Abstract
Pierderea musculară, cunoscută sub numele de cașexie, este o stare debilitantă asociată cu inflamația cronică, în timpul cancerului. Mijloacele benefice s-au dovedit a optimiza tonul inflamator sistemic în timpul unei sănătăți bune; cu toate acestea, interacțiunile dintre microbi și imunitatea gazdă în contextul cașexiei sunt înțelese incomplet. Aici folosim modele animale de soarece pentru a testa rolurile pentru bacterii în sindroamele de risipă/irosire musculară.
Aflăm că hrănirea cu un microb comens la om, Lactobacillus reuteri, la șoareci este suficientă pentru a reduce indicii sistemici ai inflamației și a inhiba cașexia. Mai mult, fenomenul de construcție a mușchilor microbieni se extinde la îmbătrânirea normală, deoarece animalele de tip sălbatic au prezentat niveluri crescute ale hormonului de creștere și reglarea în sus a boxei N1 [FoxN1] asociată cu retenția glandelor timus și longevitate. Interesant este faptul că șoarecii cu o gena FoxN1 defectuoasă (athymic nude) nu reușesc să inhibe sarcopenia după terapia cu L. reuteri , indicând un mecanism mediat de FoxN1.
În concluzie, bacteriile simbiotice pot servi pentru a stimula funcțiile FoxN1 și thymic care reglează inflamația, oferind posibile alternative pentru prevenirea cașexiei și cunoașterea rolurilor pentru microbiota în ontogeniile și filogenia mamiferelor.
INTRODUCERE
Cachexia este un sindrom de risipă caracterizat prin țesut adipos și atrofie musculară [ 1 – 3 ]. Cachexia este observată la pacienții cu cancer [ 1 ], boala pulmonară obstructivă cronică [COPD] [ 4 ] și scleroza multiplă [MS] care cauzează deficiențe serioase și decese prematură [ 5 ]. Cachexia a fost asociată cu inflamația cronică, în special cu neutrofilele, cum ar fi la pacienții cu BPOC [ 4 ]. Modelele de șoarece, cum ar fi șoarecele mutant Apc Min / + [ApcMIN] de polipoză intestinală [ 6 ], au fost utilizate pentru a studia casexia asociată cancerului datorită nivelurilor necontrolate de interleukină (IL) -6 și alte răspunsuri inflamatorii ale gazdei [ 10 ]. Contribuțiile microbiomei intestinului la polipoza intestinală au fost examinate în modelul de șoarece ApcMIN [ 11-13 ]. În plus față de numeroșii polipi intestinali și cașexia pre-maligne, șoarecii ApcMIN prezintă, de asemenea, o involuție timică prematură [ 14 ] legată de decesul timpuriu la o vârstă fragedă.
Pierderea musculară, numită sarcopenie, este, de asemenea, o caracteristică a unui proces natural de îmbătrânire care contribuie la dizabilitate și deces [ 15 , 16 ]. Insuficiența funcțională a mușchilor scheletici și atrofia asociată cu senilitatea au fost documentate la șoareci [ 17-19 ]. Șoarecele a fost folosit în mod extensiv pentru a studia mecanismele moleculare care stau la baza saropeniei legate de vârstă [ 20 ]. La mamifere, îmbătrânirea prematură a fost convingătoare legată de capacitatea de a controla inflamația prin intermediul glandei timus și generarea de limfocite CD4 + [ 21-26 ]. Aceste date acumulate arată că masele thymice crescute cu programarea corectă a timocitelor contribuie la un sistem imunitar robust, care este esențial pentru o sănătate bună susținută [ 12-19 ]. Astfel, factorii care stimulează masa timică au o semnificație biologică vastă și un potențial terapeutic în tulburările de sănătate asociate cu inflamația.
Factorul transcripțional Caseta N1 [FoxN1] a fost identificată ca un factor-cheie în programarea unui sistem imunitar timus și gazdă [ 27 , 28 ]. Oamenii cu defecte la FoxN1 au atrofie timmică și disfuncție imună, precum și alopecie și depresie mentală. Expresia FoxN1 absentă la șoareci, cunoscută sub denumirea de șoareci niti amimi, nu are o glandă timusă funcțională și în consecință suferă îmbătrânire prematură și susceptibilitate la infecții și cancer asociate cu disfuncție imună [ 29 ]. Foarte important, sa demonstrat că terapia cu FoxN1 stimulează regenerarea glandei timus [ 30 – 32 , 33 ] indicând relevanța terapeutică potențială. Relațiile dintre expresia gazdei FoxN1 și microbiome nu au fost descrise anterior.
Lactobacillus reuteri este o bacterie Gram-pozitivă a acidului lactic care colonizează tractul gastro-intestinal al mamiferelor și al păsărilor.
Prototipul Lactobacillus reuteri ATCC-PTA-6475 a fost inițial izolat din laptele matern uman.
Lactobacillus reuteri este considerat un probiotic tipic și s-a demonstrat că ameliorează tulburările gastrointestinale infecțioase și neinfecțioase atât la oameni, cât și la animale [ 34-36].
Mai intai am aratat ca L. reuteri umane inhiba dezvoltarea cancerului la soareci [ 37 ] si transmite diferite fenotipuri de sanatate si fitness, incluzand cresterea crescuta a parului si contracararea schimbarilor legate de varsta in testicule si glanda tiroida [ 38-41 ]. Aceste studii au completat bacteriile bazate pe paradigma „ipotezei de igienă”, astfel încât locuitorii țărilor dezvoltate au sisteme imunitare de capacitate redusă de reglementare datorită micilor microbi, cu diete rafinate, antibiotice și nașteri caesare [ 42-44 ]. În acest context, expunerile la nivelul microbilor perinatali au evidențiat efecte transgeneraționale la descendenți, incluzând un sindrom asemănător scurtei, cu athymia împreună cu pierderea musculară, creșterea parului scazut, acumularea masivă a neutrofilelor și creșterea cancerelor de plămâni și ficat, la animalele nepoate [ 45 ]. În încercarea de a conecta punctele, sa emis ipoteza că eșecul de a se dezvolta în descendenți se datorează insuficienței thymogenezei și a dysregulării imune ulterioare care predispune la cancer mai târziu în viață. Recunoscând că factorul de transcripție epitelial FoxN1 este esențial în embriologia și timogeneza, am testat dacă modularea microbilor a FoxN1 este un factor plauzibil de unificare care implică microbiota în economia gazdă și succesul evolutiv.
Aici evaluăm strategiile microbiene pentru a inhiba pierderea musculară în modelele murine. Se întâlnește o creștere a masei musculare la șoarecii care consumă un microb Lactobacillus reuteri benefic. Descoperim că masa musculară asociată cu Lactobacillus reuteri coincide cu numărul normat de neutrofile din sânge și de reținerea dimensiunii tinere a glandelor timus. Mai departe, descoperim că FoxN1 este reglat în sus în epiteliul timus după tratamentul cu Lactobacillus reuteri , proporțional cu masa musculară și a țesutului. În cele din urmă, descoperim că șoarecii cu deficit de FoxN1 nu reușesc să beneficieze de tratamentul microbian în comparație cu controlul de tip sălbatic. Luate impreuna rezultatele noastre sugereaza ca microbiota/flora intestinala commensal moduleaza factori de transcriptie gazda, cum ar fi FoxN1, care sunt pivot in fitness, supravietuire si evolutia mamiferelor.
REZULTATE
Beneficiul microbului Lactobacillus reuteri inhibă cazexia asociată cancerului
Cancerul asociat cu cancer apare la aproape jumătate din toți pacienții cu cancer și este o cauză principală a decesului prematură [ 1-3 ]. Pentru a investiga mai întâi dacă indivizii care suferă de cachexie asociată cancerului pot beneficia de consumul de microbi beneficii, am testat modelul de șoarece ApcMIN utilizat pe scară largă, predispus la cachexia cancerului [ 46 ]. Doisprezece șoareci C57BL / 6 ApcMIN de opt săptămâni au fost repartizați aleatoriu în grupuri de șase șoareci pe tratament și apoi tratați continuu până la vârsta de cinci luni. Așa cum era de așteptat, la vârsta de 5 luni, șoarecii ApcMIN pe care l-am utilizat au avut greutăți corporale semnificativ mai mici comparativ cu controalele lor de tip sălbatic, potrivite în funcție de vârstă (greutate corporală ApcMIN, medie și plus, SE = 21,48 & plusmn 0,65 vsgreutate corporală de tip sălbatic, medie și plus, SE = 42,39 & plusmn, 2,95, p = 0,0014). Pentru evaluare am selectat gastrocnemiusul care este un mușchi rapid convulsiv și, prin urmare, mai sensibil la cachexia cancerului în comparație cu alte mușchi [ 47 ]. Analizând mușchiul gastrocnemius al șoarecilor ApcMIN am constatat că hrănirea cu Lactobacillus reuteri în apa de băut a dus la masele musculare gastrocnemius ( p <0,05) mai mari (Figura 1A 1A ).
A. Raportul în greutate mușchi-corp și parametrii histomorfometrici critici care reflectă dimensiunea fibrelor musculare sunt semnificativ îmbunătățite cu tratamentul cu probiotice [ n = 6]. B. Histologia tipică a mușchiului gastrocnemius care compară șoarecii tratați cu L. reuteri cu martori netratați [ n = 6]. Profilurile de secțiune transversală a fibrelor musculare sunt mai mari la șoarecii tratați. Dietarul L. reuteri C. reduce nivelul neutrofilelor din sânge D. salvează masa timemică și E. contractează formarea polipilor intestinali la niveluri semnificative din punct de vedere statistic. Numerele de pe axa y a grafurilor de bare corespund sumei medie și plusM a parametrilor evaluați; * p <0,05, *** p <0,0001. Hematoxilină și eozină. Scări de bare: 25 μm (B)
După examinarea histopatologică a mușchiului gastrocnemius, șoarecii ApcMIN au prezentat un aspect general al fibrelor musculare cu o secțiune transversală mai mică la șoareci netratați comparativ cu cei tratați cu Lactobacillus reuteri , sugerând că Lactobacillus reuteri protejează împotriva casexiei de cancer. Microscopic, fibrele musculare ale șoarecilor netratati au prezentat leziuni ușoare, ocazionale de atrofie incluzând fibrele vacuolate, palide și hialinizate și infiltrarea macrofagelor focale și a celulelor mononucleare și fibroza.Aceleași leziuni au lipsit de la șoarecii tratați cu Lactobacillus reuteri . De asemenea, nucleele interne au fost ușor identificate în fibrele musculare ale șoarecilor netratați; prin contrast, prezența nucleelor interne nu a putut fi observată la șoarecii care consumă probioticul.
Pentru a confirma și a cuantifica acest rezultat morfometric, am analizat fibrele musculare gastrocnemius ale celor două grupe de șoareci. Am constatat că șoarecii ApcMIN hrăniți cu Lactobacillus reuteri au avut o secțiune transversală medie ( p <0,0001) semnificativ mai mare decât fibrele musculare comparativ cu martorii (Figura 1A și 1B ). Apoi am folosit diametrul minim al Feretului de fibre musculare care generează un parametru geometric care rămâne în mare măsură neafectat de calcularea greșită datorită unghiurilor de orientare și de tăiere a fibrelor musculare [ 48 ]. Pentru aceasta, am calculat apoi diametrul minim al Feretului de fibre musculare transversale. Încă o dată, am constatat că fibrele musculare ale șoarecilor tratate cu Lactobacillus reuteri au avut un diametru Feret minim semnificativ mai mare comparativ cu șoarecii netratați (Figura ( Figura 1A 1A ).
Știind că pacienții cu cancer de cachexie prezintă trăsături de inflamație sistemică [ 1 – 3 ], am examinat mai departe sângele integral de șoareci min netratați. Folosind neutrofilele circulante ca marker pentru inflamația sistemică, hemogramele au arătat că numărul de neutrofile a fost semnificativ crescut ( p <0,05) la ApcMIN netratat comparativ cu șoarecii testați cu Lactobacillus reuteri (Figura 1C ).
Studiile anterioare au arătat că șoarecii ApcMIN prezintă creșteri sistemice incontrolabile la factorii inflamatori IL-6, IL-1b și TNF-a, acești factori aceștia fiind, de asemenea, asociați cu cașexia la pacienți cancer.Cu toate acestea, în gazde sălbatice cu competențe imunologice, neutrofilele și alți factori înnăscuți ai celulelor imune sunt reglați productiv prin limfocitele T CD4 + care apar în glanda timus ( 44 , 49-51 ).Știind că soarecii ApcMIN sunt predispuși la involuția timică prematură [ 14 ], am evaluat în continuare dacă mărimea glandelor timus a fost modificată la animale tratate oral cu Lactobacillus reuteri . Am constatat că glanda timus a șoarecilor ApcMIN care consumă bacteria probiotică a cântărit semnificativ mai mult ( p<0,001) în comparație cu martorii netratați (Figura 2D ).
A. Greutatea gastrocnemiusului raportat la greutatea corporală și mijloacele pentru suprafața fibrelor musculare și diametrul minim al lui Feret sunt semnificativ mai mari la șoarecii tratați cu probiotice [ n = 10] în comparație cu controalele corespunzătoare vârstei [ n = 10]. B. Forma finală a imaginilor utilizate pentru analiza morfometrică a fibrelor musculare. Fibrele musculare sunt analizate ca particule după prelucrarea imaginilor cu ImageJ. Comparația de la o parte la alta prezintă profiluri de fibre musculare mai mari din cauza tratamentului cu bacterii probiotice. Numerele de pe axa y a grafurilor de bare corespund sumei medii & SEM a parametrilor evaluați. * p <0,05, *** p <0,0001. Pictura originală a imaginii: hematoxilină și eozină. Scări de bare: 100 μm (B)
În timp ce glanda timus produce limfocite care reglează procesele inflamatorii gazdă și inhibă cancerul, se înțelege, de asemenea, că inflamația sistemică cronică asociată cu cancerul contribuie la involuția timică [ 14 , 52 ]. Pentru a aborda această posibilitate, am numărat polipii intestinali la șoareci ApcMIN cu și fără hrănire cu probiotice. S- a descoperit că Lactobacillus reuteri nu doar inhibă cașexia, ci și reduc povara tumorilor intestinale ( P <0,05) (Figura 1E ). Acest lucru se potrivește cu studiile anterioare privind cașexia la șoarecii ApcMIN [ 7-10 ], precum și alte lucrări recente care arată că hrănirea cu Lactobacillus . reuteri suprimă formarea tumorilor mamare, pulmonare și hepatice la șoareci [ 44,45,51 ]. Aceasta ridică întrebarea privind puiul și oul, indiferent dacă este vorba de deficite imune înnăscute, de disfuncții ale timului sau de tumorigeneză care inițiază cașexie la șoareci ApcMIN. De asemenea, crește posibilitatea ca cașexia redusă și inflamația sistemică la șoarecii ApcMIN după tratamentul cu Lactobacillus reuteri să se datoreze diminuării sarcinii tumorale.
Tratamentul cu Lactobacillus reuteri protejează șoarecii de tip sălbatic din sarcopenia asociată vârstei
Pe lângă bolile precum cancerul, scăderea masei musculare numită „sarcopenie” este un indicator al procesului natural de îmbătrânire. Pentru a testa efectul protector al Lactobacillus reuteri împotriva atrofiei musculare într-un cadru experimental fără neoplazie, am folosit în continuare șoareci de tip sălbatic de tip sălbatic, de 1 an, de vârstă de 1 an. Pentru aceste experimente, 20 de șoareci CD-1 excluși au fost tratați continuu începând cu vârsta de două luni până la vârsta de un an.gastrocnemius al șoarecilor CD1 vârstnici care consumau Lactobacillus reuteri a cântărit semnificativ mai mult ( p <0,05) comparativ cu șoarecii martor netratați (Figura 2A ). De asemenea, analiza histomorfometrică a acestui mușchi a arătat că ambele părți ale secțiunii transversale a fibrelor musculare și diametrul minim al lui Feret au fost semnificativ mai mari ( p <0,0001) la șoarecii tratați cu probiotice comparativ cu martorii (Figura 2A și 2B ). Acest rezultat sugerează că Lactobacillus reuteri au protejat șoarecii CD1 de sarcopenie asociată cu senilitatea.
Șoarecii hrăniți cu Lactobacillus reuteri au o masă mai mare a glandei timus și o durată de viață mai mare
Bazându-se pe constatarea că șoarecii ApcMIN cu predispoziție la cașexie au o timus mai mare atunci când consumă Lactobacillus reuteri , am testat dacă un fenomen similar a fost observat și la șoarecii CD1 vârstnici. Într-adevăr, timusul șoarecilor CD1 tratați cu probiotice la vârsta de un an a fost mai mare (Figura 3A ) și a cântărit semnificativ mai mult ( p <0,001) decât timusul de control (Figura 3B ). Cunoscând că timopoieza și cașexia au fost anterior legate de hormonul de creștere [ 53-56 ], am testat nivelurile de proteine serice și am descoperit creșteri semnificative ale hormonului de creștere (Figura 3C ). Nivelurile crescute ale hormonului de creștere corespund constatărilor anterioare cu alți hormoni hipotalamo-pituitari după administrarea orală cu Lactobacillus reuteri [ 57 ].
A. Apariția brută tipică a glandei timusice la șoarecii CD1 tratați cu L. reuteri [ n = 10] și control netratat [ n = 10]. Observați dimensiunea mai mare a glandei timusului la șoarecele tratat cu probiotice. B. Greutatea glandei timus / raportul greutate corporală este crescută în mod semnificativ la șoarecii CD1 după consumarea bacteriei probiotice. C. Curbele de supraviețuire ale cohortelor de șoareci CD1 [n = 8 per grup de tratament] care prezintă avantajul de longevitate conferit de suplimentul dietetic L. reuteri . D. Efectul lui L. reuteriasupra suprimării neutrofilelor din sânge este așa cum se așteaptă la șoarecii CD1 de control sălbatic. În același timp, totuși, acest efect benefic este pierdut în cazul șoarecilor cu deficit de FoxN1. Axa y ilustrează SEM medie și plus SEM a parametrilor analizați.
Masele musculare mai mari și masele de timus mai mari sugerează că Lactobacillus reuteri contracarează patologiile asociate cu senilitatea. Pentru a accesa dacă acest lucru a avut un efect palpabil asupra longevității șoarecilor, am folosit apoi șoareci CD1 în vârstă pentru analiza supraviețuirii. Am constatat că șoarecii care consumă probiotic au avut un avantaj statistic semnificativ ( p <0,01) în comparație cu controlul netratat (Figura 3D). Pentru a testa dacă consumul de Lactobacillus reuteri și creșterea longevității coincid cu un ton inflamator sistemic scăzut, am testat în continuare nivelurile de neutrofile sanguine ale șoarecilor CD1. Am constatat că șoarecii CD1 care consumă probiotic au avut un număr semnificativ mai mic ( p <0,01) de neutrofile în sângele lor, comparativ cu controalele de vârstă corespunzătoare (Figura 3E ). Acest lucru a arătat că Lactobacillus reuteri acționează, cel puțin parțial, prin restaurarea homeostaziei imune a gazdei și scăderea tonusului inflamator sistemic.
Lactobacillus reuteri reglează expresia FoxN1
Știind că șoarecii care consumă Lactobacillus reuteri au o timus mai mare și că acea boală cu capotă a factorului transcripțional N1 [FoxN1] a fost identificată drept cheie în epiteliogeneza timidă și în programarea unei glande timus normale și a sistemului imunitar gazdă [27,28], am examinat ulterior FoxN1 . Bredenkamp și colaboratorii (2014) au arătat recent că expresia FoxN1 thymic inductibilă are ca rezultat regenerarea robustă a timusului involuat al șoarecilor vârstnici [ 32 ], crescând probabilitatea de relevanță fiziologică.Următoare, prin urmare, am testat dacă timusul tineresc indus de Lactobacillus reuteri observat la șoareci CD1 vârstnici a coexistat cu expresia FoxN1 ridicată. Pentru aceasta, am aplicat o pată imunohistochimică specifică FoxN1 în țesuturile timusului de șoareci (Figura 4A ). Am constatat că timusul șoarecilor tratati cu Lactobacillus reuteri a avut un număr semnificativ mai mare ( p <0,0001) de celule FoxN1-pozitive în comparație cu timusul șoarecilor de control corespunzători vârstei (Figura 4A și 4B ). Celulele pozitive FoxN1 au fost histomorfologic compatibile cu celulele epiteliale timice și localizate în primul rând la medulla, în special la limitele cu cortexul bogat în limfocite. Celulele epiteliale cu celule FoxN1, totuși, au existat și în număr mai mic în zonele corticale.
A. Imunohistochimia specifică FoxN1 pe secțiunile glandelor timusice ale șoarecilor tratați cu L. reuteri [ n = 10] și netratați [ n = 10]. Componenta celulară epithelială timidă FoxN-1 este mai densă la șoarecii tratați cu probiotice. B. Rezultatele numărării morfometrice a celulelor FoxN-1 pozitive în glanda timus. C. Efectul L. reuteri în suprimarea neutrofilelor din sânge este cel așteptat la șoarecii de control CD1. Acest efect benefic este pierdut la șoarecii cu deficit de FoxN1. IHC; Cromogenul de diaminobenzidină, contrastul cu hematoxilină. Scări de bare: 25 μm (A). Axa y a graficelor de bare ilustrează SEM-ul mediu și plus al parametrilor analizați. * p <0,05, *** p <0,0001.
Șoarecii șoareci cu o gena defectă FoxN1 imită condiția umană cu atima, cu deficit imun și cu pielea fără păr [ 29 ]. Pentru a testa dacă beneficiile induse de microorganisme necesită FoxN1, am folosit ulterior șoareci masculi de tip sălbatic de 3 luni și FoxN1 cu deficit de CD1. Am constatat că șoarecii de tip sălbatic care consumă Lactobacillus reuteri probiotice aveau un număr semnificativ mai mic ( p <0,01) de neutrofile în sângele lor, comparativ cu controalele lor de vârstă (Figura 4C ); totuși, șoarecii nud cu absența FoxN1 nu au prezentat diferențe în numărul de neutrofile după tratamentul cu Lactobacillus reuteri (Figura 4C ).
FoxN1 este necesar pentru retenția masei musculare asociată microbilor
După ce s-a demonstrat că abilitatea Lactobacillus reuteri comestibile în reducerea neutrofilelor sistemice depinde de FoxN1 intact, am folosit în continuare același model de șoarece pentru a testa dacă FoxN1 este de asemenea necesar pentru efectele benefice ale probioticelor asupra mușchilor scheletici. Pentru aceste studii, zece șoareci athymic nud [CD-1 genetic background] și zece martori CD-1 corespunzători vârstei au fost subdivizate aleatoriu [ n = 5 șoareci pe grup] și apoi tratați continuu începând cu vârsta de opt săptămâni pentru o durata de patru săptămâni. Muschiul gastrocnemius al șoarecilor sălbatici tratați cu Lactobacillus -reuteri a fost semnificativ ( p <0,01) mai greu decât în cazul controalelor netratate (Figura 5A ). Astfel, suplimentarea dietei cu acest microb a dus la mușchi mai mari la șoarecii de tip sălbatic. În același timp, totuși, efectul Lactobacillus R asupra greutății gastrocnemius a fost negat la șoarecii receptori care nu au gena FoxN1(Figura 5A ). Pentru a elabora acest rezultat am analizat morfometric fibrele musculare gastrocnemius. La șoarecii de tip sălbatic, tratamentul cu Lactobacillus R a condus la o creștere statistic semnificativă atât a mărimii fibrelor musculare ( p <0,01) cât și a diametrului Feret ( p <0,01). Prin contrast, aceiași parametri morfometrici au fost comparabili între șoarecii cu deficit de FoxN1 tratați cu Lactobacillus R și ne-tratați (Figura 5A și 5B ).
A. În timp ce șoarecii de control de tip sălbatic [ n = 5] prezintă îmbunătățirile standard în raportul greutate musculară-corp și mărimea fibrelor musculare datorită tratamentului probiotic [ n = 5], șoarecii cu deficit de FoxN1 [ n = 5 per grupul de tratament] nu reușesc să replice același fenomen. B. Fibrele musculare gastrocnemius ale șoarecilor tratați cu L. reuteri și netratați cu FoxN1 au o dimensiune comparabilă. Numerele de pe axa y a grafurilor de bare corespund sumei medii & SEM a parametrilor evaluați. ** p <0,001, NS: p > 0,05. Pictura originală a imaginii: hematoxilină și eozină. Scară bare: 100 μm. Pentru a crește vizibilitatea limitelor fibrelor musculare, canalul albastru al imaginii HE originale a fost obținut utilizând pluginul de imagine de tip HJ pentru deconvoluția de culoare a lui ImageJ. Produsul de imagine a fost apoi transformat în tonuri de gri și îmbunătățit uniform folosind comanda de niveluri din Photoshop (B)
DISCUŢIE
Aici evaluăm strategiile microbiene pentru a inhiba pierderea musculară în contextul cașexiei de cancer și, de asemenea, în timpul îmbătrânirii normale. Descoperim în ambele sisteme model o masă musculară crescută la șoareci consumând un microb bun uman Lactobacillus reuteri . Împreună cu riscul scăzut de pierdere a mușchilor, hrănirea de rutină a L. reuteri în apa de băut reduce numărul de neutrofile din sânge utilizat ca marker surogat pentru inflamația sistemică. În același timp, șoarecii care mănâncă L. reuteriprezintă, de asemenea, o dimensiune crescută a glandei timusului, proporțională cu reglarea în sus a Cutiei cu Forkhead [Fox] N1 în epiteliul timus după tratamentul cu L. reuteri . În cele din urmă, pentru a cerceta mecanismul molecular, descoperim că șoarecii niti atipici cu deficit de FoxN1 nu au reușit să beneficieze de tratamentul microbian. Luate impreuna rezultatele noastre sugereaza ca microbiota commensal modulati gazda factori de transcriptie, cum ar fi FoxN1, care sunt pivot in fitness gazda si de supravietuire prin reglementarea tonului inflamator gazda pentru a imparti raspunsuri imune echilibrate (Figura 6 ). În acest fel, microbiota oferă o țintă tractabilă pentru a promova homeostazia sistemică, reducând riscul pierderii musculare și al altor morbidități asociate inflamației.
Dozarea orală de rutină a microbilor inhibă sindroamele de pierdere a mușchilor, incluzând cașexia și sarcopenia. Microbiota stimulează timopoieza și reglează tonul inflamator sistemic împreună cu musculatura printr-un mecanism dependent de FoxN1.
O constatare cheie este că suplimentul alimentar cu un microb, L reuteri , a împiedicat atrofia musculară la șoareci. În studiile viitoare va fi interesant să se examineze greutatea corporală în timp și criterii funcționale, cum ar fi puterea de prindere pentru îmbunătățire după administrarea de bacterii. În studiile anterioare sa arătat că consumul general de alimente nu a fost modificat prin hrănirea L reuteri la șoareci [ 39 ], dar acest lucru nu a fost examinat în mod specific aici. În timp ce în studiul de față L. reuteri aprevenit atrofia musculară asociată senilității la șoarecii CD1 vârstnici, cașexia musculară în modelul de șoarece ApcMIN este mai complicată. Tratamentul cu L. reuteri la șoareci ApcMIN a redus povara tumorală intestinală similar cu ceea ce a fost observat anterior în alte tipuri de tumori [ 37 , 45 ]. Acest lucru face dificilă evaluarea dimensiunii contribuției reduse a sarcinii tumorale în prevenirea cașexiei asociate cancerului. Studiile suplimentare care utilizează tratamentul cu L. reuteri în diferite modele de șoareci de cașexie sunt necesare pentru a arunca o lumină asupra acestui efect probiotic.
Cachexia a fost asociată cu inflamația sistemică cronică, în special cu neutrofilele, în maladiile de sănătate cum ar fi cancerul sau BPOC [ 4 ]. Numărul de neutrofile din sânge este un marker surogat utilizat pe scară largă pentru inflamația sistemică. Câteva linii de dovezi implică neutrofilele stimulatoare ale tractului gastrointestinal și alte celule ale celulelor imune înnăscute, care conduc la formarea tumorilor pe tot corpul [ 11 , 49 , 58 – 64 ]. Pentru a elucida echilibrul imun sistemic care inhibă astfel de boli, studiile anterioare s-au axat pe relațiile sistemice reciproce dintre neutrofile și limfocitele T ale imunității adaptive [ 37 , 60 , 65-70 ]. În contextul cancerului, neutrofilele au fost identificate pe modele animale și pe oameni ca un factor important în inițierea și dezvoltarea cancerului [ 60 , 67 , 71-79 ].
Pentru a restabili și pentru a menține sănătatea bună, rețelele imune înnăscute [cum ar fi cele care implică neutrofile] sunt persistente reglate de activitățile antiinflamatorii ale CD4 + T REG [ 49 , 59 , 80 ]. Conform acestei linii de raționament, cancerele asociate mai frecvent cu inflamație apar cu o bliț inhibitor de TGR-mediată, cu consecințe ale neutrofilei și IL-6 crescute, crescând riscul de cașexie [ 51 ]. În studiile anterioare, fenotipurile microbiene au fost transplantabile utilizând subseturi de limfocite CD4 + foarte bine purificate [ 49 , 58 , 59 , 81 ]. Rămâne de determinat care subseturi specifice de limfocite T participă la procesele homeostatice legate de mușchi.
În timpul tineretii, locul maturării limfocitelor T este timusul, iar glanda timusului servește, de asemenea, la echilibrarea activităților unui sistem imunitar funcțional normal în timpul maturității. Observarea glandelor timusului mărită după consumarea L. reuteri în studiul de față nu a fost complet surprinzătoare.Până la urmă, concentrarea prezentă asupra timusului a apărut din studiile anterioare privind ipoteza de igienă, care dezvăluie fenomene transgeneraționale reparabile ale unei atimiții asemănătoare scurtei care au implicat efecte microbiene perinatale asupra timusului infantil [ 45 ]. La mamifere, involuția timomatică prematura a fost legată în mod convingător de un spectru larg de tulburări imune care au dus la eșecul de a se distinge de sine față de non-auto [ 22 , 23 ] și incapacitatea de a contracara bolile infecțioase și cancerul.Atrofia timiană spontană similară a fost descrisă la șoareci ApcMIN [ 14 ]. Atrofia thymică coincide cu observațiile privind „ipoteza de igienă”, astfel încât locuitorii țărilor dezvoltate au sisteme imunitare cu o capacitate de reglementare imună redusă de-a lungul vieții care coincide cu antibioticele și nașterile cezariene [ 42-44 ]. Un numitor comun este acela că capacitatea de reglementare a imunității afectată conduce la răspunsuri inflamatorii necontrolate și, în cele din urmă, la cancerele asociate cu inflamația și la alte dizabilități mai târziu în viață [ 43-45 ]. Observațiile actuale care implică cașexia se potrivesc cu aceste studii anterioare utilizând îmbogățirea dietetică cu bacterii benefice [ 37 , 39 ]. Este interesant măsura în care nivelurile hormonilor hipotalamo-pituitari, cum ar fi hormonul de creștere în studiul prezent, par să se suprapună în sănătatea timusului și în homeostazie [ 53 ]. Oxytocina [ 57 , 82 , 83 ], testosteronul [ 40 ] și hormonul tiroidian [ 41 ] au fost, de asemenea, descoperite anterior ca fiind modulate de bacteriile ingerate care pot afecta masa musculară a gazdei în aceste studii. Oxitocina poate ajuta direct sau indirect la susținerea musculaturii [ 57 , 82 , 83 ].
O nouă descoperire importantă este creșterea expresiei proteinei FoxN1 în țesutul timid după consumarea bacteriilor probiotice. FoxN1 face parte din factorii de transfrontare a familiei frunze sau de helix înaripat [ 84 ] care ajută la controlul producției de limfocite T. FoxN1 este un regulator principal în specificația de linie a celulelor epiteliului timus [TEC] prin faptul că promovează transcripția genelor descendente, care, la rândul lor, reglementează diferențierea TEC. În special, FoxN1 reglează, în principal, modelarea TEC în etapa fetală și homeostazia TEC la timusul postnatal [ 28 ]. Chiar și în timpul îmbătrânirii normale se înregistrează o scădere treptată a timusului și a sistemului imunitar, rezultând imunitatea adaptivă insuficientă predispunând la infecții și cancer. În acest fel, glanda timus a fost propusă ca o „Fântână a Tineretului” pentru rolurile sale cheie în sistemul imunitar și, prin urmare, sănătatea sistemică. Prin stimularea artificială a FoxN1 , a fost posibilă reconstrucția timusului senescent al șoarecilor vârstnici [ 31 , 32 ]. Acest lucru ridică faptul că probabilitatea ca ținta microbiotei să moduleze semnalizarea Wnt și să ridice FoxN1 va contribui la susținerea activităților tinere ale timusului.
FoxN1-gena si proteine sunt , de asemenea , în mod direct sau indirect important în multe alte procese de dezvoltare, reglementarea sistemului imunitar, metabolismul, cancerul și îmbătrânirea [ 84 ]. Embriologic, țesutul bogat în FoxN1 provine din epiteliul celei de-a treia pungi faringiene [ 85 ]. Proteina codificată este propusă pentru a regla, de asemenea, diferențierea keratinocitelor care dau șoarecilor mutanți atimi nazali aspectul lor fără păr. Este de remarcat faptul că blana luxuriantă – o caracteristică a reglării în sus a proteinei FoxN1 – este de asemenea un fenotip proeminent la șoarecii care mănâncă L. reuteri [ 38]. Ca urmare a defectelor imune și foliculare [producția de păr], șoarecii nudi cu deficit de FoxN1 sunt folosiți pe scară largă ca sistem model în oncologie, imunologie, dermatologie și studii de transplant. Șoarecele nud are, de asemenea, subdezvoltare a țesutului mamar și este ineficient la alăptarea tinerilor [ 86 ]. La om, expresia FoxN1 este ridicată în țesutul cerebral, iar alterarea creierului a fost descrisă la fetușii care poartă mutația homozigotă FoxN1 [ 87 ]. În special, FoxN1 este puternic exprimat în celulele gliale care contribuie semnificativ la inteligența umană [ 88]. FoxN1 este legat de calea de semnalizare Wnt, oferind un posibil mecanism ontologic și sistemic care leagă microbii de timogenie [ 89 ].]. Nivelurile sistemice de hormon de creștere au fost, de asemenea, implicate în dezvoltarea musculară și timogeneza [ 53
Recunoscând faptul că factorul de transcripție epitelial FoxN1 este esențial în timusul, foliculii de păr și dezvoltarea glandelor mamare, am motivat că modularea microbilor ecologici ai FoxN1 este un unificator plauzibil al microbiotei în ontogenie și filogenie [ 90 ]. Expresia FoxN1 în țesutul glandei tiroide poate ajuta la explicarea reglării în sus a sângelui T4 după consumul de L. reuteri de șoareci [ 41 ]. În plus față de funcția tiroidiană, FoxN1 are câțiva numitori comuni cheie cu evoluție, supraviețuire și fitness mamifere: a) timogeneză cu control rafinat al auto- vs– în timpul sarcinii placente susținute; b) în fumatul robust pentru reglarea termică; și c) mammogeneza pentru hrana pentru descendenții placentari. Împreună, acestea susțin ideea că interacțiunile dintre microorganismele gazdă și FoxN1 asigură stâlpii pentru viața mamiferelor.
În concluzie, microbiota poate oferi strategii noi pentru a reduce pierderea musculară și pentru a restabili sănătatea sistemică bună. Descoperirea noastră că bacteriile comestibile Lactobacillus reuteri au efecte benefice asupra masei musculare a șoarecilor furnizează dovezi elementare pentru prezența unei axe a mușchiului microbiotar-schelet intestinal la mamifere. Cercetările ulterioare privind mecanismele care stau la baza acestei axe noi și testele privind existența acesteia la om pot oferi noi alternative pentru prevenirea cașexiei asociate cancerului și a altor tulburări de pierdere a mușchilor.
Controlul proporțional în sus al FoxN1 în epiteliul timus prin terapie cu microorganisme orale Lactobacillus reuteri unifică bacteriile și homeostazia imună. Am arătat anterior că preparatele sterile de microbi sunt suficiente pentru a inhiba carcinogeneza la șoareci [ 44], iar potențialul terapeutic al fracțiilor microbiene rămâne de examinat în stabilirea cașexiei.
Luate impreuna rezultatele noastre sugereaza ca microbiota commensal moduleaza elasticitatea gazdei prin intermediul FoxN1 pentru a regla tonul inflamator al gazdei pentru raspunsuri imune eficiente, dar echilibrate, cu restaurarea rapida a homeostaziei dupa aceea. În acest fel, microbiota / flora intestinala oferă o țintă tractabilă pentru a conferi homeostaziei sistemice scăderea riscului de morbiditate asociată inflamației.
MATERIALE SI METODE
animale
Toate animalele au fost adăpostite în cadrul Asociației pentru evaluarea și acreditarea îngrijirilor animalelor de laborator (AAALAC) și au fost menținute cu aprobarea Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale (IACUC) la Institutul de Tehnologie din Massachusetts. Apc Min / + șoareci [ApcMIN] pe un fundal C57BL / 6J au fost inițial obținuți din laboratoarele Jackson și crescuți în casă pentru a furniza copii de vîrstă Apc Min / + și sălbatici (wt) pentru experimente care implică cazexie de cancer. Au fost utilizați șobolani convenționali CD-1 convenționali din Elveția (Charles River, Wilmington, MA) pentru studiile de îmbătrânire, fără prezența cancerului. Pentru a testa relevanța FoxN1, șoarecii azmi homozigoți amiși Crl: NU (NCr) – Foxn1 nu(Charles River, Wilmington, MA) au fost provocate cu administrare de microbi pe cale orală începând cu vârsta de opt săptămâni. Fiecare experiment a inclus 5-10 animale pe sex pe grup de tratament, efectuat în duplicat, așa cum este descris în detaliu mai jos.
Administrarea L. reuteri
În fiecare experiment, subseturi de șoareci au primit în apa de băut o tulpină de Lactobacillus reuteriATCC-PTA-6475 cultivată așa cum este descris în altă parte [ 57 , 91 ]. Organisme vii au fost livrate la o doză de pornire de 3,5 x 10 5 organisme / șoarece / zi în apa de băut cu un număr bacteriene vii în sticle de apă calculat așa cum este descris în detaliu în Lakritz et al (2014) [ 37 ]. Șoarecii de control au primit apă potabilă regulată. Apă potabilă proaspătă pentru ambele grupuri de animale a fost înlocuită de două ori pe săptămână pe tot parcursul experimentelor.
Proiectare experimentală
Experimentul 1
Pentru a cerceta rolurile microbiotei în cazexia cancerului, șoareci C57BL / 6 Apc Min / +[ApcMIN] cu vârsta de opt săptămâni au fost repartizați aleatoriu în grupuri de șase șoareci pe tratament și au primit în apa lor de băut Lactobacillus reuteri ATCC-PTA-6475 așa cum este descris mai sus și în altă parte [ 57 , 91 ] continuu până la vârsta de cinci luni.
Experimentul 2
Pentru a testa dacă terapia orală cu microbii intestinali afectează pierderea musculară în timpul îmbătrânirii normale și independentă de cancer, am examinat în continuare 20 de șoareci CD-1 excluși. Șoarecii experimentali au primit în apă de băut L reuteri ATCC-PTA-6475 așa cum s-a descris mai sus, începând cu vârsta de două luni până la vârsta de un an.
Experimentul 3
Pentru a testa dacă FoxN1 este necesar pentru avantajele terapiei orale cu microbi intestinali, am examinat în continuare zece șoareci CD-1 nudit athymic și zece martori CD-1 corespunzători vârstei. Șoarecele experimental a fost subîmpărțit la întâmplare și apoi a primit în apă de băut L reuteri ATCC-PTA-6475 așa cum s-a descris mai sus începând cu vârsta de opt săptămâni pe o durată de patru săptămâni.
Necropsia și colectarea probelor
Șoarecii au suferit necropsie după supradozajul cu CO 2 și exsanguinația. Sângele integral, mușchiul gastrocnemius și glanda timus au fost colectate pentru diferite analize. Eșantioanele intestinale au fost aplatizate pentru numerele macroscopice ale polipilor intestinali.
Numărul total de celule din sânge
Sânge întreg a fost colectat prin puncție cardiacă de la animale inconștiente la necropsie și suspendat în EDTA pentru a preveni coagularea. Numărul de neutrofile automate a fost apoi efectuat utilizând parametrii șoareci într-un HemaVet 950FS (Drew Scientific, Oxford CT).
Nivelurile serice ale hormonului de creștere
Sânge integral a fost colectat prin puncție cardiacă de la animale inconștiente la necropsie pentru a obține ser pentru testele hormonale. Nivelurile hormonului de creștere serică la șoarecii CD-1 vârstnici au fost testați prin radioimunoanaliză (AniLytics Corp, Gaithersburg MD).
Determinarea masei musculare scheletice și a glandei timus
După necropsie, întregul șoarece, plus mușchiul gastrocnemius stâng și glanda timusă completă au fost cântărite utilizând o scară ScoutPro SP202 [Chaus Corporation, Pinebrook NJ].
Histopatologie și imunohistochimie
Pentru evaluarea histologică, mușchii gastrocnemius fixați cu formalină și glandele timus au fost înglobate în parafină, tăiate la 4 pm și colorate cu hematoxilină și eozină sau imunohistochimie. Pentru morfometrie s-au folosit secțiuni transversale din linia mediană a mușchiului gastrocnemius al șase șoareci selectați aleatoriu pe grup experimental. Două imagini de mărire x10 au fost captate din zonele standardizate ale fiecărei secțiuni transversale a gastrocnemiusului. Suprafața fibrelor musculare și diametrul lui Feret au fost calculate automat în fiecare imagine folosind comanda „particule de analiză” a programului de prelucrare și analiză a imaginilor ImageJ (NIH, Bethesda, MD) pe baza unei metodologii descrise anterior. Un total de aproximativ 4000 fibre musculare au fost analizate pe grup experimental.Imunohistochimia specifică FoxN1 a fost realizată cu anticorpi policlonali anti-FoxN1 de iepure (anticorp-online GmbH, Aachen, Germania). Recuperarea antigenului indusă de căldură a fost realizată cu tampon EDTA, pH 8. Pictograma IHC și histomorfometria cantitativă a celulelor IHC pozitive în imaginile de mărire mare x40 au fost realizate așa cum s-a descris anterior [57 ].
analize statistice
Datele au fost comparate între grupuri utilizând analiza Mann-Whitney U. Semnificația statistică a fost stabilită la P <0,05. Toate analizele au fost efectuate cu Graphpad Prism versiunea 5.0 pentru ferestre, programul GraphPad, San Diego
Note de subsol
FINANȚAREA
Această lucrare a fost susținută de granturile naționale pentru instituțiile de sănătate R01CA108854 (către SEE) și U01 CA164337 (SEE).
CONFLICTE DE INTERESE
Nu există interese financiare sau comerciale concurente.
Contribuția autorului
Concepute și proiectate experimentele: BJV, SG, TL, JRL, SM, SEE. Efectuarea experimentelor: BJV, SG, TL, JRL, KT, SM, SEE. Analiza datelor: BJV, TP, SG, JRL, SM, CK, SEE. Reactivi / materiale / instrumente de analiză contribuite: TP, SEE. Scrierea hârtiei: BJV, TP, SEE.
REFERINȚE
Articolele de la Oncotarget sunt oferite aici prin amabilitatea Impact Journals, LLC
TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice 