Arhive etichetă | stomac

O formulare a pro-enzimelor pancreatice oferă o eficacitate potentă anti-tumorală: un studiu pilot axat pe cancerul pancreatic și ovarian

Abstract

Enzimele proteolitice au demonstrat eficacitate în tratamentul cancerului. Prezentăm o combinație a celor două pro-enzime Trypsinogen și Chymotrypsinogen A cu eficacitate antitumorală in vitro și in vivo . A fost determinat un efect sinergic anti-tumoral pentru Trypsinogen și Chimotripsinogenul A la un raport 1: 6 (denumit PRP) utilizând 24 de linii celulare de cancer uman. Efectul antiangiogen al PRP a fost analizat prin formarea de tuburi bazate pe matrigel și prin teste de formare a capsulelor fibroase. Mai mult, au fost efectuate teste de invazie celulară și de vindecare a rănilor împreună cu determinarea qRT-PCR a markerilor de tranziție epitelial-mezenchimică (EMT) pe celule canceroase umane tratate cu PRP. În plus, au fost puse în aplicare studii farmacocinetice in vivo , iar eficacitatea antitumorală a PRP a fost studiată împotriva tumorilor ortotopice de cancer pancreatic și ovarian. Formularea PRP s-a dovedit a inhiba angiogeneza in vitro , creșterea tumorii, migrația celulelor canceroase și invazivitatea; și să fie un tratament anti-tumoral in vivo eficient și bine tolerat. În cele din urmă, eficacitatea clinică a unei formulări de supozitoare care conține atât pro-enzime pancreatice în contextul unei scheme speciale farmaceutice britanice a fost evaluată la pacienții cu cancer avansat. În consecință, PRP ar putea avea aplicații clinice oncologice relevante pentru tratamentul adenocarcinomului pancreatic avansat sau metastatic și a cancerului ovarian epitelial avansat.

Introducere

Cancerul este a doua cauză de deces în SUA. Potrivit Societății Americane de Cancer, 42% dintre bărbați și 37% dintre femei sunt expuși riscului de a dezvolta cancer în timpul vieții lor. Cancerul pancreatic reprezintă aproximativ 3% din toate cazurile de cancer din SUA și aproximativ 7% din decesele provocate de cancer, în timp ce cancerul ovarian se află pe locul cinci în decesele cauzate de cancer în rândul femeilor, ceea ce reprezintă mai multe decese decât orice alt cancer al sistemului reproducător feminin.Deoarece numai 10% din decesele provocate de cancer sunt cauzate de tumora primară, provocarea terapeutică este tumora metastatică sau secundară, care este generată de răspândirea celulelor canceroase inițiată de pierderea moleculelor de adeziune care țin tumora în țesutul inițial 1 . În anii următori, procesul de tranziție epitelial până la mezenchimie (EMT) a fost propus ca eveniment inițial pentru metastazarea tumorii 2 . De fapt, atunci când o celulă cancerică își pierde proprietățile epiteliale pentru a dobândi un fenotip mezenchimic, dobândește o șansă crescută de a migra către alte țesuturi 3 . Astfel, dezvoltarea de noi strategii terapeutice care modulează progresia EMT în celulele canceroase a devenit, în ultimii ani, o prioritate cu aplicabilitate clinică largă.

Deși aplicarea terapeutică a enzimelor pancreatice a fost propusă cu mai mult de 100 de ani în urmă 4 și combinația de enzime proteolitice a demonstrat eficacitate în tratamentul cancerului 5,6 , cele mai multe abordări se bazează pe combinația mai multor enzime proteolitice, ceea ce ar putea crește probabilitatea de nedorite și evenimente neprevăzute. Recent, am demonstrat că tratamentul celulelor canceroase umane cu Trypsinogen (T) și Chimotripsinogenul A (C) are ca rezultat o creștere a adeziunii celulare, o atenuare a câtorva markeri asociate cu EMT și o creștere a expresiei mai multor asocieri asociate diferențierii markeri, sugerând obținerea unui fenotip mai puțin malign 7 . În plus, studiile retrospective de cohortă clinică la pacienții cu cancer au demonstrat că terapia cu enzime pe cale orală a redus în mod semnificativ efectele secundare și simptome induse de tumori și terapie, cum ar fi greața, tulburările gastrointestinale, oboseala, pierderea în greutate și agitația și, (QoL) de pacienți cu cancer 8 – 10 .

Aici, prezentăm studii aprofundate in vitro și in vivo pentru a investiga eficacitatea antitumorală a unei formulări pro-enzime constând dintr-o combinație de Trypsinogen și Chymotrypsinogen A într-un raport sinergie. În primul rând, am testat efectul antiproliferativ pentru combinarea T și C în 24 de linii de celule canceroase și am determinat un raport sinergie pentru T și C (1: 6), care a fost definit ca PRP. În al doilea rând, am evaluat efectul antiangiogenic in vitro al acestei formulări, prin testul de formare a tubului cu agar moale și in vivo utilizând testul AngioChamber ™, care se bazează pe procesul fiziologic normal de vindecare a rănilor, pentru a promova formarea capsulelor fibroase în jurul o cameră de teflon care eliberează factorul de creștere 11 . În al treilea rând, pentru a analiza efectul anti-metastatic al tratamentului pro-enzimatic, am studiat efectul PRP în invazia celulară, migrarea celulelor și în modularea genelor legate de EMT în celulele cancerului pancreatic și ovarian. Mai mult, efectuăm un studiu farmacocinetic PRP in vivo și am evaluat eficacitatea anti-tumorală a PRP în modelele de cancer murinic. În acest scop, am tratat șoareci inoculați ortotopic cu celule de cancer ovarian uman A2780 sau cu celule tumorale pancreatice pancreatice de tip Pan02 cu PRP. În cele din urmă, raportăm aici eficacitatea clinică la 46 de pacienți cu boală malignă avansată de origine diferită, tratați cu o formulare rectală de pro-enzime pancreatice.

Rezultate

Determinarea raportului optim pro-enzimatic

În acest studiu, am determinat mai întâi concentrațiile inhibitorii jumătate maxime (IC50) ale tripsinogenului și chitomicroscopic A ca efect unic al unui articol de testare, într-un grup extins de 24 de linii celulare de cancer uman. Valorile IC50 ale tripsinogenului au constituit baza pentru calculul raporturilor de concentrație pentru combinația între Trypsinogen și Chymotrypsinogen A la 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 6, 1: 8 și 1:10. La aceste rapoarte, proprietățile de inhibare a creșterii combinației au fost evaluate în 24 de linii de celule canceroase. Pe baza coeficienților de interacțiune medicamentoasă (CDI), combinația Trypsinogen plus Chymotrypsinogen A a demonstrat o inhibare mai mare a creșterii la raporturi de 1: 4, 1: 6 și 1: 8, comparativ cu raportul 1: 1 în toate liniile celulare testate, 786-O, G-361, BT-474 și celulele tumorale HL-60 (figura 1 , tabelul suplimentar S4 ). În final, s-a constatat că un raport T: C = 1: 6 al ambelor pro-enzime este optim și a fost utilizat pentru următoarele experimente. Tabelul suplimentar S5 rezumă valorile IC50 ale liniilor celulare utilizate pentru experimentele in vitro .

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig1_HTML.jpg

Determinarea coeficienței interacțiunii medicamentoase. Testele combinate de Trypsinogen și Chymotrypsinogen au fost realizate în rapoarte de 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 6, 1: 8 și 1:10. Graficele reprezentative arată un raport optim sinergic pro-enzimatic al tripsinogenului cu chitomoplasinogenul ca 1: 6.

Eficacitatea antiangiogenă a formulării proenzimelor pancreatice

Pentru a determina dacă terapia enzimatică afectează angiogeneza, s-a utilizat un test de formare a tubului cu agar moale. Celulele endoteliale de control ale celulelor venei ombilicale de control (HUVEC) au fost organizate în clustere după 3 ore și au început să formeze structuri asemănătoare tubului după 5 ore, care au fost clar evidente după 24 de ore ( Fig.2A ). Dimpotrivă, HUVEC-urile tratate cu PRP au prezentat o reducere semnificativă a numărului și lungimii tuburilor capilare închise într-o manieră dependentă de concentrație, cu o dispariție totală a structurilor după tratamentul cu T / C 0,07 / 0,42 mg / ml (Figura 2A ) .Pentru a evalua dacă inhibarea formării structurilor tubulare asemănătoare ar putea fi determinată de moartea celulelor cauzată de tratamentul cu PRP, Kitul de Viabilitate / Citotoxicitate LIVE / DEAD a fost utilizat pentru a identifica celulele viabile. Așa cum s-a apreciat în figura 2B , atât celulele de control, cât și cele tratate cu PRP au prezentat o colorare verde, ceea ce indică faptul că inhibarea cordoanelor celulare a fost independentă de viabilitatea celulară.

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig2_HTML.jpg

Testarea formării tubului de angiogeneză. A ) Imagini reprezentative de microscopie ușoară a HUVEC în analizele Matrigel ™. Celulele HUVEC au fost crescute pe Matrigel și după 5 ore și după 24 de ore de tratament cu T / C 0,035 / 0,21 (mg / ml) sau T / C 0,07 / 0,42 (mg / ml) a fost evaluată formarea structurilor capilare. B ) Testul de viabilitate celulară a fost efectuat prin măsurarea celulelor metabolice active colorate cu Calcein AM. Imaginile reprezentative fluorescente ale celulelor de control HUVEC (CTR) și celulelor tratate (T / C 0,07 / 0,42 mg / ml) după 24 h sunt arătate, unde celulele vii apar verde și apar celule moarte colorate cu homodimer-1 (EthD-1) roșu. Mărire originală 10x pentru toate panourile. C ) Numărul de structuri capilare asemănătoare măsurate după 24 de ore de cultură. Datele din 3 experimente independente efectuate în duplicat sunt exprimate ca medie ± SD (** P <0,01 vs. Control). D ) Greutatea medie a capsulei (g) de la șoareci cu AngioChambers ™ implantată fără βFGF1 și tratată cu Controlul vehiculului (Grupul 1), conținând βFGF1 și tratată cu Controlul vehiculului (Grupul 2) și conținând βFGF1 și tratată cu T / C (0,13 / 0,78 mg / kg administrate ip, într-un volum de dozare de 10 ml / kg) (Grupa 3) (** P <0,05).

Mai mult, cuantificarea numărului de structuri asemănătoare capilarului în diferite zone ale puțului a evidențiat o diferență dramatică și semnificativă între numărul de structuri formate de celulele netratate în comparație cu celulele tratate cu PRP (figura 2C ).

Efectul anti-angiogen al PRP a fost investigat suplimentar in vivo utilizând testul AngioChamber ™, un model utilizat pentru a evalua eficacitatea tratamentelor antiangiogene prin măsurarea formării capsulelor fibroase la șoareci. În această analiză, includerea bFGF în cameră susține inducerea dezvoltării vaselor de sânge și formarea unei capsule fibroase. AngioChambers ™ au fost excluse de la toți șoarecii post-mortem în ziua terminării, 24 de ore după tratamentul final (Ziua 5). Figura 2D arată că formarea capsulelor fibroase a fost semnificativ mai mare în grupul de control al vehiculului cu bFGF captat în cameră (Grupul 2, Controlul Inducției) decât în ​​grupul de control al vehiculului fără bFGF încărcat în cameră (grupul 1, Controlul de bază) (p < 0,05) indicând faptul că bFGF a stimulat în mod adecvat și semnificativ formarea capsulelor. Tratamentul cu PRP (Grupa 3) a determinat o reducere semnificativă a angiogenezei comparativ cu controlul de inducție (grupul 2), așa cum este indicat de diferența în greutatea capsulei (p <0,05) cu o inhibare a formării capsulelor fibroase de 57%. Astfel, PRP inhibă formarea capsulelor fibroase care prezintă efecte anti-angiogenice in vivo semnificative.

Efectul anti-invazie, anti-migrare și anti-EMT al PRP

Pentru a analiza efectul anti-metastatic in vitro al tratamentului pro-enzimatic, am studiat efectul PRP în invazia celulară, migrarea celulară și în modularea genelor legate de EMT în celulele canceroase. În primul rând, pentru a evalua efectul PRP asupra migrării celulare, un eveniment cheie în carcinogeneză, am efectuat un test de vindecare a rănilor pe cinci linii de celule canceroase diferite: BxPC3 și Mia Paca-2 pancreatice umane, celule A2780 ovariene umane, melanomul uman A375 și colon uman (HCT 116).Migrarea este definită ca mișcarea direcționată a celulelor pe un substrat, cum ar fi plăcile de plastic care apar pe suprafețe 2D. Aici arătăm că celulele netratate au migrat mai repede pentru a închide decalajul unei zgârieturi în monostratul celular decât celulele tratate cu PRP. PRP a redus semnificativ migrarea celulelor celulelor BxPC3 pancreatice și a comparat cu celulele martor chiar a lărgit lățimea plăgii, un model de migrare care a fost diferit în comparație cu celelalte linii celulare și că părea să fie specific celular ( Fig.3A) . Deși linia celulară tumorală ovariană A2780 nu crește, formând un monostrat omogen ca BxPC3, se poate observa că tratamentul PRP reduce semnificativ capacitatea celulelor ovariene de a migra (Figura 3B). Datele au arătat o inhibare semnificativă a migrării celulare, cu numai 23% din celulele migrate după 48 de ore de tratament cu PRP în comparație cu celulele martor care au atins 88% ( fig.3A și B ). Rezultate similare au fost obținute cu celule MIA PaCa-2, A375 și HCT 116, celulele tratate au prezentat valori ale migrării celulare de ordinul a 25-30% după 48 ore de tratament cu PRP, în timp ce celulele netratate treptat s-au mutat în celulă – regiune zero de zgâriere (figura 3C-E ).

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig3_HTML.jpg

Experimentul de vindecare a rănilor pentru a determina migrarea celulelor. Testele de vindecare a rănilor au fost efectuate la 0, 24 și 48 de ore în celule BxPC3, A2780, MIA PaCa-2, A375 și HCT 116 în celule tratate cu IC50 și celule netratate utilizate ca martori. A ) Imagini reprezentative cu microscop de contrast în fază care prezintă zona acoperită de celule la 0, 24 și 48 de ore după rănire. Mărire originală 10 ×. B ) Mărire originală 10 ×. B ) Migrarea celulelor a fost determinată de viteza celulelor care se deplasează spre zona zgâriată în timp utilizând software-ul ImageJ ™ ( * P <0,05 și ** P <0,01).

În al doilea rând, am testat efectul inhibitor al formulării pro-enzimatice asupra invaziei celulare a celulelor tumorale de colon și de pancreas. Invazia este definită ca o mișcare a celulelor printr-o matrice 3D extracelulară. Principiul acestui test se bazează pe două camere conținând medii separate printr-o membrană poroasă prin care celulele se transmigrează. Aici, am testat diferite concentrații de PRP (tabelul suplimentar S2 ) pe liniile celulare de cancer uman pancreatic MIA PaCa-2 și HCT-15. Interesant, PRP a prezentat o inhibare marcată și semnificativ dependentă de doză a invaziei în ambele linii celulare.Inhibarea totală a migrării celulare a fost obținută din concentrațiile de PRP de 0,015 / 0,093 mg / ml T / C și așa mai departe, cu celelalte concentrații crescătoare testate (Figura 4A ).

Un fișier extern care deține o imagine, o ilustrație, etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig4_HTML.jpg

Invazia celulară și analiza genelor legate de EMT. A ) testul de migrare 3D. Graficele reprezintă numărul de celule care transmigrează prin membrana poroasă după expunerea la concentrații crescătoare de PRP. Se utilizează PBS ca martor negativ și combretastatin ca control pozitiv. B ) expresia genelor legate de EMT.Analiza qRT-PCR a evidențiat creșterea expresiei E-cadherinei cu reducerea concomitentă semnificativă a expresiei N-cadherinei, Slug și vimentinei în celulele BxPC3. PRP nu a afectat în mod semnificativ vimentinul, dar a redus în mod semnificativ exprimarea N-cadherin și Slug și a crescut expresia E-cadherin în celule A2780. * P <0,05 și ** P <0,01). C ) Imagini confocale reprezentative ale expresiei E-cadherin și β-catenin în celulele tratate și controlate cu BxPC3 și A2780. Expresia E-cadherin și expresia β-catenină a fost detectată (în roșu), iar nucleele au fost contracarate cu DAPI (albastru). Mărire originală 40 ×.

Pentru a investiga dacă expunerea PRP are o posibilă reglementare în mecanismele transcripționale care conduc EMT în celulele canceroase, expresia genelor EMT a fost studiată în celulele cancerigene umane pancreatice BxPC3 și A2780 ( Fig.4B ). Indicatorii EMT în ambele celule BxPC3 și A2780 au fost afectați de tratamentul PRP la T / C 0,07 / 0,42 mg / ml. Figura 4B arată că tratamentul PRP a crescut expresia E-cadherinei (0,4 ori) (* P <0,05), în timp ce a redus expresiile de N-cadherin, Slug și vimentin (0,9, 0,5 și 0,6 ori, 0,01) în celule BxPC3. În adiție, PRP a modificat în mod semnificativ expresia E caderinei (0,9 ori) (** P <0,01) și a redus în mod semnificativ expresia N-cadherinei și Slug (0,4 și respectiv 0,6 ori) (** P < 0,01) și a indus o scădere ușoară, dar nu semnificativă, a expresiei vimentinei în celulele A2780. În cele din urmă, au fost efectuate analize de imunofluorescență pentru a confirma modificările expresiei genice.Imaginile confocale ale celulelor BxPC3 și A2780 imunostainate pentru a detecta expresia markerilor epiteliali E-cadherină și β-catenină au arătat o creștere a expresiei ambelor markeri în membrana celulară a celulelor tratate cu PRP în comparație cu celulele de control netratate ( Fig.4C ).

Studiu farmacocinetic PRP

Pentru a evalua farmacocinetica și distribuția de organe a Trypsinogen și Chymotrypsinogen A, șoarecii Nymph-Foxn nu femelă purtători de tumori au fost tratați cu Trypsinogen marcat cu IRDye® 800CW (5 mg / kg) plus tripsinogen (50 mg / kg) sau IRDye® 800 mg Chymotripsinogen A marcat cu CW (7 mg / kg), plus Chimotripsinogenul A neimologat (300 mg / kg). Animalele au fost eutanasiate la punctele de timp specificate post-doză, iar plasmă împreună cu omogenatele de organe a fost preparată, apoi imaginate prin intermediul sistemului de imagistică IVIS.

Fluorescența a fost măsurată în omogenatele de organe. Șoarecii tratați cu T marcat au prezentat un vârf de fluorescență în toate organele între 15 minute și 2 ore după doză. În timp ce șoarecii tratați cu C marcat au prezentat emisia maximă de fluorescență între 15 minute și 6 ore după doză. Pentru ambele valori cele mai ridicate au fost observate în rinichi și ficat ( fig.5A și B ). Nivelurile maxime ale ambelor tripsinogene marcate cu IRDye®800CW și ale chitomicroscopic A în plasmă de șoarece au apărut la 15 minute după administrarea dozei (7,5 și respectiv 72,2 μg / ml). Nivelurile atât ale proenzimelor marcate cu IRDye® 800CW au scăzut rapid după acest timp ( fig.5C și D ).

Un fișier extern care deține o imagine, ilustrație, etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig5_HTML.jpg

Studiu farmacocinetic. S-au citit fluorescență în omogenatele de organe de la șoareci tratați cu ( A ) IRGye® 800CW marcat cu tripsinogen (5 mg / kg) și tripsinogen (50 mg / kg) sau B cu chimotrispsinogen A marcat cu IRDye® 800CW și chitomizinogen A (300 mg / kg). C ) Nivele de trypsinogen marcat cu IRDye®800CW și ( D ) chitomicrosinogen A în plasmă de șoarece.

Eficacitatea antitumorală a PRP în modelele de șoareci orthotopici

Efectul formulării PRO-enzime PRP în doze diferite asupra greutății tumorale în tumorile pancreatice și ovare implantate ortotopic este reprezentat în fig.6. În grupul de control al tumorii pancreatice, un animal a fost eutanasiat în ziua a 6-a datorită unor semne clinice adverse care nu au legătură cu tratamentul și un alt animal a fost găsit mort datorită unor cauze necunoscute în ziua 23. Nu a existat o reducere semnificativă (* P <0,05) animale tratate timp de 26 zile cu Trypsinogen / Chimotripsinogen A la 83,3 / 500 mg / kg (30,2 mg, inhibare 85,9%) comparativ cu martor (PBS 214,8 mg), dar nu între Trypsinogen / Chimotripsinogen A la 27,5 / 165 mg / kg 196,5 mg, inhibare de 8,5%) și controlul (figura 6A ).

Un fișier extern care deține o imagine, ilustrație, etc. Numele obiectului este 41598_2017_14571_Fig6_HTML.jpg

Activitatea antitumorală in vivo a PRP. A ) Imagini ale tumorilor excizate la terminarea studiului tumorilor pancreatice ortotropice. Greutatea medie a tumorii în ziua terminării după injectarea intravenoasă iv a PBS, T / C 27,5 / 165 (mg / kg) sau T / C 83,3 / 500 (mg / kg) ( * P <0,05). B ) Imagini ale tumorilor excizate la terminarea studiului tumorilor ovariene ortotropice. Greutatea medie a tumorii în ziua terminării după injectarea intravenoasă iv a PBS, T / C 9,1 / 54 (mg / kg) sau T / C 27,5 / 165 (mg / kg) ( * P <0,05).

Mai mult, șoarecii purtători de tumori ovariene ( Fig.6B ) au prezentat o reducere semnificativă (* P <0,05) a greutății medii a tumorii la animalele tratate timp de 21 de zile cu două doze diferite de Trypsinogen / Chimotripsinogen A, 9,1 / 54 mg / kg și 27,5 / 165 mg / kg, comparativ cu martor (PBS). Greutatea medie a tumorilor din grupul de control a fost de 2062,2 mg, în timp ce grupurile tratate au prezentat o greutate medie a tumorii de 1074,2 mg și, respectiv, 957,3, variind într-o inhibare a tumorii de 50% (52-46%).

Prezentare generală a studiilor clinice

Eficacitatea clinică a unei formulări de supozitoare care conține pro-enzime pancreatice bovine Trypsinogen și Chymotrypsinogen A a fost evaluată în contextul unei scheme speciale farmaceutice britanice. Efectele clinice au fost studiate la 46 de pacienți cu cancer metastatic avansat de origine diferită (prostată, mamar, ovarian, pancreatic, colorectal, stomac, pulmonar nemetal celular, cancer intestinal și melanom) după tratamentul cu o formulare rectală a ambelor enzime pancreatice . Nu s-au observat evenimente adverse grave sau grave legate de administrarea rectală. Pacienții nu au prezentat efecte secundare hematologice, așa cum se observă de obicei în regimurile chimioterapice clasice. Nu au fost observate reacții alergice după administrarea rectală de supozitoare. Pentru a evalua activitatea terapeutică a administrării rectale, supraviețuirea globală a pacienților aflați sub tratament a fost comparată cu speranța de viață atribuită unui pacient înainte de începerea tratamentului. Tabelul 1 prezintă lista pacienților tratați cu formularea pro-enzimatică pancreatică. Nouăsprezece dintre cei 46 de pacienți (41,3%) cu boli maligne avansate, majoritatea suferind de metastaze, au avut o durată de supraviețuire semnificativ mai mare decât durata de viață estimată, de fapt, pentru întregul set de tipuri de cancer, supraviețuirea medie (9,0 luni) semnificativ mai mare decât speranța medie de viață (5,6 luni).

tabelul 1

Prezentare generală a studiilor clinice. Pacienții care au prezentat prognoza speranței de viață (*).Pentru întregul set de tipuri de cancer, supraviețuirea medie (9,0 luni) a fost statistic semnificativ mai mare decât speranța medie de viață (5,6 luni). ANOVA cu o singură cale (α = 0,05, P <0,05).

Tipul de cancer  durata asteptata viata (luni) Supraviețuire ** (luni)
Carcinom pancreatic (n = 4) 2 8
4 *
7
4
Cancer ovarian (n = 7) 4 11
6 12
6 11
<12 38
<1 1
4 *
3 *
Cancerul de sân (n = 6) 6 9
6 *
2 *
12 *
<12 *
12 *
Colon Cancer rectal (n = 5) 6 *
6 *
12 *
6 40
12 *
Cancerul gastric (n = 2) 2 8
7
Cancerul de prostată (n = 8) 4 *
1 5
4 *
<12 *
12 14
12 *
12 *
12 *
Limfom non-Hodgkin (n = 1) 2 9
Mezoteliom (n = 1) 3 9
Melanomul (n = 2) 6 *
4
Tumorile neuro-endocrine (n = 1) 10 24
Vezică urinară (n = 2) *
12 *
NSCLS (n = 2) 3 5
6 *
Bowel (n = 2) <12 *
3
Carcinom cu celule mici (n = 1) <12 *
Cancerul renal (n = 1) *
Abdomen necunoscut primar (n = 1) <12 *

Deși numărul pacienților pe indicație de cancer este în mod natural destul de scăzut, 3 din 8 pacienți cu cancer de prostată și 5 din 11 pacienți cu cancer gastro-intestinal par să beneficieze în special de tratamentul cu supozitoarele pro-enzimatice.

Discuţie

Datele prezentate au fost relevante pentru adoptarea unei noi strategii în formularea unui preparat compus din prozime enzimele pancreatice (PRP) care s-au dovedit a reduce principalele caracteristici ale răspândirii cancerului. În acest context, angiogeneza, capacitatea de a forma noi vase de sânge reprezintă un pas critic în dezvoltarea tumorii prin care tumorile își stabilesc propria sânge 12 . Prin urmare, inhibarea angiogenezei va bloca una dintre cerințele fundamentale pentru creșterea tumorii, precum și răspândirea metastazelor tumorale în situsurile tumorale secundare. Am investigat activitatea anti-angiogenică in vitroa PRP utilizând testul de formare a tubului și testul de formare a tubului cu agar moale și in vivo cu analiza AngioChambers ™. Rezultatele au arătat că PRP inhibă formarea structurilor capilare asemănătoare HUVEC și suprimă formarea capsulelor fibroase conduse de bFGF capturat în AngioChambers TMimplantat subcutanat și ulterior prin stimularea VEGF endogenă. Factorii angiogenici, cum ar fi bFGF și VEGF, secretați de multe celule, inclusiv macrofage și celule canceroase, au demonstrat că joacă un rol important în progresia carcinomului pancreatic 13 și a altor tipuri tumorale 14-16 . Într-adevăr, bFGF stimulează toate etapele majore în cascada angiogenezei, așa cum se știe că este implicată în proliferarea, migrarea și diferențierea celulelor endoteliale 17 .

Un alt factor cheie în progresia cancerului este pierderea adeziunii celulelor celulare, care se corelează cu o capacitate crescută de migrare a celulelor și cu dobândirea proprietăților invazive de către celulele maligne, care suferă o schimbare morfologică care adaptează un aspect asemănător cu axul 18 . În plus, un test in vitro de vindecare a rănilor a arătat că capacitatea de migrație a celulelor cancerigene ovariene, de melanom și cancer de colon a fost suprimată după incubarea cu PRP. Mai mult, inhibarea potențialului de invazie celulară posedă cel mai probabil un potențial semnificativ de inhibare a metastazelor in vivo .

Pentru a înțelege mecanismele moleculare posibile care inhibă migrarea și invazia celulelor tratate cu PRP, a fost efectuată analiza qRT-PCR pentru a studia expresia genelor legate de EMT, un proces în care celulele epiteliale își pierd caracteristicile și se supun transdiferențierii celulelor mezenchimale motile. Dovezile sugerează că EMT este asociat cu metastaze și cu dobândirea de proprietăți chemorezistente în multe tipuri de cancer 19, inclusiv ovarian 20 și cancer pancreatic 21 . Într-adevăr, studiile anterioare au arătat că în timpul progresiei cancerului ovarian, EMT joacă un rol important în creșterea invaziei celulare, ceea ce duce la un rezultat slab al pacienților cu cancer ovarian 22 , 23 . În plus, studiile au constatat că EMT contribuie la rezistența la medicamente chimioterapeutice în cancerul pancreatic 24 și că mai mulți markeri EMT au fost, de asemenea, recunoscuți în cancerul pancreatic 25 , 26 . În acest studiu, demonstrăm că tratamentul cu PRP a promovat expresia genică a markerului epitelial E-cadherin și a scăzut expresia ambelor markeri mezenchimali, N-cadherin și vimentin. O trăsătură cheie a EMT este trecerea de la markeri epiteliali, cum ar fi E-cadherin și citokeratin la markeri mezenchimali cum ar fi N-cadherin, vitronectin 75 sau vimentin 27 , 28 . Aici arătăm că liniile celulare de cancer ovarian și pancreatic au prezentat o scădere semnificativă a expresiei N-cadherinei ca răspuns la tratamentul PRP. Aceasta este o observație foarte relevantă, deoarece reglarea în sus a N-caderinei este asociată cu un potențial crescut de migrație și invazie a celulelor cancerigene ovariene și pancreatice 29-31 . În plus, mai multe studii au evidențiat importanța semnalizării N-caderinei în progresia cancerului pancreatic 32 , 33 . S-a raportat că distrugerea N-cadherinei în celulele BxPC3 conduce la o exprimare crescută a E-cadherinei și a determinat, de asemenea, o reducere semnificativă a motilității liniei celulare BxPC3, sugerând că N-cadherina este un mediator cheie al procesului EMT în celulele pancreatice 28 .

În plus, expresia proteică a markerilor epitelii E-cadherin și β-catenin a fost mărită după tratamentul PRP și a apărut limitată la membrana celulară atunci când a fost analizată prin imunofluorescență. E-cadherina este o moleculă importantă de semnalizare în EMT în parte prin interacțiunea sa cu β-catenină 18 , de fapt, reducerea expresiei E-cadherin și β-catenin a fost asociată cu o diminuare a adeziunii celulare7. Mai mult decât atât, translocarea β-cateninei la nucleu și scăderea expresiei E-cadherinei sunt observate în diferite malignități umane asociate cu metastazarea 20 .

Mai mult, unul dintre genele puternic inhibat prin tratamentul cu PRP în ambele linii celulare BxPC3 și A2780 a fost Slug, un factor de transcripție care s-a dovedit a reprima E-cadherina și a reglat alte markeri EMT. Mai mult, s-a raportat că Slug este un inductor puternic al VEGF și prezintă efecte pro-angiogenice puternice 34 . De asemenea, Slug este asociat îndeaproape cu metastazele tumorale și angiogeneza în cancerul ovarian 35 și cu reglarea expresiei fascinei de proteină asociată cu actina, adesea foarte ridicată în tumorile maligne și recent sugerată ca o țintă marker sau terapeutică pentru cancerul pancreatic 36 . Prin urmare, datele noastre sugerează că PRP revine EMT în celulele canceroase.

Injecția intravenoasă a pro-enzimelor a determinat niveluri maxime detectabile în plasmă la 15-30 minute care au scăzut în prima oră și au fost încă prezente la niveluri scăzute după trei ore după administrarea dozei. Aceste observații sunt similare cu profilurile concentrației de timp găsite în studiile farmacocinetice anterioare cu potențiali agenți terapeutici pentru cancerele umane, incluzând pancreasul 37 , 38 și, de asemenea, în chimioterapeutica actuală utilizată în clinică, cum ar fi gemcitabina 39 . Mai mult, examinarea distribuției țesuturilor a demonstrat că proenzimele perfuzate în organe, incluzând inima, ficatul, splina, plămânul, rinichii și întregul tract gastrointestinal, au indicat o distribuție largă a țesuturilor pro-enzimelor 40 .

Am investigat în continuare modele de tumori ortotopice pentru a testa eficacitatea anti-tumorală a PRP utilizând celule tumorale umane (A2780) sau celule tumorale murine (Pan 02). Observațiile clinice au sugerat că mediul de organe poate influența răspunsul tumorilor la chimioterapie. De asemenea, implantarea ortotopică a celulelor tumorale umane în șoareci nudi oferă avantaje pentru studiul creșterii tumorale și a metastazelor 41 . În plus, Panc 02 s-a dovedit a fi o linie celulară de cancer pancreatic syngenetic adecvată pentru dezvoltarea tumorilor ortotopice în model murin imunocompetent, care imită îndeaproape cancerul pancreatic uman 42 . Unul dintre avantajele raportate ale modelelor ortotopice este acela că procesele de țintire care implică invazia locală (de exemplu, angiogeneza) pot fi efectuate la un loc mai relevant din punct de vedere clinic. Prin urmare, eficacitatea antitumorală a tratamentului zilnic cu Trypsinogen și Chimotripsinogenul A administrată în combinație ca o injecție iv singulară în două doze a fost evaluată împotriva celulelor cancerigene ovariene și pancreatice umane inoculate ortodic la șoareci femelici numi / nu șoareci C57BL / 6 femele, respectiv. În timp ce cele două doze testate au fost eficiente împotriva tumorilor ovariene ortotopice, numai doza mai mare testată a fost eficace în tumorile pancreatice. De remarcat, răspunsul slab al tumorilor pancreatice la terapiile disponibile este bine cunoscut 43 .

PRP nu numai că a demonstrat dimensiunea tumorii dicreazite, dar, de asemenea, s-a dovedit a fi un agent anti-cancer non-toxic deoarece nu au fost identificate evenimente adverse clinice legate de tratament. Luate împreună, formularea pro-enzimatică prezentată (PRP) inhibă în mod semnificativ tumori pancreatice și ovariene umane, atât entități tumorale bine vascularizate, cât și relativ rapide. Pentru ambele indicații, cancer pancreatic și ovarian, terapia clinică disponibilă este limitată și, prin urmare, prezintă indicații atractive pentru dezvoltarea clinică suplimentară a PRP.

În cele din urmă, în contextul unei scheme speciale britanice privind medicamentele, am evaluat eficacitatea clinică a unei formulări supozitoare, care conține tripsinogen, chimiotrypsinogen A și urme de α-amilază, la pacienți cu mai multe malignități diferite. A-amilaza a fost inclusă deoarece a făcut parte din extractele pancreatice brute care au fost utilizate în primele zile de terapie cu enzime, dar după evaluarea interacțiunii sinergice dintre tripsinogen, chitomoplasmogen și α-amilază s-a concluzionat că a-amilaza nu a contribuit la activitatea antitumorală a formulării.

Prin administrare rectală, tratamentul a fost bine tolerat de către pacienți și are avantajul că formularea este absorbită de către vasele de sânge ale rectului în circulație, evitând digestia enzimelor din duoden. Prin urmare, o formulare rectală conduce la o eficacitate îmbunătățită față de terapiile cu enzime orale actuale și ar reduce dozele mari utilizate în mod curent pentru aplicațiile orale 44 . Există unele controverse în literatura de specialitate cu privire la cantitatea de pro-enzime intacte care ajunge efectiv în fluxul sanguin atunci când se administrează pe cale orală, dar și rectal. În timp ce unii autori susțin că numai o mică fracțiune (0,002%) 45 sau chiar niciuna 46 nu este absorbită, o teorie alternativă sugerează că aceste enzime sunt stabile la nivel acid și sunt absorbite prin mucoasa gastrointestinală în fluxul sanguin ca parte a unui proces de reciclare enteropancreatică 47 . Mai mult, eficacitatea clinică a enzimei pancreatice rectale, după cum este evaluată prin timpul de supraviețuire prelungit în comparație cu speranța de viață estimată la începutul tratamentului, a fost evidentă la un număr de pacienți.

Rezumând, PRP se dovedește a fi un tratament anti-tumoral eficace și netoxic in vivo , capabil să inhibe angiogeneza și creșterea tumorii, migrarea celulelor canceroase și invazivitatea. Mai departe, o formulare de supozitoare conținând atât pro-enzime pancreatice a arătat o creștere a speranței de viață a pacienților cu cancer avansat. În consecință, PRP ar putea avea aplicații clinice oncologice relevante pentru tratamentul tumorilor solide cum ar fi adenocarcinomul pancreatic avansat și cancerul ovarian epitelial avansat.

Materiale si metode

Cultură de celule

Liniile de celule de cancer au fost obținute de la Colecția Americană de Cultură de Tip (ATCC) (Rockville, MD, USA). Tabelul suplimentar S1 prezintă liniile celulare utilizate și condițiile de creștere a culturii pentru fiecare dintre acestea. Toate celulele au fost cultivate la 37 ° C într-un incubator de cultură de celule umidificat furnizat cu 95% aer / 5% CO2.

Asigurarea îngrijirii animalelor

Procedurile care implică îngrijirea și utilizarea animalelor în studiu au fost revizuite și aprobate de către Comitetul de Stat pentru Medicină și Farmacie (IACUC) din Pennsylvania State College of Medicine. În timpul studiului, îngrijirea și utilizarea animalelor au fost efectuate în conformitate cu principiile enunțate în Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, ediția a 8- a , 2010 (Consiliul Național de Cercetare).

Teste de citotoxicitate in vitro și determinări ale interacțiunilor medicamentoase

Trypsinogenul (T) și Chitopripsinogenul A (C) s-au dizolvat în PBS, soluțiile stoc au fost sterilizate prin filtrare (0,22 pm) și pentru fiecare formula enzimatică stocurile au fost amestecate în combinațiile corespunzătoare. Pentru a determina citotoxicitatea in vitro (jumătate din concentrațiile inhibitorii maxime, IC50) și CDI, plăcile cu 96 de godeuri au fost însămânțate pentru fiecare linie celulară, s-au adăugat combinații pro-enzime la celule 24 ore după însămânțare și testate triplicat pentru fiecare linie celulară . La 72 de ore după adăugare, testul CellTiter-Blue® a fost efectuat pe toate plăcile conform instrucțiunilor producătorului.Pe scurt, 10 pl de CellTiter-Blue® s-au adăugat la fiecare godeu și s-au incubat cu celule timp de până la 4 ore. Fluorescența a fost măsurată utilizând un Fluorometru Spectramax Gemini XPS. Toate datele au fost înregistrate și introduse în foi de calcul Microsoft® Excel pentru interpretare. Datele colectate de la testele CelITiter-Blue® au fost reprezentate grafic ca curbele de răspuns la doză pentru IC 50 determinare și ca isobolograms pentru a evalua CDI.

Testul de formare a tubului Matrigel

Venă derivate ombilical celule endoteliale umane (HUVEC) au fost cultivate în mediu complet de creștere-2 AGE (Lonza, Basel, Elveția) , în condiții standard de cultură celulară de 37 ° C și 5% CO 2 . Celulele au fost utilizate între trecerile 4 și 5. Plăcile cu multiple godeuri (plăci cu 12 godeuri) au fost acoperite cu 300 pL Matrigel (Collaborative BD PharMingen, San Diego, CA) la 4 ° C și incubate timp de 30 de minute la 37 ° C. HUVEC (1,2 × 10 5celule / godeu) au fost adăugate la godeurile acoperite cu Matrigel în mediu de cultură complet. Formularea pro-enzimatică a fost adăugată după 20 de minute de însămânțare pe Matrigel la 2 concentrații, T / C: 0,035 / 0,21 mg / ml și T / C: 0,07 / 0,42 mg / ml. După 5 și 24 de ore de incubare, celulele au fost fotografiate în microscopie cu contrast de fază (Leica DM 5500B, Solms, Germania). Capacitatea celulelor de a forma capilare a fost examinată și a fost măsurat numărul de structuri capilare asemănătoare. Fiecare porțiune de cord dintre ramificații a fost considerată ca fiind o unitate capilară. Valorile medii ± deviația standard (SD) s-au obținut prin evaluarea a patru zone reprezentative din fiecare cultură din trei experimente independente.

Celuloza de viabilitate a culturii a fost realizată prin Kitul de Viabilitate / Citotoxicitate LIVE / DEAD (Molecular Probes), conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, HUVEC (3 x 105 celule / godeu) au fost cultura în godeurile acoperite cu Matrigel în mediu de cultură complet. Formularea pro-enzimatică a fost adăugată după 20 de minute de însămânțare pe Matrigel la T / C: 0,07 / 0,42 mg / ml și viabilitatea celulară a fost testată după 24 de ore de cultură cu Calcein AM, o probă pentru activitatea de esterază intracelulară, , și homodimer-1 de etidiu, o sondă pentru pierderea integrității membranei plasmatice, care a marcat celule moarte. Celulele tratate cu metanol 70% au servit ca martori pentru celulele moarte (datele nu sunt prezentate). Imaginile au fost preluate prin microscopie confocală (Nikon Eclipse Ti-E A1, SUA) și analizate utilizând software-ul NIS-Elements.

Implantul și tratamentul AngioChamber ™

Camere de țesut poros Teflon (AngioChambers ™) 48 , 49au fost umplute în condiții sterile cu 0,8% agaroză conținând 20 UI / ml heparină, cu sau fără 4 ug / ml factor de creștere fibroblast bazic (bFGF). 30 de șoareci FvB de sex feminin au primit câte un AngioChamber ™ implantat subcutanat, cu sau fără factor de creștere fibroblastic bazic (bFGF). 30 de șoareci au fost implantate cu camere fără bFGF (grupa 1) și 20 de șoareci, implantate cu camere care conțin bFGF (grupurile 2 și 3), au fost randomizați prin masa corporală în 3 grupe de câte 10 șoareci (grupa 1, 2 și 3). Grupurile de control (grupurile 1 și 2) au primit o doză orală de NMP: PEG300 ca un vehicul de control și șoareci tratați (Grupa 3) au primit injecție intraperitoneală zilnică (ip) cu T / C: 0,13 / 0,78 mg / mL într-un volum de dozare 10 ml / kg. Animalele au fost tratate la 2 ore după ce șoarecii s-au recuperat din chirurgie pentru a implanta AngioChamber ™ în Ziua de studiu 0.AngioChambers ™ au fost excluse de la toți șoarecii post-mortem în ziua terminării, 24 de ore după tratamentul final (Ziua 5). Capsula fibroasă vascularizată care a fost formată în jurul fiecărei camere a fost îndepărtată cu grijă și greutatea umedă a fost înregistrată imediat. Inhibarea angiogenezei prin pro-enzime (%) a fost calculată folosind

% Inhibare = [( A – B ) / ( A – C ) x 100];
1

unde A este greutatea medie a capsulei de la șoareci cu factor de creștere implantat AngioChambers ™ și tratată cu Controlul vehiculului (Grupa 2), B este greutatea medie a capsulei de la șoareci cu agent de creștere implantat AngioChambers ™ și tratată cu proenzima (Grupa 3) și C este greutatea medie a capsulei de la șoareci cu AngioChambers ™ implantată fără factor de creștere și tratată cu Controlul vehiculului (Grupul 1).

Testul de vindecare a rănilor in vitro

Pancreatice (BxPC3 și Mia Paca-2), celule ovariene (A2780), melanom (A375) și colon (HCT 116) au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri și crescute până la confluență de 80%. Plăgile au fost create prin răzuirea celulelor monostrat cu un vârf de pipetă de 200 pl, iar celulele neaderente au fost spălate cu mediu. Celulele canceroase BxPC3 și A2780 au fost tratate cu T / C: 0,07 / 0,42, mg / ml, celulele canceroase Mia Paca-2 și HCT 116 au fost tratate cu T / C: 0,025 / 0,15 mg / ml și celulele canceroase A375 au fost tratate cu T / C: 0,035 / 0,21 mg / ml ,. La 0, 24 și 48 de ore după crearea rănilor, s-au observat celule tratate și de control ne-tratate, iar imaginile de migrare au fost captate cu un obiectiv de 10x într-o microscopie cu contrast de fază. Migrarea celulelor a fost determinată de viteza celulelor care se deplasează spre zona zgâriată. Software-ul ImageJ ™ a fost folosit pentru a cuantifica zona zgâriată.Toate experimentele au fost placate în godeuri triplicate și au fost efectuate de cel puțin trei ori.

Testul de invazie a celulelor Matrigel

Inserțiile de cultură celulară (mărimea porilor de 8 pm) au fost spălate de două ori cu mediu RPMI sau DMEM fără ser și introduse în godeurile unei plăci de cultură de celule cu 24 de godeuri. Utilizând vârfuri de pipetă reci, la fiecare inserție s-au adăugat 40 pl de Matrigel diluat 1:10 în mediu RPMI, balansând cu ușurință plăcuța pentru a distribui Matrigel uniform pe suprafața membranei. Matrigel a fost lăsat să se solidifice prin incubare peste noapte la 37 ° C. A doua zi, 7,5 x 10 4 MIA PaCa-2 celule în 200 pl de mediu DMEM suplimentat cu 0,1% BSA, sau 7,5 x 10 4 HCT 15 celule în 200 pl de mediu RPMI suplimentat cu 0,1% BSA, au fost adăugate la camera superioară a fiecărei inserții. Suspensiile celulare au conținut combinație pro-enzimă la opt concentrații (tabelul suplimentar S2) sau PBS (control netratat). Combretastatina A4 a fost utilizată ca un control al inhibării migrării celulare 50 la o concentrație finală de 250 nM. Fiecare probă a fost analizată în două exemplare. Mediul condiționat din celule U87-MG (500 pl) a fost utilizat ca chemoattractant în camera inferioară 51 , 52 . Celulele au fost lăsate să migreze prin matricea extracelulară timp de 24 de ore la 37 ° C. Celulele care nu migrează au fost îndepărtate din camera superioară cu un vârf de bumbac. Celulele de pe partea de jos a membranei au fost fixate în etanol 70% timp de 15 minute și colorate cu 10% colorare Giemsa filtrată timp de 1 oră la temperatura camerei. Migrarea a fost cuantificată prin numărarea celulelor în trei câmpuri de vedere la mărirea de 40x utilizând un microscop cu lumină inversă (Olympus).

Izolarea ARN și analiza cantitativă RT-PCR în timp real

A2780 și BxPC3 au fost crescute în plăci cu 6 godeuri și tratate de două ori cu PRP (T / C 0,07 / 0,42 mg / ml) în ziua 2 și în ziua 4. În ziua 5, ARN celular total a fost izolat folosind TriReagent (Sigma) utilizând setul pentru sistemul de transcriere inversă (Promega). PCR în timp real a fost realizat utilizând amestecul principal SYBR-Green PCR (Promega) conform recomandărilor producătorului. Reacțiile PCR s-au efectuat după cum urmează: o denaturare inițială la 95 ° C timp de 2 min, 40 cicluri de 95 ° C timp de 5 s și 60 ° C timp de 30 s și ciclu final de disociere de 60-95 ° C. Nivelurile de exprimare a genei au fost normalizate la valorile corespunzătoare GAPDH și sunt prezentate ca schimbare ori în raport cu valoarea probei de control. Celulele netratate au fost utilizate ca martor. Toate probele au fost efectuate în triplicat pentru fiecare genă. Grundurile utilizate sunt prezentate în tabelul suplimentarS3 .

Analiza imunohistochimică

A2780 și BxPC3 au fost crescute pe capace de sticlă și tratate de două ori cu PRP (T / C 0,07 / 0,42 mg / ml) în ziua 2 și în ziua 4. Pentru colorarea cu imunofluorescență probele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă (PFA) min la RT. Celulele au fost blocate timp de 1 oră la temperatura camerei (RT) cu 5% BSA, 5% ser fetal bovin în PBS și apoi incubate cu E-Cadherin (SC-21791, St. Cruz) și β-catenină (SC-7963, , Cruz) peste noapte la 4 ° C. A doua zi, probele au fost spălate de trei ori cu PBS și incubate cu anticorpi secundari corespunzători (Santa Cruz) timp de 1 oră la RT, spălate de trei ori cu PBS și apoi montate cu mediu de montare și DAPI. Imaginile au fost preluate prin microscopie confocală (Nikon Eclipse Ti-E A1, SUA) și analizate utilizând software-ul NIS-Elements.

Studiu farmacocinetic

Conjugarea tripsinogenului și a chitomicroscopului A cu eticheta IRDye® 800CW a fost făcută în conformitate cu protocolul producătorului (biotehnologia LI-COR). Pe scurt, tripsinogenul și chitomicrosinogenul A s-au dizolvat la o soluție 1 mg / ml (greutate / volum) și s-a utilizat fosfat de potasiu 50 mM pentru a ajusta pH-ul la 8,5. Amestecul proteic și IRDye® 800CW a fost incubat timp de 2 ore la temperatura ambiantă. După filtrarea pe coloană pentru a îndepărta colorantul neconjugat și tamponul de schimb pentru soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), pH 7,2, concentrația finală de proteină și gradul de etichetare (raportul colorant până la pro-enzimă) au fost determinate prin măsurarea absorbției la 280 și 780 nm. Produsul marcat a fost păstrat la 4 ° C până la utilizare.

Studiile de biodistribuție au fost efectuate pe șoareci nude-Foxnlnu femelă athymic non-tumorală (n = 3 per punct de timp). Se administrează (intravenos) combinația de pro-enzime etichetate și neetichetate IRDye® 800CW (la fiecare șoarece) la Trypsinogen marcat cu IRDye® 800CW (5 mg / kg) cu tripsinogen marcat cu 50 mg / kg IRDye® 800 CW 7 mg / kg) cu Chitomoprinogen A neimologat (300 mg / kg). Șoarecii au fost eutanasiați la punctele de timp predeterminate (0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 hr, 6 ore, 12 ore, 24 ore și 48 ore după injectare) și organele pertinente (sânge prelucrate în plasmă, ficat, plămân, inimă, splină, tract gastrointestinal întreg și ambii rinichi) au fost excizate, omogenizate și înregistrate prin intermediul IVIS Lumina XR de la Perkin Elmer.Concentrațiile de proteine ​​marcate IRDye® 800CW (intensitatea fluorescenței / mg de proteină) au fost analizate la fiecare punct de timp pentru probele de plasmă și de omogenitate de organe.

Modele tumorale ortotopice in vivo

40 femele atimici nuzi-Foxn1 NU șoarecii au fost inoculați ortotopic (ovar dreapta) cu 1 x 10 6 A2780 celulele de cancer ovarian uman; și 40 femele / 6 șoareci C57BL au fost inoculați ortotopic (coada pancreasului) cu 1 x 10 6 celule tumorale pancreatice Pan02 șoarece. 10 animale din fiecare grupă au rămas netratate pentru evaluarea ratei de absorbție a tumorii. După 7 zile după inoculare (Ziua 0), animalele au fost randomizate în 3 seturi de 10 (grupul de tumori ovariene) și 3 seturi de 10 (grupul tumoral pancreatic).

A fost administrată o singură injecție de venei de coadă într-un volum de dozare de 10 ml / kg o dată pe zi pentru fiecare animal. Volumul de soluție de dozare administrat fiecărui animal a fost calculat și ajustat în funcție de greutatea corporală individuală măsurată imediat înainte de administrare. Tratamentele au început în ziua 0 și au fost administrate timp de 21 de zile consecutive. Animalele tumorale ovariene ortotrope au fost injectate cu PBS (Grupul 1) sau T / C la doze de 27,5 / 165 mg / kg (Grupa 2) și 83,3 / 500 mg / kg (Grupa 3). Animalele tumorale din pancreasul ortotropic au fost injectate cu PBS (Grupa 1) sau T / C la doze de 9,1 / 54 mg / kg (Grupa 2) și 27,5 / 165 mg / kg (Grupuri 3). La terminare, ovarul și pancreasul au fost excluse de la toate animalele cu tumoare intactă. Tumoarea a fost izolată, cântărită și apoi fotografiată.Modificarea procentuală a greutății medii a tumorii pentru grupurile tratate comparativ cu grupul martor a fost calculată utilizând:

Modificarea procentuală = ((Control mediu – Tratament mediu) / Control mediu) × 100.
2

„Special” tratament cu licența – formularea proenzimelor pancreatice

46 de pacienți cu boală malignă avansată de origine diferită au fost tratați zilnic cu o formulare rectală conținând 8,92 mg din fiecare dintre cele două enzime pancreatice și 1,78 mg α-amilază (A) pe supozitor. Studiul a fost efectuat în baza unei licențe britanice „Specials” la Clinica Dove, Hampshire, Marea Britanie pentru perioade de până la 14 luni. Specialități Regulamentul privind licența oferă un cadru legal pentru utilizarea unui medicament fără autorizație de introducere pe piață sau licență de produs de către un medic în vederea satisfacerii nevoilor speciale ale unui pacient pentru care este direct responsabil. Prin urmare, tratamentul în baza unei licențe speciale nu poate fi considerat un studiu clinic formal. Preocuparea informată a fost obținută de la toți pacienții înainte de tratament. Datele raportate au fost generate din notele pacientului deținute de Clinica Dove.

Fără criterii formale de includere și excludere, grupul de pacienți al acestui program de utilizare compasională a fost foarte eterogen. Majoritatea pacienților au fost diagnosticați cu cancere metastatice de diferite origini, inclusiv prostată (n = 8), sân (n = 6), ovarian (n = 7), pancreatice (n = 4), colo-rectale (n = 2), cancerul intestinal (n = 2), cancerul de colon (n = 2), melanomul (n = 2) limfom non-Hodgkin, mezoteliom, tumora neuro-endocrină, carcinom cu celule mici, cancer renal și abdomen necunoscut primar (toate n = 1). Pentru a evalua beneficiul tratamentului, supraviețuirea sub tratament a fost comparată cu speranța de viață individuală alocată înainte de începerea tratamentului.Aceasta speranta de viata a fost determinata pentru fiecare pacient avand in vedere i) data diagnosticului clinic, ii) varsta pacientului si comorbiditatile, iii) tratamente anterioare si modul in care acestea au fost tolerate, iv) sange standard si biomarkeri relevanti, v) scanari istorice , deoarece nu au fost oferite alte scanări în timpul perioadei de tratament și vi) starea clinică generală a pacientului. Aceste date împreună cu informațiile publicate privind tumoarea specifică au fost luate în considerare atunci când a fost estimată supraviețuirea preconizată pentru pacienții individuali pancreatici. Speranța de viață a pacientului, conform previziunilor oncologiste, a variat între câteva zile și aproximativ 12 luni.deoarece nu au fost oferite alte scanări în timpul perioadei de tratament și vi) starea clinică generală a pacientului. Aceste date împreună cu informațiile publicate privind tumoarea specifică au fost luate în considerare atunci când a fost estimată supraviețuirea preconizată pentru pacienții individuali pancreatici. Speranța de viață a pacientului, conform previziunilor oncologiste, a variat între câteva zile și aproximativ 12 luni.deoarece nu au fost oferite alte scanări în timpul perioadei de tratament și vi) starea clinică generală a pacientului. Aceste date împreună cu informațiile publicate privind tumoarea specifică au fost luate în considerare atunci când a fost estimată supraviețuirea preconizată pentru pacienții individuali pancreatici. Speranța de viață a pacientului, conform previziunilor oncologiste, a variat între câteva zile și aproximativ 12 luni.

Calcule statistice

Diferențe semnificative au fost testate de One Way ANOVA. Ipotezele de analiză a varianței (homocedesență și normalitate) au fost testate și asigurate prin utilizarea seturilor de date transformate atunci când este necesar. Semnificația a fost acceptată la P <0,05 în toate cazurile.

Declarație privind disponibilitatea datelor

Seturile de date generate în timpul și / sau analizate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Logo-ul scirepului

About Editorial Board For Authors Scientific Reports
Sci Rep . 2017; 7: 13998.
Publicat online 2017 Oct 25 doi: 10.1038 / s41598-017-14571-x
PMCID: PMC5656641
PMID: 29070896
O formulare a pro-enzimelor pancreatice oferă o eficacitate potentă anti-tumorală: un studiu pilot axat pe cancerul pancreatic și ovarian
Macarena Perán , autorul corespunzător 1, 2 Elena López-Ruiz , 1, 2 María Ángel García , 2, 3, 4 Shorena Nadaraia-Hoke , 5 Ralf Brandt5 Juan A. Marchal , 2, 4, 6 și Julian Kenyon autorul corespunzător 7

Material suplimentar electronic

Recunoasteri

Autorii mulțumesc, de asemenea, cu recunoștință dr. Klaus Kutz pentru revizuirea atentă a manuscrisului.

Contribuțiile autorului

MP conceperea și proiectarea studiului, analiza și interpretarea datelor, redactarea articolului și aprobarea finală a manuscrisului depus. Concepția JK și proiectarea studiului, furnizarea datelor pacientului și aprobarea finală a manuscrisului depus. Colectarea, analiza și interpretarea datelor ELR, SNH și MAG. RB și JAM proiectarea studiului, analiza datelor și revizuirea articolului. Toți autori: aprobarea finală a manuscrisului depus.

notițe

Interese concurente

Dr. Julian Kenyon este fondatorul și directorul științific al companiei Propanc Pty Ltd și deține acțiuni în cadrul companiei. Propanc Pty Ltd a finanțat Universitatea din Jaen și vivoPharm LLC pentru a efectua această cercetare.

Note de subsol

Material suplimentar electronic

Informații suplimentare însoțesc această lucrare la 10.1038 / s41598-017-14571-x.

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutră în ceea ce privește pretențiile jurisdicționale în hărțile publicate și afilierile instituționale.

Informații despre colaboratori

Macarena Perán, se.neaju@narepm .

Julian Kenyon, moc.cinilcevod@noyneknj .

Referințe

1. Reticker-Flynn NE, ș.a. O platformă de matrice extracelulară combinatorie identifică interacțiunile matricei extracelulare celulare care se corelează cu metastazele. Nat. Commun. 2012; 3 : 1122. doi: 10.1038 / ncomms2128. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
2. Thiery JP. Epilare-mezenchimale tranzitorii în progresia tumorii. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2 : 442-454. doi: 10.1038 / nrc822. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
3. Kalluri R, Weinberg RA. Elementele de bază ale tranziției epitelio-mezenchimale. Journal of Clinical Investigation. 2009; 119 : 1420-1428. doi: 10.1172 / JCI39104. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
4. Jordão BP, Terra WR, Ribeiro AF, Lehane MJ, Ferreira C. Secreția de tripsină în midgutul midian Musca domestica: Un studiu biochimic și imunocitochimic. Insect Biochem. Mol. Biol. 1996; 26 : 337-346. doi: 10.1016 / 0965-1748 (95) 00084-4. CrossRef ] Google Scholar ]
5. Wald M, și colab. Amestecul de tripsină, chymotrypsin și papain reduce formarea metastazelor și extinde timpul de supraviețuire a șoarecilor C57Bl6 cu melanomul syngeneic B16. Cancer Chemother. Pharmacol.2001; 47 (Suppl): S16-S22. doi: 10.1007 / s002800170004. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
6. Saruc M, și colab. Extractul de enzime pancreatice îmbunătățește supraviețuirea în cancerul pancreatic murin. Pancreas. 2004; 28 : 401-412. doi: 10.1097 / 00006676-200405000-00009. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
7. Perán M, Marchal JA, García MA, Kenyon J, Tosh D. Tratamentul in vitro al liniilor celulare de carcinom cu enzimele (pro) pancreatice suprimă programul EMT și promovează diferențierea celulelor.Cell. Oncol. 2013; 36 : 289-301. doi: 10.1007 / s13402-013-0134-8. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
8. Sakalová A, et al. Studiu de cohortă retrografică a unei terapii aditive cu un preparat enzimatic oral la pacienți cu mielom multiplu. Cancer Chemother. Pharmacol. 2001; 47 (Suppl): S38-S44. PubMed ] Google Scholar ]
9. Beuth J, și colab. Impactul aplicării enzimelor orale complementare asupra rezultatelor tratamentului postoperator al pacienților cu cancer de sân – rezultate ale unui studiu de cohortă epidemiologic multicentric retroreflexiv. Cancer Chemother. Pharmacol. 2001; 47 (Suppl): S45-S54. doi: 10.1007 / s002800170009. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
10. Popiela T, Kulig J, Hanisch J, Bock PR. Influența unui tratament complementar cu enzimele orale asupra pacienților cu cancer colorectal – un studiu de cohortă epidemiologic retrolectiv. Cancer Chemother.Pharmacol. 2001; 47 (Suppl): S55-S63. doi: 10.1007 / s002800170010. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
11. Wood W, și colab. Rănirea rănilor recapitulează morfogeneza în embrionii Drosophila. Nat. Cell Biol.2002; 4 : 907-12. doi: 10.1038 / ncb875. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
12. Hanahan D, Weinberg RA. Semnele distinctive ale cancerului. Cell. 2000; 100 : 57-70. doi: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81683-9. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
13. Yan C, și colab. Rinoplarea mediată de interferența ARN a VEGF și bFGF suprimă secreția de endostatină în celulele carcinomului pancreatic. Oncol. Lett. 2013; 5 : 1031-1035. Articolul gratuit PMC ]PubMed ] Google Scholar ]
14. Cao R și colab. Colaborarea colaborativă între FGF-2 și VEGF-C promovează limfangiogeneza și metastazarea. Proc. Natl. Acad. Sci. 2012; 109 : 15894-15899. doi: 10.1073 / pnas.1208324109.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
15. Marchal, J. a. și colab . Purificarea și extinderea pe termen lung a celulelor multipotent endoteliale, cu regenerare cardiovasculară potențială. Celulele stem și dezvoltarea 21 (2012). PubMed ]
16. Li D, și colab. Blocarea dublă a factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) și a factorului de creștere fibroblastic bazic (FGF-2) prezintă efecte anti-angiogenice puternice. Cancer Lett. 2016; 377 : 164-173. doi: 10.1016 / j.canlet.2016.04.036. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
17. Pavcnik D, și colab. Evaluarea angiografică a altoirii arterei carotide cu grefele submucoase cu diametru mic prefabricat, cu mici intestine submucoase la ovine. Cardiovasc. Intervent. Radiol. 2009; 32 : 106-113. doi: 10.1007 / s00270-008-9449-7. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
18. Voulgari A, Pintzas A. Tranziția epitelială-mezenchimică în metastazele cancerului: mecanisme, markeri și strategii pentru a depăși rezistența medicamentului în clinică. Biochimica et Biophysica Acta – Recenzii despre cancer. 2009; 1796 : 75-90. doi: 10.1016 / j.bbcan.2009.03.002. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
19. Wan L, Pantel K, Kang Y. Metastaze tumorale: mișcări noi de cunoștințe biologice în clinică. Nat. Med.2013; 19 : 1450-1464. doi: 10.1038 / nm.3391. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
20. Vergara D, și colab. Epilare-mezenchimie în cancerul ovarian. Cancer Lett. 2010; 291 : 59-66. doi: 10.1016 / j.canlet.2009.09.017. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
21. Yuan Y, și colab. Supraexpresia YAP promovează tranziția epitelio-mezenchimică și rezistența la chimioterapie în celulele cancerigene pancreatice. Mol. Med. Rep. 2016; 13 : 237-242. doi: 10.3892 / mmr.2015.4550. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
22. Parikh A, și colab. microRNA-181a are un rol critic în progresia cancerului ovarian prin reglarea tranziției epitelio-mezenchimale. Nat. Commun. 2014; 5 : 2977. doi: 10.1038 / ncomms3977.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
23. Adham SAI și colab. Vizualizarea imunohistologică în corelația dintre markerii neuropilin-1 și markerii de tranziție mezenchimală epitelială în cancerul ovarian epitelial. J. Histochem. Cytochem. 2014; 62 : 619-31. doi: 10.1369 / 0022155414538821. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
24. Arumugam T, și colab. Tranziția epitelială la mezenchimie contribuie la rezistența la medicament în cancerul pancreatic. Cancer Res. 2009; 69 : 5820-5828. doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-08-2819.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
25. Yamada S și colab. Tranziția epitelio-mezenchimală prezice prognosticul cancerului pancreatic. Surg.(Statele Unite ale Americii) 2013; 154 : 946-954. PubMed ] Google Scholar ]
26. Cates JMM, și colab. Etichete de tranziție mezenchimale epiteliale-mezenchimale în adenocarcinomul ductal pancreatic. Pancreas. 2009; 38 : e1-e6. doi: 10.1097 / MPA.0b013e3181878b7f.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
27. Cavallaro U, Christofori G. Aderența celulară și semnalizarea de către cadherine și Ig-CAM în cancer.Nat. Rev. Cancer. 2004; 4 : 118-132. doi: 10.1038 / nrc1276. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
28. Rachagani S, și colab. MUC4 potențează invazia și metastazarea celulelor cancerigene pancreatice prin stabilizarea receptorului factorului de creștere fibroblast 1. Carcinogeneză. 2012; 33 : 1953-1964. doi: 10.1093 / carcin / bgs225. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
29. Alaee M, Danesh G, Pasdar M. Plakoglobin Reduce in vitro creșterea, migrarea și invazia celulelor canceroase ovariene care exprimă N-Cadherin și p53 mutant. Plus unu. 2016; 11 : e0154323. doi: 10.1371 / journal.pone.0154323. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
30. Suyama K, Shapiro I, Guttman M, Hazan RB. O cale de semnalizare care conduce la metastaze este controlată de N-caderină și de receptorul FGF. Cancer Cell. 2002; 2 : 301-314. doi: 10.1016 / S1535-6108 (02) 00150-2. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
31. Nakajima S, și colab. Exprimarea N-cadherinei și tranziția epitelială-mezenchimică în carcinomul pancreatic. Clin. Cancer Res. 2004; 10 : 4125-4133. doi: 10.1158 / 1078-0432.CCR-0578-03. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
32. Chiang KC, și colab. Analogul vitaminei D, MART-10, reprima potențialul metastazelor prin reducerea reglării tranziției epitelio-mezenchimale în celulele cancerului pancreatic. Cancer Lett. 2014; 354 : 235-244. doi: 10.1016 / j.canlet.2014.08.019. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
33. Li W, și colab. Resveratrol inhibă tranziția epitelio-mezenchimică a celulelor cancerului pancreatic prin suprimarea căii PI-3K / Akt / NF-κB. Curr Med Chem. 2013; 20 : 4185-4194. doi: 10.2174 / 09298673113209990251. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
34. Huang TS, și colab. O angiogeneză indusă de estrogen favorizează adenomioza prin activarea axei Slug-VEGF în celule epiteliale endometriale. J. Cell. Mol. Med. 2014; 18 : 1358-1371. doi: 10.1111 / jcmm.12300. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
35. Guo W, și colab. Slug și Sox9 determină în mod cooperativ starea mamară a celulelor stem. Cell. 2012;148 : 1015-1028. doi: 10.1016 / j.cell.2012.02.008. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
36. Li, A. și colab . Fascinul este reglementat de slug, promovează progresia cancerului pancreatic la șoareci și este asociat cu rezultatele pacientului. Gastroenterologie 146 (2014). Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
37. Zhang X, și colab. Evaluarea preclinică a eficacității anticanceroase și a proprietăților farmacologice ale FBA-TPQ, un nou analog sintetic de makaluvamin. Mar. Drugs. 2012; 10 : 1138-1155. doi: 10.3390 / md10051138. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
38. Yang M, și colab. Compusul natural sulforaphena, ca un nou reactiv anticanceros, care vizează calea de semnalizare PI3K-AKT în cancerul pulmonar. Oncotarget. 2016; 7 : 76656-76666.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] Google Scholar ]
39. Wang H, Li M, Rinehart JJ, Zhang R. Pre-tratamentul cu dexametazonă crește activitatea antitumorală a carboplatinei și gemcitabinei la șoareci purtători de xenogranți ai cancerului uman: activitatea in vivo , farmacocinetica și implicațiile clinice pentru chimioterapia cancerului. Clin. Cancer Res. 2004; 10 : 1633-1644. doi: 10.1158 / 1078-0432.CCR-0829-3. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
40. Wang, W. și colab . KCN1, un agent anticancer sintetic de sinteză noi: activități in vitro și cancer in vitro anti-pancreatic și farmacologie preclinică. PLoS One 7 (2012). Articol gratuit PMC ] [ PubMed ]
41. Talmadge JE, Singh RK, Fidler IJ, Raz A. Modele pentru a evalua strategiile terapeutice noi și convenționale pentru cancer. A.m. J. Pathol. 2007; 170 : 793-804. doi: 10.2353 / ajpath.2007.060929.Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
42. Partecke LI, și colab. Un model murine ortotopic orginologic de adenocarcinom pancreatic la șoarecele C57 / BL6 utilizând liniile celulare Panc02 și 6606PDA. Euro. Surg. 2011; 47 (2): 98-107. PubMed ] Google Scholar ]
43. Ding XZ, Tong WG, Adrian TE. Ciclooxigenazele și lipoxigenazele ca ținte potențiale pentru tratamentul cancerului pancreatic. Pancreatology. 2001; 1 : 291-299. doi: 10.1159 / 000055827. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
44. Liebow C, Rothman SS. Circulația enteropancreatică a enzimelor digestive. Știință (80-). 1975; 189 : 472-474. doi: 10.1126 / science.1154022. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
45. Ziv E, Lior O, Kidron M. Absorbția proteinei prin peretele intestinal. Un model cantitativ. Biochem.Pharmacol. 1987; 36 : 1035-1039. doi: 10.1016 / 0006-2952 (87) 90411-4. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
46. Gewert K, Holowachuk S, Rippe C, Gregory P, Pierzynowski S. Nivelele enzimelor din sânge nu sunt afectate de administrarea orală a preparatului enzimatic pancreatic (Creon 10,000) la porcii insuficienți ai pancreasului. Pancreas. 2004; 28 : 80-88. doi: 10.1097 / 00006676-200401000-00013. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
47. Rothman S, Liebow C, Isenman L. Conservarea enzimelor digestive. Physiol. Rev. 2002; 82 : 1-18. doi: 10.1152 / physrev.00022.2001. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
48. Wood JM, și colab. PTK787 / ZK 222584, un inhibitor roman și potențial al factorului de creștere vascular endotelial tirozin kinazei, afectează răspunsurile induse de factorul de creștere endotelial vascular și creșterea tumorilor după administrarea orală. Cancer Research. 2000; 60 (8): 2178-2189. PubMed ] Google Scholar ]
49. Wallis, NG Activitatea antiangiogenă a inhibitorilor derivați din fragmentul METAP2. Analele Oncologiei . 23 (Supliment 1), i26-i44 (2012).
50. Weixin L, și colab. Combretastatina A4 reglează proliferarea, migrarea, invazia și apoptoza celulelor canceroase tiroidiene prin calea de semnalizare PI3K / Akt. Med. Sci. Monit. 2016; 22 : 4911-4917. doi: 10.12659 / MSM.898545. Articolul gratuit PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
51. Annabi B, și colab. Hipoxia promovează migrația celulară derivată din maduva osoasă și formarea tubului. Celule stem. 2003; 21 : 337-347. doi: 10.1634 / stemcells.21-3-337. PubMed ] [ CrossRef ] Google Scholar ]
52. Ichigotani Y, Yokozaki S, Fukuda Y, Hamaguchi M, Matsuda S. Exprimarea forțată a NESH suprimă motilitatea și diseminarea metastatică a celulelor maligne. Cancer Res. 2002; 62 : 2215-2219. PubMed ] Google Scholar ]

Articolele din rapoartele științifice sunt furnizate aici prin amabilitatea Nature Publishing Group