai mare între diferite perioade de expunere atunci când mediul conține cantități descrescătoare de glucoză și l- glutamină.

tabelul 1

Histogramele de evoluție a ciclului histologic ale celulelor HeLa și MDA-MB-231 propagate în medii în funcție de starea metabolică pentru perioada de expunere adecvată (2 ore, 4 ore și 6 ore) (valoare P <0,05)

Probă Profil histogramă
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figa_HTML.gif
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figb_HTML.gif
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figc_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figd_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fige_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figf_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 3 mM glucoză și 0,5 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figg_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 3 mM glucoză și 0,5 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figh_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu care conține glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figi_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figj_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figk_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figl_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 2 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figm_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 4 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fign_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 6 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figo_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figp_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figq_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figr_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 2 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figs_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 4 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figt_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 6 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figu_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figv_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figw_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 0 mM și L-glutamină 0 mM timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figx_HTML.gif
Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig3_HTML.jpg

Progresia ciclului celular după expunerea parțială și completă la glutamină și glucoză pentru expuneri pe termen scurt și după 7 zile. Procentul de celule care ocupă fiecare fază a ciclului celular după ce celulele s-au propagat în mediu în funcție de starea metabolică pentru perioada de expunere adecvată (2 ore, 4 ore și 6 ore).Celulele Hela propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină au demonstrat o fracție crescută de sub-G1 și G2M. Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină au arătat de asemenea o fracție sub-G1 crescută. Celulele MDA-MB-231 și HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină au demonstrat o fracție crescută de sub-G1 și G2M.Celulele HeLa și MDA-MB-231 propagate în mediu care nu conține glucoză sau L-glutamină au demonstrat o creștere a numărului de celule apoptotice, iar celulele HeLa au prezentat de asemenea o creștere a fracției G2M. Efectele asupra ciclului celular și inducerea apoptozei în ziua 7 prin intermediul citometriei de curgere utilizând colorarea cu iodură de propidiu au arătat o inducție semnificativă a apoptozei în toate probele tratate.Celulele Hela- și MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină cu 7 zile înainte, de asemenea, au demonstrat o creștere a numărului de celule care ocupă faza S. Celulele MDA-MB-231 au prezentat, de asemenea, o creștere de 2 M. Celulele HeLa propagate în mediu care conține glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM s-au prezentat, de asemenea, cu o fracție G2M mărită. Celulele MDA-MB-231 propagate în DMEM conținând glucoză 0 mM-3 mM și l -glutamină 0 mM-0,5 mM au demonstrat un număr crescut de celule în faza S. Celulele Hela propagate în mediu care conține glucoză 0 mM și L-glutamină 0 mM timp de 2 ore și 4 ore au prezentat, de asemenea, o fază S crescută. Un asterisc (*) indică valoarea P <0,05

Expunerea la mediu conținând glucoză 3 mM și l- glutamină 0,5 mM în celule Hela timp de 2 ore a condus la 11% din celule fiind prezente în faza sub-G1, 63% în faza G1, 7% în faza S și 19% în faza G 2 M.Totuși, după 4 ore, 14% din celule s-au aflat în faza sub-G1, 48% în faza G1, 8% în faza S și 31% în faza G2M. După 6 ore de expunere, 15% dintre celule au fost în faza sub-G1, 34% în faza G1, 8% în faza S și 43% în faza G2M. Mediul de expunere care conține glucoză 3 mM și l- glutamină 0,5 mM în MDA-MB-231 timp de 2 ore a condus la prezența a 9% din celule în faza sub-G1, 46% în faza G1, 15% fază și 30% în faza G 2 M. După expunerea la mediu conținând 3 mM glucoză și 0,5 mM glutamină timp de 4 ore, 10% din celule au fost în faza Sub-G1, 59% în faza G1, 10% în faza S și 21% faza G2M. După 6 ore de expunere, 21% dintre celule au fost în faza sub-G1, 54% în faza G1, 10% în faza S și 16% în faza G2M.Aceste tendințe au continuat cu expunerea celulelor la mediu conținând glucoză 0 mM și l- glutamină 0 mM.

În plus, s-au investigat și efectele de salvare și pe termen lung ale concentrațiilor fiziologice de glucoză și L-glutamină. Aceasta s-a realizat prin expunerea liniilor celulare la mediu în funcție de diferite condiții metabolice pentru perioada corespunzătoare înainte ca celulele să fie spălate cu PBS și mediul a fost înlocuit cu glucoză 6 mM și 1 mM glutamină (mediu a fost înlocuit la fiecare 2 zile). Efectele asupra ciclului celular și inducerea apoptozei în ziua 7 sunt demonstrate în tabelul 2 și în figura 3 . Celulele care se referă la acest grup de expunere au prezentat date privind progresia ciclului celular care indică o inducere semnificativă a apoptozei. Fracțiunile sub-G1 au crescut cu scăderea cantităților de glucoză și l- glutamină și creșterea perioadelor de expunere (2 ore, 4 ore și 6 ore).

tabel 2

Histogramele de evoluție a ciclului histologic ale celulelor HeLa și MDA-MB-231 propagate în medii în funcție de starea metabolică pentru perioada de expunere adecvată (2 ore, 4 ore și 6 ore) cu 7 zile în urmă, care după spălarea celulelor și înlocuirea mediului cu condiția 1 mediu (valoare P<0,05)

Probă Profil histogramă
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figy_HTML.gif
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figz_HTML.gif
Celulele HeLa s-au propagat în mediu de creștere timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figaa_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figab_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figac_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figad_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 3 mM glucoză și 0,5 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figae_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 3 mM glucoză și 0,5 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figaf_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu care conține glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figag_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figah_HTML.gif
Celule HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figai_HTML.gif
Celulele HeLa propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figaj_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 2 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figak_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 4 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figal_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere timp de 6 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figam_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figan_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern care conține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figao_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină timp de 6 ore Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figap_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figaq_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figar_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 3 mM și L-glutamină 0,5 mM timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Denumirea obiectului este 13578_2015_30_Figas_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 2 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figat_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând 0 mM glucoză și 0 mM L-glutamină timp de 4 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Figau_HTML.gif
Celulele MDA-MB-231 propagate în mediu conținând glucoză 0 mM și L-glutamină 0 mM timp de 6 ore Un fișier extern de îngrijire deține o imagine, o ilustrație etc. Obiectul nume este 13578_2015_30_Figav_HTML.gif

Celulele Hela și MDA-MB-231 propagate în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 7 zile au demonstrat atât o creștere a celulelor apoptotice (faza sub-G1), cât și o creștere a fazei S. Celulele MDA-MB-231 prezintă, de asemenea, o fază G2 M mărită atunci când sunt expuse la DMEM conținând glucoză 6 mM și l- glutamină 1 mM în întregime. Celulele Hela propagate în DMEM conținând glucoză 3 mM și l- glutamină 0,05 mM și lăsate la 7 zile de recuperare propagate în DMEM conținând glucoză 6 mM și l- glutamină 1 mM prezentată, de asemenea, cu un vârf apoptotic sub-G1 și o fază G2M mărită.Celulele MDA-MB-231 expuse la DMEM conținând glucoză 3 mM și l- glutamină 0,5 mM au prezentat o creștere foarte proeminentă în faza S. Toate creșterile menționate mai sus ale numărului de celule care ocupă respectivele faze ale ciclului celular au fost asociate cu o scădere corespunzătoare a celulelor care ocupă faza G1. Celulele HeLa expuse la DMEM care nu conține glucoză sau l- glutamină pentru perioade scurte de expunere și au permis o recuperare de 7 zile în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină au arătat o creștere a numărului de celule care ocupă faza S.MDA-MB-231 celule expuse la DMEM care nu conține glucoză sau l -glutamină pentru perioade de expunere scurtă și permis de 7 zile de recuperare în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM l -glutamină a dus la o creștere a numărului de celule în faza S ; cel mai proeminent în 2 h, urmat de 4 h și în final de 6 h însoțită de o creștere constantă a numărului de apoptoză (sub-G 1 ) celule și numărul de celule din G 1 faza.

Degradarea/lipsa glucozei și l- glutaminei duce la depolarizarea potențialului membranei mitocondriale

Acest studiu a investigat în continuare inducerea apoptozei prin demonstrarea efectului diferitelor condiții metabolice asupra potențialului membranei mitocondriale. Calea apoptotică intrinsecă implică pierderea potențialului de membrană mitocondrială rezultând eliberarea citocromului c și activarea ulterioară a caspazei [ 9 ]. Rezultatele au indicat că potențialul membranei mitocondriale a celulelor expuse la DMEM care nu conțin glucoză sau l -glutamină a fost afectată cel mai mult în ambele linii de celule (Fig. 4a și șib).b). În plus, celulele MDA-MB-231 au fost, de asemenea, mai afectate în general, în comparație cu celulele HeLa. Recuperarea și formarea de colonii după 7 zile de propagare în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM l -glutamină au indicat faptul că celulele MDA-MB-231 sunt în continuare afectate mai vizibil (Fig. 4c și șid).d ). Celulele HeLa au prezentat, de asemenea, un număr semnificativ de celule care posedă un potențial redus de membrană mitocondrială după expunerea la mediu care nu conține glucoză sau l-glutamină, chiar 7 zile după retragerea mediului și înlocuirea cu DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM l-glutamină. MDA-MB-231 a fost afectată de orice variație a stării metabolice a mediei cu DMEM conținând glucoză 0-3 mM și l- glutamină 0-0,5 mM rezultând cel mai vizibil prezentat potențial al membranei mitocondriale reduse.

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig4_HTML.jpg

Potențialul membranei potențialului mitocondrial, după expunerea parțială și completă la glutamină și glucoză, pentru expuneri pe termen scurt și după 7 zile. Potențialul membranei mitocondriale a celulelor HeLa ( a ) și a celulelor MDA-MB-231 ( b ) expuse la mediu constând în diferite condiții metabolice. Celule expuse la mediu care nu conține glucoză sau l- glutamină au fost singurele probe cu potențial redus de membrană mitocondrială care indică inducerea apoptozei. Fluorometria și mitocaptura au demonstrat că recuperarea nereușită și formarea coloniilor au demonstrat că linia de celule HeLa ( c ) a fost afectată mai puțin decât linia celulară MDA-MB-231 ( d ). S-au observat mici modificări la celulele HeLa expuse la DMEM conținând glucoză 3 mM-6 mM și l -glutamină 0,5 mM-1 mM. Cu toate acestea, celulele expuse la mediu conținând glucoză 0 mM și L-glutamină 0 mM au demonstrat o schimbare semnificativă statistic în potențialul membranei mitocondriale. Cu privire la liniile celulare MDA-MB-231, toate cele trei stări metabolice au afectat  potențiale celulare ale membranei mitocondriale expuse la DMEM conținând glucoză 0 mM-3 mM și l-glutamină 0 mM-0,5 mM cea mai proeminentă. Un asterisc (*) indică valoarea P <0,05

Restabilirea celulară nereușită demonstrează creșterea generării de peroxid de hidrogen

Producția de peroxid de hidrogen a fost determinată prin intermediul unui DCFDA care, după oxidare prin ROS și peroxizi, este transformat în DCF derivat puternic fluorescent [ 21 , 22 ]. Expunerea la diferite medii nu au schimbat producția de peroxid de hidrogen , în primele șase ore după expunere (Fig. 5a și și.b ). Totuși, rezultatele liniilor celulare au permis recuperarea după 7 zile după propagarea timp de 7 zile în DMEM conținând glucoză 6 mM și l- glutamină 1 mM au demonstrat că efectele diferitelor medii metabolice au afectat în continuare funcționarea celulară și producerea de ROS după înlocuirea cu DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM 1-glutamină așa cum este indicat de creșterea producției ROS în toate liniile de celule expuse la medii metabolice variate (Fig. 5c și șid).d ). In linia de celule HeLa, producția ROS a crescut mai vizibil atunci când este expus la DMEM conținând glucoză 6 mM și 1 mM l -glutamină urmată de scăderea sumelor și glutamină conținând glucoză. Rezultatele au arătat, de asemenea, că celulele MDA-MB-231 propagate în mediu de creștere au produs cantități mai mari de ROS posibil datorită naturii lor înalt glicolitic și metastatic. Totuși, mediile metabolice au crescut, de asemenea, producția lor de ROS, cel mai vizibil prin DMEM conținând 3 mM glucoză și 0,05 mM l- glutamină .

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig5_HTML.jpg

Producția de peroxid de hidrogen după expunerea parțială și completă la glutamină și glucoză pentru expuneri pe termen scurt și după 7 zile. Generarea peroxidului de hidrogen în celulele HeLa ( a ) și MDA-MB-231 ( b ) după expunerea la medii care prezintă diferite condiții metabolice nu s-a schimbat în nici un fel semnificativ din punct de vedere statistic (valoare P > 0,05). În plus, recuperarea celulelor prin propagarea celulelor HeLa expuse ( c ) și MDA-MB-231 ( d ) în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM glutamină timp de 7 zile a fost nereușită și a demonstrat creșterea producției de peroxid de hidrogen. Un asterisc (*) indică valoarea P <0,05

Eșecul celulelor nereușite demonstrează creșterea colorării lizozomale

Acidina portocalie este un compus fluorescent lizosomotrop care se mișcă liber în membranele celulare atunci când este descărcat. Totuși, acridina portocalie se acumulează în compartimentele sale acide de formare protonată și servește astfel ca un marker pentru organele veziculare acide, incluzând vacuole autofagice și lizozomi [ 23 ]. Expunerea inițială de 6 h la mediu care constă din diferite stări metabolice nu au ca rezultat o colorație a crescut semnificativ lizozomale în oricare linie de celule (Fig. 6a și șib).b ). Celulele care au fost expuse la diferite stări metabolice, urmate de recuperarea timp de 7 zile în DMEM conținând 6 mM glucoză și 1 mM l-glutamină a demonstrat o colorare lizozomale crescută indică o creștere în compartimentele acide și formarea de vacuole (Fig. 6c și anddd ).

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 13578_2015_30_Fig6_HTML.jpg

Colorarea portocalie de acridină după înjunghierea parțială și completă a glutaminei și a glucozei pentru expuneri pe termen scurt și după 7 zile. Culoarea portocalie de acridină a celulelor HeLa ( a ) și MDA-MB-231 ( b ) după expunerea la medii care prezintă diferite condiții metabolice. Producția de portocale de acridină nu s-a schimbat în nici un fel semnificativ din punct de vedere statistic atunci când a fost expusă acestor condiții metabolice (valoare P > 0,05). Colorarea portocaliei de acridină și formarea coloniilor după 7 zile în celulele HeLa ( c ) și MDA-MB-231 ( d ). Rezultatele au demonstrat că deprivarea de glucoză și glutamină afectează zilele de funcționare a celulelor după expunere, fiind întreruptă cu toată expunerea la medii condiționate, ceea ce demonstrează o creștere a colorării acridinei portocalii, ceea ce sugerează o creștere a acidității. Un asterisc (*) indică valoarea P <0,05

Discuţie

Celulele canceroase exercită mai multe mutații genetice intrinseci (care afectează p53, MYC, AMPK, PI3K și HIF1) și răspunsuri extrinseci la mediul tumoral (hipoxie și aciditate). Acest lucru are ca rezultat un metabolism celular modificat, generând cantități mari de ATP, rezultând proliferarea sporită, sinteza macromoleculară crescută și echilibrul unei homeostaze redox delicate [ 2 ].

Multe celule tumorigene metabolizează cantități mult mai mari de glucoză decât lactatul în glicoliza aerobă. Acest lucru este cunoscut ca efectul Warburg și acest lucru apare chiar și în prezența respirației mitocondriale [ 24 ]. O sursă majoră de energie în metabolizarea celulară este glucoza care este metabolizată în piruvat în glicoliză și oxidată în continuare pentru a forma dioxid de carbon generând ATP în ciclul acidului tricarboxilic. Metabolismul glutaminei contribuie la precursorii biomasei deoarece este o sursă majoră de carbon și azot [ 25 ].

Acest studiu a investigat necesitatea de glucoză și l- glutamină în proliferarea și funcționarea celulelor(canceroase). Acest lucru a fost realizat prin demonstrarea efectelor mediilor cu stări metabolice diferite, care conțin concentrații scăzute de glucoză sau l- glutamină, într-o linie celulară de adenocarcinom cervical uman (HeLa) și o linie celulară de adenocarcinom mamar cu metastaze (MDA-MB-231) pe morfologie , progresia ciclului celular, generarea de peroxid de hidrogen și moartea celulară prin inducerea apoptozei și autofagiei.

Constatările morfologice demonstrează că scăderea cantităților de glucoză și l- glutamină în mediul de creștere a dus la scăderea densității celulare în ambele linii celulare. Aceste efecte au fost mai pronunțate la 7 zile după ce mediul de expunere a fost înlocuit cu mediu conținând 6 mM glucoză și 1 mM L-glutamină. Deoarece glucoza este o sursă esențială de carbon și energie necesară pentru supraviețuirea și proliferarea celulară, deprivarea glucozei are ca rezultat o eșec al inducției enzimelor glicolitice cu încetarea ulterioară a diviziunii celulare26 ]. De asemenea, s-a descoperit că privarea de glucoză induce citotoxicitatea în linia celulară de carcinom multirezistent (MCF-7 / ADR). În decurs de 10 minute, mai multe căi de semnalizare incluzând proteine ​​kinazele reglementate extracelular (ERK1 / 2), Lyn Kinase (o srcfamily kinase) și c-Jun kinaza N-terminală (JNK) au fost activate. Activarea ERK1 / 2 are ca rezultat generarea ulterioară a ROS crescută. ERK1 / 2 sunt membri ai familiei protein kinazei activate mitogen (MAPK) [ 27]. MAPK este responsabil pentru fosforilarea substraturilor nucleare, inclusiv factorii de transcripție reglementați redox ( c- Myc și c- fos) implicați în răspunsurile celulare la stresul oxidativ [ 28 ].

Date progresie celulare au sugerat ca privarea de glutamină și glucoză a dus la un G 2 M bloc după 2-6 h în linia de celule HeLa și 2-4 h în linia de celule MDA-MB-231 însoțit cu o inducere crescută a apoptozei în ambele linii celulare. Privarea de glucoză într – o linie de celule murine non-leukemic (32Dcl23), transformată 32Dcl23 linie celulară și linia celulară de fibrosarcom (KHT-C2-LP1) , de asemenea , a condus la intrerupere G 2 M  [ 29 , 30 ]. Mai mult, a fost larg raportat că rezultatele privării de glutamină în celulă intrerupe ciclu g1 în celulele netransformate. Privarea Glutamina într – o linie de celule umane hepatocarcinom (Hep3B) a condus la exprimarea semnificativă modificată a genelor legate de G 2Faza M și punctul de control al vătămării ADN, incluzând oprirea creșterii și AD 45-inducibil, gama (GADD45G) [ 31 ]. Abcouver și colab. [ 32 ] au raportat, de asemenea, că privarea de glutamină în celulele mamare carcinom ductal primar (TSE) și celulele epiteliale mamare (HBL) a dus la o creștere rapidă a transcripției GADD45 și a ADN-ului inductibil cu deteriorarea ADN 3 (GADD153). Ciclul celular de date progresie a demonstrat , de asemenea , un număr crescut de celule care ocupă G 2 faza M dupăe privarea de glutamină. stop celule tumorigene K-Ras-conduse in oricare faza S sau G 2M are loc  la privarea de glutamină32 , 33]. Glutamina sau deprivarea glucozei are ca rezultat, de asemenea, letalitatea sintetică a diferiților compuși specifici din faza celulară antitumorală. De exemplu, deprivarea de glutamină în asociere cu capecitabină sau paclitaxel a determinat moartea celulară îmbunătățită5 ]. Creșterea celulelor care ocupă G 1 fază după expunerea la medii de creștere conținând scăderea cantităților de glutamină și de glucoza sugerează inducerea apoptozei. Diferite rapoarte verifică inducerea apoptozei prin deprivarea de glucoză sau glutamină observată aici, incluzând celulele renale umane embrionare (HA1E) și linia celulară de fibroblaste embrionare de șoarece (NIH3T3)34 ].

În timpul căii apoptotice intrinseci, semnalizarea celulară de stres conduce la permeabilizarea membranei externe mitocondriale care rezultă în eliberarea citocromului c în activarea citosolului caspazei [ 31 ]. Acest lucru este susținut de rapoartele anterioare în care deprivarea de glucoză în celule FL5.12 hemapoietice, neutrofilele umane și de șobolan au dus la depolarizarea potențialului membranei mitocondriale [ 35 , 36 ]. Astfel, inducerea apoptozei a fost verificată prin constatări suplimentare de citometrie în flux care demonstrează că expunerea la mediul care conține glucoză scăzută și  cantitățile de l-glutamină au determinat o reducere a potențialului membranei mitocondriale. Studiile de ultrastructură mitocondrială au evidențiat faptul că înfometarea completă a glucozei timp de 6 h-9 h a dus la o fragmentare mitocondrială crescută, în timp ce reducerea glucozei sau a foametei complete cu glutamină a determinat alungirea mitocondrială. În același timp, înfometarea glucozei și a glutaminei conduce, de asemenea, la mitocondriile fuzionate [ 35]. Lipsa de glutamină în celulele carcinomului pulmonar uman (A549) a demonstrat mitocondriile dense fără alte modificări structurale mitocondriale anormale. Suplimentarea cu glutamină (1 mM) a determinat o creștere a numărului de mitocondrii însoțită de dimensiunea mitocondriilor mari. Pata potențial sensibilă cu clorometiltetrametilsamine (CMTMRos) în același studiu a demonstrat că deprivarea completă a glutaminei a dus la mitocondriile mai puțin rotunde și nu la fel de dens în jurul nucleului în comparație cu celulele cultivate în mediu conținând 1 mM glutamină. Mitocondria a avut în ambele condiții structuri filamentoase subțiri [ 36 ].

Eliberarea citochromului c este un alt semn distinctiv al căii apoptotice intrinseci și a fost observată după deprivarea de glutamină în celulele FL5.12, hibridoamele murine KB26.5 [ 37 , 38 ]. Un alt studiu a arătat că deprivarea de glutamină în linia celulară de hibridom murin (Sp20) conduce la eliberarea citocromului cși a SMAC / DIABLO însoțită de translocarea Bax la mitocondriile și activarea caspazei 9, care sunt toate caracteristicile căii intrinseci [ 39 ]. Mai mult, deprivarea de glutamină în fibroblastele transformate de myc a demonstrat că inhibarea bcl-2 și caspazei 9 a împiedicat moartea celulelor să verifice inducerea căii intrinseci [ 37]. Lipsirea de glutamină în celulele leucemiei limfoblastice CD4 + (clona CEM 13), celulele leukeumiei limfoblastice umane (CEM-CCRF) și celulele promileeloblaste umane (HL-60) au condus de asemenea la contracția și activarea receptorilor CD95 sugerând implicarea căilor extrinseci [ 40 ] .

Acest studiu a demonstrat că deprivarea de glucoză și l- glutamină a dus la creșterea producției de peroxid de hidrogen după o perioadă de recuperare de 7 zile în ambele linii celulare. Un mediu scăzut în glucoză are ca rezultat o fosforilare oxidativă crescută pentru aprovizionarea adecvată cu ATP; acest lucru ar conduce la o reducere suplimentară a etc(lanțul de transport al electronilor) cu ROS crescută ulterior. Creșterea ROS (peroxidul de hidrogen și superoxid) se datorează producției reduse de nicotinamidă adenină dinucleotidă și piruvat în sistemul fosfat de pentoză și respectiv în glicoliza [ 41 ].

Mai multe rapoarte au indicat de asemenea că privarea de glucoza cauzat de asemenea , producția crescută de peroxid de hidrogen în mai multe linii de celule , inclusiv chineză linie hamster de celule ovariene (CHO), linie de celule umane de carcinom hepatic (Hep2G), uman carcinomul pancreatic (PANC1) și fibroblaste umane [ 42 – 45 ]. Degradarea glucozei care are ca rezultat stresul oxidativ a crescut, de asemenea, asocierea dintre proteina asociată cu moartea 6 (DAXX), kinaza 1 de reglare a semnalelor de apoptoză (ASK1) și relocarea DAXX din nucleu în citoplasmă. Aceasta este importantă deoarece DAXX mediază recrutarea ASK1 la FAS necesară pentru apoptoza mediată de Fas. [ 44 ]. Owada și colab. [ 43] a demonstrat că creșterea peroxidului de hidrogen a rezultat din privarea glucozei în celulele Hep2G și PANC1 a demonstrat fosforilarea și activarea ulterioară AKT [ 43 , 45 ].

Concluzie

Acest studiu a demonstrat că expunerea la scăderea cantităților de glucoză sau l -glutamină a dus la scăderea densității celulare, G 2 M bloc și inducerea apoptozei în câteva ore. După 7 zile de a fi cultivate în DMEM conținând glucoză 6 mM și 1 mM l -glutamină efectele menționate mai sus sunt mai proeminente însoțită de o reducere a potențialului și creșterea colorația acridin orange membranei mitocondriale , în ambele linii celulare. În plus, linia celulară foarte glicolitică și metastatică a fost afectată mai mult în comparație cu linia celulară de carcinom cervical. Acest studiu contribuie astfel la cunoașterea efectelor in vitro și a transducției semnalului privarii de glucoză sau  de glutamină în liniile celulare tumorigene. Cercetările ulterioare sunt imperative, deoarece pot identifica noi obiective pentru chimioterapie în lupta continuă împotriva cancerului.

Logo-ul celbio

BioMed Central Biomed Central Web Site search submit a manuscript register this article Cell & Bioscience Journal Front Page
Cell Biosci . 2015; 5: 37.
Publicat online 2015 Jul 8. doi: 10.1186 / s13578-015-0030-1
PMCID: PMC4518607
PMID: 26225207
Influența deprivării /lipsirii parțiale și complete a glutaminei și glucozei asupra liniilor celulare tumorigene de sân și cervic

Recunoasteri

Acest studiu a fost susținut de subvenții acordate de Asociația pentru Cancer din Africa de Sud, Trustul Struwig Germeshuysen, RESCOM (Consiliul de Cercetare al Universității din Pretoria), Fundația de Cercetare Națională din Africa de Sud și Consiliul de Cercetare Medicală. L Liebenberg, EH Matthews și GE Mathews au asistat la obținerea unor fonduri suplimentare.

Note de subsol

Concurenți interesați

Autorii declară că nu există interese concurente.

Contribuțiile autorilor

TVM și MHV au fost implicate în proiectarea, interpretarea datelor și efectuarea experimentelor. MHV a făcut analiza statistică în acest proiect și a redactat manuscrisul. AMJ a fost implicat în planificarea acestui proiect, supravegherea proiectului și editarea manuscrisului. LL, EHM, GEM și AMJ au contribuit la planificarea și finanțarea necesare pentru acest proiect. GEM a asistat de asemenea la editarea manuscrisului. Toți autori au citit și au aprobat manuscrisul final.

Informații despre colaboratori

Michelle Helen Visagie, Telefon: +27 12 3192245, az.ca.pu@eigasiv.ellehcim .

Thandi Vuyelwa Mqoco, az.ca.pu@ocoqm.idnaht .

Leon Liebenberg, moc.xobloothcraeser@grebnebeill .

Edward Henry Mathews, moc.xobloothcraeser@swehtamhe .

George Edward Mathews, az.ca.uwn@64007202 .

Anna Margaretha Joubert, az.ca.pu@trebuoj.einna .

Referințe

1. Hensley CT, Wasti AT, BeBeradinis RJ. Glutamina și cancerul: biologie celulară, fiziologie și oportunități clinice. J Clin Invest. 2015; 123 : 3678-3694. doi: 10.1172 / JCI69600. Articol gratuit PMC ]PubMed ] [ CrossRef ]
2. Cairns RA, Harris IS, Mak TW. Reglarea metabolismului celulelor canceroase. Nat Rev Cancer. 2011;11 : 85-95. doi: 10.1038 / nrc2981. PubMed ] [ CrossRef ]
3. Shanware NP, Bray K, Abraham RT. Rețelele PI3K, metabolice și autofagice: parteneri interactivi în sănătatea și bolile celulare. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2013; 53 : 89-106. doi: 10.1146 / anurev-pharmtox-010611-134717. PubMed ] [ CrossRef ]
4. Lozy F, Karantza VG. Autofagia și metabolismul celulelor canceroase. Semin Cell Dev Biol. 2012; 23 : 395-401. doi: 10.1016 / j.semcdb.2012.01.005. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
5. Qie S, Liang D, Yin C, Gu W, Meng M, Wang C. și colab. Deprivarea de glutamină și epuizarea glucozei declanșează inhibarea creșterii prin reprogramarea expresiei genetice distincte. Ciclul celulei. 2012; 11 : 3679-3690. doi: 10,4161 / cc.21944. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
6. Kung HN, Marks JR, Chi JT. Glutamin sintetaza este un determinant genetic al independenței glutaminei specifice tipului celular în epiteliul mamar. PLoS Genet. 2011; 7 : e1002229. doi: 10.1371 / journal.pgen.1002229. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
7. Sottnik JL, Lori JC, Rose BJ, Thamm DH. Inhibarea glicolizei prin 2-deoxi-D-glucoză revine la fenotipul metastatic in vitro și in vivo. Clin Exp. Metastasis. 2011; 28 : 865-875. doi: 10.1007 / s10585-011-9417-5. PubMed ] [ CrossRef ]
8. Rahbari R, Sheahan T, Modele V, Collier P, Macfarlane C, Badge RM. Un nou marker retrotransposon L1 pentru identificarea liniei celulare HeLa. Biotechniques. 2009; 46 : 277-284. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
9. Jose C, Bellance N, Rossignoi R. Alegerea dintre glicoliza și fosforilarea oxidativă: o dilemă a tumorii? Biochim Biophys Acta. 1807; 2011 : 552-561. PubMed ]
10. Rossignol R, Gilkerson R, Aggeler R, Yamagata K, Remington SJ, Capaldi RA. Substratul de energie modulează structura mitocondrială și capacitatea oxidativă în celulele canceroase. Cancer Res. 2014; 64 : 986-993. PubMed ]
11. Corkery B, Crown J, Clynes M, Donovan N. Receptorul factorului de creștere epidermal ca potențială țintă terapeutică în cancerul de sân triplă negativ. Ann Oncol. 2009; 20 : 862-867. doi: 10.1093 / anonc / mdn710. PubMed ] [ CrossRef ]
12. Sala DD, Wu Y, Domann FE, Spitz DR, Anderson ME. Activitatea mitocondrială a calciului uniporter este dispensabilă pentru supraviețuirea celulelor carcinomului mamar MDA-MB-231. Plus unu. 2014; 9 : e96866. doi: 10.1371 / journal.pone.0096866. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
13. Liu B, Fan Z, Edgerton SM, Deng XS, Alimova IN, Lind SE, și colab. Metforminul induce răspunsuri biologice și moleculare unice la celulele cu cancer triplă cu cancer de sân. Ciclul celulei. 2009; 8 : 2031-2040. doi: 10.4161 / cc.8.13.8814. PubMed ] [ CrossRef ]
14. Robey IF, Lien AD, Welsh SJ, Baggett BK, Gillies RJ. Factorul-1a și fenotipul glicolitic inductibil de hipoxie în tumori. Neoplazia. 2005; 7 : 324-330. doi: 10.1593 / neo.04430. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
15. Palorini R, Simonetto T, Cirulli C, Chiaradonna F. Inhibitorii complexului 1 mitocondrial și fosforilarea forțată oxidativă sinergiză în inducerea morții celulelor canceroase. Int J Cell Biol. 2013; doi: 10.1155 / 2013/243876. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
16. Mqoco TV, Visagie MH, Albrecht C, Joubert AM. Interacțiunea celulară diferențială dintre extractele de fructosc de Sutherlandia asupra celulelor mamare tumorigene și non-tumorigene. S Afr J Bot. 2014; 90 : 59-67. doi: 10.1016 / j.sajb.2013.10.008. CrossRef ]
17. Visagie MH, Birkholtz LM, Joubert AM. Analogul 17-beta-estradiol inhibă proliferarea celulară prin apoptoza de inducție în liniile de celule mamare. Microsc Res Tech. 2014; 77 : 236-242. doi: 10.1002 / jemt.22334. PubMed ] [ CrossRef ]
18. Ekim B, Magnuson B, Acosta-Jaquez HA, Keller JA, Feener EP, Fingar DC. mTOR fosforilarea domeniului kinazei promovează semnalizarea mTORC1, creșterea celulelor și progresia ciclului celular.Mol Cell Biol. 2011; 31 : 2878-2801. doi: 10.1128 / MCB.05437-11. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
19. Yoon JC, Ling AJY, Isik M, Lee DD, Steinbaugh MJ, Sack LM și colab. GLTSCR2 / PICT1 leagă stresul mitocondrial și semnalizarea Myc. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2014; 11 : 3781-3786. doi: 10.1073 / pnas.1400705111. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
20. Takai N, Ueda T, Nishida M, Nasu K, Nahara H. Bufalin induce inhibarea creșterii, stoparea ciclului celular și apoptoza în celulele cancerului endometrial și ovarian uman. Int J Mol Med. 2008; 21 : 637-643.PubMed ]
21. Costa A, Scholer-Dahirel A, Mechta-Grigoriou F. Rolul speciilor reactive de oxigen și al metabolismului asupra celulelor canceroase și a micro-mediului acestora. Semin Cancer Biol. 2014; 26 : 23-32. doi: 10.1016 / j.semcancer.2013.12.007. PubMed ] [ CrossRef ]
22. Yao ZF, Cao J, Xu LM, Sun XC, Kang J, Yang G și colab. Perfluoroctan sulfonatul blochează fluxul de autofagie și permeabilizarea membranelor lizozomale induse în celulele HepG2. Food Chem Toxicol. 2014; 67 : 96-104. doi: 10.1016 / j.fct.2014.02.017. PubMed ] [ CrossRef ]
23. Kusuzaki K, Murata H, Takeshita H, Hashiguchi S, Nozaki T, Emoto K, și colab. Situri de legare intracelulare a portocaliei acridine în celulele osteosarcomului vii. Anticancer Res. 2000; 20 : 971-975. PubMed ]
24. Koppenol WH, Bounds PL, Dang CV. Contribuțiile lui Otto Warburg la conceptele actuale ale metabolismului cancerului. Nat Rev Cancer. 2011; 11 : 325-337. doi: 10.1038 / nrc3038. PubMed ] [ CrossRef ]
25. Luntul SY, Vander Heiden MG. Glicoliza aerobă: satisfacerea cerințelor metabolice ale proliferării celulare. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011; 27 : 441-464. doi: 10.1146 / anurev-cellbio-092910-154237. PubMed ] [ CrossRef ]
26. Marca K. Glicoliza aerobă prin proliferarea celulelor: protecția împotriva stresului oxidativ în detrimentul randamentului energetic. J Bioenerg Biomembr. 1997; 29 : 355-364. doi: 10.1023 / A: 1022498714522. PubMed ] [ CrossRef ]
27. Spitz DRS, Sim J, Didnour LA, Galforo SS, Lee YJ. Stresul oxidativ indus de deprivarea de glucoză în celulele tumorale umane: un defect fundamental al metabolismului. Ann NY Acad Sci. 2006; 899 : 349-362. doi: 10.1111 / j.1749-6632.2000.tb06199.x. PubMed ] [ CrossRef ]
28. Lee YJ, Galoforo SS, Berns CM, Chen JC, Davis BH, Sim JE, și colab. Citotoxicitatea indusă de deprivarea citocromului și modificările activării protein kinazei activate de mitogen sunt mediate de stresul oxidativ în celulele carcinomului de sân uman rezistent multidrog. J Biol Chem. 1998; 273 : 5294-5299. doi: 10.1074 / jbc.273.9.5294. PubMed ] [ CrossRef ]
29. Kansara M, Berridge MV. Oncogene modulează sensibilitatea celulară la apoptoza indusă de deprivarea glucozei. Anticancer Res. 2004; 24 : 2503-2510. PubMed ]
30. Schlappack OK, Zimmermann A, Hill RP. Glucozitatea și acidoza: efect asupra potențialului metastatic experimental, conținutului de ADN și rezistenței MTX a celulelor tumorale murine. Br J Cancer. 1991; 64 : 663-670. doi: 10.1038 / bjc.1991.378. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
31. Landes T, Martinu JC. Permeabilizarea membranei externe mitocondriale în timpul apoptozei: rolul fisiunii mitocondriale. Biochim Biophys Acta. 2011; 1813 : 540-5. doi: 10.1016 / j.bbccr.2011.01.021. PubMed ] [ CrossRef ]
32. Abcouwer SF, Schwarz C, Mequid RA. Îndepărtarea glutaminei induce expresia GADD45 și GADD153 în primul rând prin stabilizarea ARNm. J Biol Chem. 1999; 274 : 28645-28651. doi: 10.1074 / jbc.274.40.28645. PubMed ] [ CrossRef ]
33. Saqcena, S Mukhopadhyay S, Hosny C, Alhamed A, Chatterjee A, Foster DA. Blocarea intrării anelerotice a glutaminei în ciclul TCA sensibilizează celulele cancerigene K-Ras mutante la medicamentele citotoxice. Oncogene. 2014; doi: 10.1038 / onc.2014.207. Articol gratuit PMC ] [ PubMed]
34. Yuneva M. Găsirea unui „călcâi al lui Ahile” al cancerului. Ciclul celulei. 2008; 7 : 2083-2089. doi: 10,4161 / cc.7.14.6256. PubMed ] [ CrossRef ]
35. Rambold AS, Kostelecky B, Elia N, Lippincott-Swartz J. Formarea rețelei tubulare protejează mitocondriile de degradarea autofagozomală în timpul foametei nutritive. Proc Natl Acad Sci SUA A.2011; 108 (5): 101902-110195. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
36. Ahmad S, White CW, Chang LY, Schneider BK, Allen CB. Glutamina protejează structura și funcția mitocondriilor în toxicitatea oxigenului. Am J Physiol. 2001; 280 (4): L779-L791. PubMed ]
37. Maldonado AC, Muñoz-Pinedo C. Moare pentru ceva de mâncare: modul în care celulele răspund la înfometare. Open Cell Sign J. 2011; 3 : 13-23.
38. Fuchs BC, Bode BP. Subliniind supraviețuirea: glutamina ca modulator apoptotic. J Surg Res. 2006;131 : 26-40. doi: 10.1016 / j.jss.2005.07.013. PubMed ] [ CrossRef ]
39. Paquette JC, Guérin PJ, Gauthier ER. Inducția rapidă a căii apoptotice intrinseci prin foamete de L-glutamină. J Cell Physiol. 2004; 202 : 912-921. doi: 10.1002 / jcp.20194. PubMed ] [ CrossRef ]
40. Fumarola C, Zerbini A, Guidotti GG. Contracția celulară mediată de deprivarea de glutamină determină semnalizarea și apoptoza receptorului CD95 independent de ligand. Moartea celulelor diferă. 2001; 8 : 1004-1013. doi: 10.1038 / sj.cdd.4400902. PubMed ] [ CrossRef ]
41. Blackburn RV, Spitz D, Liu X, Galoforo SS, Sim JE, Ridnour LA, și colab. Stresul oxidativ metabolic activează transducția semnalului și expresia genelor în timpul deprivării glucozei în celulele tumorale umane. Liber Radic Biol Med. 1999; 26 : 419-430. doi: 10.1016 / S0891-5849 (98) 00217-2. PubMed ] [ CrossRef ]
42. Lord-Fontaine S, Averill-Bates DA. Șocul de căldură inactivează protecția antioxidantă celulară împotriva peroxidului de hidrogen: protecția prin glucoză. Liber Radic Biol Med. 2002; 32 : 762-766. doi: 10.1016 / S0891-5849 (02) 00769-4. CrossRef ]
43. Owada S, Shimoda Y, Tsuchihara K, Esumi H. Rolul critic al H2O2 generat de NOX4 în timpul răspunsului celular la deprivarea glucozei. Plus unu. 2013; 8 : e56628. doi: 10.1371 / journal.pone.0056628. Articol gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ]
44. Song JJ, Lee YL. Catalaza, dar nu MNSOD, inhibă calea de transducție a semnalului ASK1-MEK-MAPK activată de glucoză și previne relocalizarea DAXX: peroxidul de hidrogen ca un important al doilea mesager al stresului oxidativ metabolic. J Cell Biochem. 2003; 90 : 304-314. doi: 10.1002 / jcb.10619. PubMed ] [ CrossRef ]
45. Aki T, Yamaguchi K, Fujimiya T, Mizukami Y. Fosfoinositida 3-kinaza accelerează moartea celulară autofagică în timpul deprivării glucozei în linia celulară H9c2 derivată de la cardiomiocit de șobolan.Oncogene. 2003; 22 : 8529-8535. doi: 10.1038 / sj.onc.1207197. PubMed ] [ CrossRef ]

Articolele de la Cell & Bioscience sunt oferite aici prin amabilitatea BioMed Central

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26225207

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4518607/

Supraviețuirea culturii celulare de celule tumorale după deprivarea/lipsirea de glucoză și glutamină la concentrații fiziologice tipice

Abstract

OBIECTIV:

Majoritatea studiilor privind degradarea/lipsirea glucozei (și glutaminei) a culturilor de celule canceroase se concentrează pe epuizarea totală și sunt efectuate timp de cel puțin 24 de ore. Este dificil să extrapolam rezultatele unor astfel de experimente la tratamente antiglicolitice practice, cum ar fi dietele inhibatoare de insulină (cu restricție de dietă carbohidrat 10% -50%) sau cu perfuzie izolată la nivelul membrelor (care de obicei durează aproximativ 90 de minute). Scopul acestui studiu a fost de a obține date experimentale cu privire la efectul deprivării parțiale a d-glucozei și l-glutaminei (la concentrații fiziologice tipice) în timpul expunerii la 0 până la 6 h a celulelor HeLa.

METODE:

Celulele HeLa au fost tratate timp de 0 până la 6 ore cu d-glucoză 6 mM și l-glutamină 1 mM (condiții normale in vivo), d-glucoză 3 mM și l-glutamină 0,5 mM (condiții hipoglicemice severe) și 0 mM d- glucoză și 0 mM glutamină („foame”). Polarizarea-contrastul optic de interferență diferențială și microscopia cu lumină cu contrast de fază au fost folosite pentru a investiga modificările morfologice.

REZULTATE:

Reducerea nivelurilor de glucoză de la 6 la 3 mM (și nivelurile de glutamină de la 1 la 0,5 mM) determină supraviețuirea celulelor canceroase de 73% după expunerea la 2 ore și de 63% după expunerea timp de 4 ore. Reducerea nivelurilor de glucoză de la 6 la 0 mM (și nivelurile de glutamină de la 1 la 0 mM) timp de 4 ore a dus la supraviețuirea celulelor canceroase de (doar) 53%.

CONCLUZIE:

Aceste date arată că deprivarea/lipsirea  de glucoză (și glutamină) la concentrații fiziologice tipice determină uciderea semnificativă a celulelor canceroase după numai 2 ore. Aceasta susține posibilitatea combinării tratamentului anti-glicolitic, cum ar fi o dietă restricționată cu carbohidrați, cu chimioterapeutice pentru uciderea celulelor canceroase îmbunătățite.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24262514

 2014 Feb; 30 (2): 218-27. doi: 10.1016 / j.nut.2013.07.024. Epub 2013 Nov 18.
Supraviețuirea culturii celulare de celule tumorale după deprivarea/lipsirea de glucoză și glutamină la concentrații fiziologice tipice
Mathews EH 1 , Stander BA 2 , Joubert AM 2 , Liebenberg L 3 .

1
Centrul de Cercetare și Dezvoltare Inginerie Continuă, Universitatea de Nord-Vest, Lynnwood Ridge, Africa de Sud.
2
Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină, Facultatea de Științe ale Sănătății, Universitatea din Pretoria, Pretoria, Africa de Sud.
3
Centrul de Cercetare și Dezvoltare Inginerie Continuă, Universitatea de Nord-Vest, Lynnwood Ridge, Africa de Sud. Adresă electronică: LLiebenberg@researchtoolbox.com.