Abstract
Cancer-casexia (CC) este o afecțiune multifactorială caracterizată prin scăderea consumului de alimente și pierderea greutății corporale datorită musculaturii reduse, cu sau fără pierderea masei grase. Pacienții cu cancer gastric au o incidență ridicată de cașexie. Am stabilit anterior un nou model de șobolan Cancer-casexia CC indus de celule 85As2 derivate din cancerul gastric uman pentru a examina fiziopatologia Cancer-casexia CC și a identifica terapeutica potențială. La pacienții cu Cancer-casexia CC, se observă deseori anorexie, în ciuda creșterii ghrelinului, ceea ce sugerează că rezistența la ghrelin poate să apară la acești pacienți.
În acest studiu, ne-am propus să clarificăm apariția rezistenței ghrelin la Cancer-casexia șobolanii CC însoțită de anorexie și am investigat dacă rikkunshito (RKT), un medicament tradițional japonez Kampo care potențează semnalizarea ghrelinelor, aameliorat anorexia asociată cu Cancer-casexia CC prin ameliorarea rezistenței ghrelinice.
Șobolanii care suferă de tumori 85As2 au prezentat simptome severe ale Cancer-casexia CC, incluzând anorexia și pierderea greutății corporale / musculaturii, cele din urmă fiind mai mari la șobolanii cachectici decât la șobolanii care nu poartă tumori sau sunt hrăniți cu pereți.
Șobolanii cu Cancer-casexia CC au prezentat răspunsuri slabe la injectarea intraperitoneală de ghrelin. La șobolanii cu Cancer-casexia CC, nivelele de ghrelină din plasmă au fost ridicate, iar nivelele mRNA de peptidă anorexigenă hipotalamică au fost scăzute, în timp ce mRNA receptorului secretor de hormon de creștere hipotalamic ( GHS-R ) nu a fost afectat.
In vitro , rikkunshito RKT a amplificat direct activarea GHS-R indusă de ghrelin. rikkunshito RKT administrată pe cale orală timp de 7 zile a atenuat parțial răspunsul slab la ghrelin și ameliorarea anorexiei fără a afecta creșterea nivelurilor de ghrelină plasmatică la Cancer-casexia șobolani CC. Expresia ARN mRNA neuropeptide h hipotalamice orexigene, dar nu mRNA GHS-R hipotalamic a fost crescută prin rikkunshito RKT.
Astfel, modelul de șobolan cu Cancer-casexia CC indusa de celule 85As2 a dezvoltat rezistența la ghrelin, contribuind eventual la anorexie și la scăderea în greutate corporală.
Mecanismul prin care rikkunshito RKT a ameliorat anorexia în modelul de Cancer-casexia șobolan CC poate implica atenuarea rezistenței ghrelinelor prin intensificarea semnalizării ghrelinelor.Aceste constatări sugerează că rikkunshito RKT poate fi un agent promițător pentru tratamentul Cancer-casexia CC.
Introducere
Sindromul de anorexie-cachexie a cancerului, care apare la 80% dintre pacienții cu cancer avansat, este o boală multifactorială caracterizată prin scăderea aportului alimentar și pierderea greutății corporale și reprezintă cel puțin 20% din decesele legate de cancer [ 1-3 ]. Pierderea în greutate, cea mai proeminentă caracteristică clinică a cașexiei, se observă la 30-80% dintre pacienții cu cancer, cu variații observate în funcție de tipul tumorii [ 2 ]. De exemplu, pierderea in greutate are loc la o frecventa foarte mare (83%) la pacientii cu cancer gastric si pancreatic, dar este mai putin proeminenta la pacientii cu cancer de san, leucemie acuta nelimfocitara si sarcoame [ 2 ]. Citokinele inflamatorii derivate din celulele canceroase și celulele imunitare gazdă, incluzând interleukina (IL) -1, IL-6, factorul de necroză tumorală (TNF) -α și factorul inhibitor al leucemiei (LIF), sunt implicați în dezvoltarea anorexiei canceroase [ 4 – 7 ]. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza acestui sindrom nu sunt pe deplin înțelese și nu au fost stabilite terapii adecvate pentru tratamentul casexiei (CC) de cancer.
Atât în diagnosticul, cât și în tratamentul cancerului anorexie-cașexie, tratamentul apetitului este important deoarece întărește rezistența fizică și îmbunătățește calitatea vieții (QOL) și menținerea greutății corporale.Într-adevăr, consumul nutrițional reprezintă 20% din QOL la pacienții cu cancer [ 8 ]. Mai mult decât atât, pacienții cu cancer avansat cu satietate timpurie au un risc crescut de deces de 30% [ 9 ]. În consecință, ameliorarea anorexiei legate de cașexie la pacienții cu cancer este cheia îmbunătățirii atât a QOL, cât și a prognosticului.
Într-un studiu anterior, am stabilit noi modele de șobolani anorexia-cachexia de cancer prin implantarea șobolanilor nudi cu celule MKN45clone85 sau 85As2 [ 10 ], ambele derivate din linia celulară de cancer de stomac MKN-45 [ 11 ]. Modelul de CC indus de 85As2 prezintă cachexie mai veche și mai severă decât modelul MKN45cl85, permițând evaluarea mai rapidă a parametrilor CC asociați cu QOL proastă la pacienți.
Ghrelin, o peptidă cu 28 de aminoacizi, este un ligand endogen al receptorului secretogenului hormonului de creștere (GHS-R) și este secretat în principal din celulele asemănătoare X / A din stomac. Mai multe alte țesuturi, inclusiv hipotalamusul și pancreasul, exprimă niveluri scăzute de ghrelin [ 12 , 13 ]. Ghrelin este singura peptidă orexigenică secretă periferic și se cunoaște că are un efect intens de stimulare a apetitului [ 14 ]. În plus, ghrelinul stimulează secreția hormonului de creștere (GH), motilitatea gastrică și secreția de acid gastric [ 15 ]. Mai mult, ghrelinul din plasmă crește ca răspuns la postul prelungit și scade rapid după hrănire datorită efectelor sale orexigene, sugerând că ghrelinul periferic reglează apetitul [ 16 ]. La rozătoare, injecția centrală sau periferică a ghrelinului mărește aportul alimentar și greutatea corporală [ 17]. De aceea, ghrelinul poate avea aplicații în tratamentul terapeutic al sindromului de anorexie-cachexie a cancerului și sa demonstrat că ameliorează simptomele de cașexie la modelele pe animale purtătoare de tumori și la pacienții cu cancer [ 18,19 ]. Cu toate acestea, la pacienții cu anumite tipuri de CC, concentrațiile plasmatice de ghrelină sunt ridicate, dar încă apare anorexia. Prin urmare, rezistența la ghrelin poate fi observată în starea patologică [ 20-23 ], iar reducerea rezistenței la ghrelin poate fi o țintă terapeutică potențială pentru tratamentul CC.
Rikkunshito (RKT), un medicament tradițional japonez (medicina Kampo), a fost aprobat de Ministerul Sănătății, Muncii și Bunăstării din Japonia și este prescris în general ca un remediu pentru diferite sindroame gastrointestinale superioare, cum ar fi anorexia, dispepsia, și gastrită. Într-un studiu multicentric, dublu-orb, randomizat, controlat cu placebo, sa demonstrat că RKT ameliorează dispepsia funcțională [ 24]. La diferite modele experimentale pe animale și la oameni, RKT previne anorexia printr-un mecanism care implică creșterea secreției de ghrelină [ 25-28 ]. În plus, sa demonstrat că RKT potențează semnalizarea ghrelin prin creșterea activității GHS-R [ 29 , 30 ]. Recent, am demonstrat că RKT ameliorează simptomele CC într-un nou model de șobolan CC indus de 85As2 [ 10 ]. Rămâne neclar dacă secreția sau răspunsul ghrelin crescut este legată de mecanismele specifice prin care RKT previne anorexia cancerului – cachexia în acest model.
În acest studiu, ne-am propus să clarificăm apariția rezistenței la ghrelin în modelul nostru de șobolan anorexie-cașexie și am investigat sensibilitatea acestor șobolani la administrarea ghrelinelor exogene. Mai mult, am investigat dacă RKT ameliorat anorexia în modelul nostru de șobolan CC prin intermediul unui mecanism care implică atenuarea rezistenței ghrelinelor.
materiale si metode
Experimentul pe animale
Șoarecii F344 / NJcl-rnu / rnu masculi de șase săptămâni (CLEA Japan, Tokyo, Japonia) au fost găzduiți individual sub un ciclu de lumină-întuneric 12: 12 h (luminile sunt aprinse la ora 08:00) la o temperatură și umiditate cu acces liber la alimente (CE-2, CLEA Japonia) și apă. Șobolanii au fost lăsați să se aclimatizeze în condițiile de laborator timp de 2 săptămâni înainte de experimentare. Toate studiile au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru experimentele pe animale și aprobate de Comitetul pentru Etică în Experimentarea Animalelor din cadrul Centrului Național pentru Cancer (aprobările nr. T09-050-M02 și T09-050-C04). Aceste linii directoare au respectat standardele etice privind animalele experimentale din Japonia, conform legii.
Linii celulare și condițiile culturii
Celulele 85As2 s-au stabilit din celulele cancerului gastric uman MKN-45 descrise anterior [ 11 ]. Celulele au fost menținute în mediu RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonia) suplimentat cu ser 10% fetal bovin (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 UI / ml penicilină G sodică și 100 pg / streptomicină sub o atmosferă de 5% C02 la 37 ° C. Celulele 293A de rinichi embrionare umană (HEK) 293A care au exprimat în mod stabil GHS-R s-au menținut în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM, glucoză înaltă, Wako, Osaka, Japonia) suplimentat cu 10% FBS, 100 UI / ml sulfat de streptomicină și 500 ug / ml soluție apoasă disulfat G418 (Nacalai Tesque, Inc.) sub o atmosferă de 5% C02 la 37 ° C.
Pregătirea modelului CC și a șobolanilor hrăniți cu perechi
Modelul de șobolan CC indus de celule 85As2 a fost preparat așa cum s-a descris mai înainte [ 10 ]. Pe scurt, celulele s-au menținut în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% FBS, 100 UI / ml penicilină G sodică și 100 pg / ml sulfat de streptomicină sub o atmosferă de 5% C02 la 37 ° C. Celulele 85As2 au fost recoltate din culturi subconfluente după o scurtă expunere la 0,25% tripsină și 0,2% acid etilendiaminotetraacetic. Celulele s-au spălat o dată în mediu fără ser și s-au resuspendat în soluție salină tamponată cu fosfat. Șobolanii anesteziați prin inhalarea izofluranului de 1-2,5% (Mylan, Osaka, Japonia) au fost inoculați subcutanat (sc) cu 1 x 107 celule / situs 85As2 (șobolani care poartă tumori) sau salină (șobolani de control care nu poartă tumori) flancul stâng și dreapta, respectiv în ziua 0. Axele majore și minore ale tumorii au fost măsurate și volumul tumorii a fost estimat utilizând următoarea ecuație: volumul tumorii (cm3) = axa principală (cm) × axa minoră (cm) × axa minoră (cm) × 1/2 [ 31 ]. Șobolanii hrăniți cu șobolan au primit o cantitate de alimente care a fost aceeași cu cea consumată de șobolanii CC indusă de 85As2 în ziua precedentă (zilele 1-15), cantitatea de alimente pentru șobolanii hrăniți în pereche în ziua 1 a fost echivalentă cu cea a cachecticului șobolani în ziua 0). S-au evaluat greutatea corporală, greutățile țesuturilor organelor, consumul de alimente și apă, nivelul glucozei plasmatice și expresia mRNA a hormonului de peptidă orexigenic / anorexigenic în regiunile hipotalamice. Greutatea corporală și consumul de alimente și apă au fost măsurate zilnic până în ziua 14 sau 15. În ziua 14 (șobolani CC și șobolani de control care nu sufereau tumori) sau 15 (șobolani hrăniți cu perechi), șobolanii au fost anesteziați prin inhalare de 1-2,5 % izofluran și sângele colectat din aorta abdominală a fost imediat supus măsurării concentrației plasmatice a glucozei utilizând un sistem pilot de glucoză (IWAI Chemicals Company, Tokyo, Japonia). Creierul a fost imediat disecat și depozitat la -80 ° C până la hibridizarea in situ . Țesuturile organelor au fost imediat disecate și cântărite.
Evaluarea efectelor orexigene ale injectării ghrelinului exogen
Șobolanii au fost implantați sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 107 celule / sit) în ziua 0. Șobolanii inoculați cu soluție salină au servit ca grup de control care nu poartă tumori. Alimentele și aportul de apă au fost măsurate săptămânal până în ziua 14. După 2 săptămâni (ziua 14), șobolanii au fost injectați intraperitoneal (ip) cu ghrelin de șobolan (10 nmol / animal, Institutul Peptide, Osaka, Japonia) măsurată timp de o oră după injectare. A doua zi, șobolanii au fost injectați cu soluție salină, iar alimentația și aportul de apă au fost măsurate timp de 1 oră. Salina sau ghrelinul a fost injectat între orele 10:00 și 13:00.
Efectele RKT asupra atenuării efectelor orexigene induse de ghrelin la șobolanii CC
RKT a fost fabricat de către Tsumura și Co. (Tokyo, Japonia) prin uscarea prin pulverizare a unui extract de apă fierbinte din următoarele opt medicamente brute pentru a forma un extract pulverulent: 18,6% Atractylodis lanceae rhizoma (rizom de Atractylodes lancea De Candolle, Compositae) % De ginseng radix (rădăcină de Panax ginseng CA Meyer, Araliaceae), 18,6% tubel Pinelliae (tuber de Pinellia ternateBreitenbach), 18,6% Hoelen (sclerotium Poria cocos Wolf, Polyporaceae), 9,3% Zizyphi fructus (fructul Zizyphus jujuba Miller var ( Rinacea ), 4,3 % Glycyrrhizae radix (rădăcină și stolon de Glycyrrhiza uralensis Fisher, Leguminosae) și 2,3% Zingiberis rhizoma (rhizomul de Zingiber officinale Roscoe, Zingiberaceae). RKT a fost dizolvat în apă distilată (DW) la g / 10 mL în laboratorul nostru și a fost administrat prin gavaj oral. Șobolanii au fost implantați sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 107 celule / sit) în ziua 0. Șobolanii inoculați cu soluție salină au servit ca grup de control care nu poartă tumori. Șobolanii care sufereau tumori au fost împărțiți în două grupe: un grup de tratament (85As2 + RKT) și un grup de control al tumorilor (85As2 + DW). Grupul de tratament a fost administrat pe cale orală RKT de două ori pe zi la 1 g / kg / zi timp de 7 zile (de la ziua 14 până în ziua 20). Grupului de control purtător al tumorii și șobolanilor care nu poartă tumori s-au administrat DW (10 ml / kg) în aceeași perioadă. Pentru evaluarea efectelor orexigene induse de ghrelin, șobolanii au fost injectați ip cu ghrelin (10 nmol / animal) în ziua 21, iar consumul alimentar a fost măsurat timp de 1 oră sau 22 ore după injectare. A doua zi, șobolanii au fost injectați ip cu vehicul (soluție salină) ca martor, iar consumul de alimente a fost măsurat timp de 1 oră sau 22 h.
Efectele RKT asupra anorexiei-cachexiei, ghrelinului plasmatic și a peptidei orexigene / anorexigenice hipotalamice în modelul CC
Într-o procedură similară cu cea utilizată pentru evaluarea efectelor RKT asupra atenuării efectelor orexigene induse de ghrelin la șobolanii indusă de 85As2, s-au preparat trei grupuri (control + DW, 85As2 + DW și 85As2 + RKT). Aportul alimentar și greutatea corporală au fost măsurate săptămânal până în ziua 14 și zilnic după aceea. În plus față de creșterea și pierderea în greutate după administrare, datele privind greutatea corporală în zilele 14-21 după administrarea RKT sau DW au fost exprimate utilizând următoarea relație ca comparații zilnice:% din pre (%) = greutatea corporală a fiecărui animal după administrare zilele 15-21) / greutatea corporală a fiecărui animal înainte de administrare (în ziua 14) × 100. Aportul de alimente după administrarea RKT sau DW a fost calculat ca valoarea medie zilnică din zilele 16 până la 21 după cum urmează: consumul mediu zilnic de hrană pentru fiecare animal (după) – consumul de hrană al fiecărui animal (înainte).
În ziua 21, pentru măsurarea concentrațiilor plasmatice de acil ghrelin, șobolanii au fost anesteziați cu izofluran, sângele colectat din aorta abdominală a fost centrifugat (1700 x g timp de 10 minute) și plasmă a fost păstrată la -80 ° C până la analiză. Pentru măsurarea mARN – urilor neuropeptidului Y ( NPY ) și GHS-R și a hibridizării in situ , creierul sau hipotalamusul a fost imediat disecat și depozitat la -80 ° C până la analiză.
Măsurarea concentrațiilor plasmatice de grelină
Sângele colectat din aorta abdominală a fost centrifugat (1700 x g timp de 10 minute). Pentru a preveni degradarea acil ghrelinului, plasmă a fost imediat tratată cu 1/10 volum de HCI 1 M. Plasma a fost stocată la -80 ° C până la analiză. Nivelele plasmatice de acil ghrelină au fost măsurate utilizând un kit de testare a imunosorbantului enzimatic (ELISA) (SCETI, Tokyo, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului.
Extracția ARN, transcripția inversă și reacția în lanț în timp real a polimerazei (PCR)
PCR în timp real a fost realizat așa cum s-a descris mai sus [ 32 ]. Pe scurt, suprafața hipotalamică a fost disecată pe o placă metalică rece pe gheață și ARN-ul total a fost izolat utilizând un kit Isogen (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Primul catenar ADNc a fost transcris invers din 5 ug ARN total utilizând sistemul de sinteză SuperScript First-Strand (Invitrogen) într-un volum final de 100 pl. Cromatografia rapidă (2 pL) a fost amplificată într-un ciclu termic rapid (LightCycler, Roche Diagnostics, Barcelona, Spania) folosind LightCycler 480 SYBR Green I MasterMix (Roche) și următoarele primeri: GHS-R1a , 5'-GAAAGCAAACACCACCACAG-3'- și (invers) 5'-AGGAAGCTATGGCGGAGAC-3' ; NPY , (înainte) 5'-CCGCTCTGCGACACTACAT-3 ' și (invers) 5'-TGTCTCAGGGCTGGATCTCT-3' ; GAPDH, (înainte) 5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3 ' și (invers) 5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3' . Produsele PCR au fost cuantificate utilizând software-ul LightCycler 480.Cantitatea de ARNm țintă în grupul experimental relativ la cea din grupul martor a fost determinată din valorile de fluorescență și de prag (CT) rezultate utilizând metoda 2- ΔΔCT [ 33 ].
Hibridizarea in situ
Hibridizarea in situ a fost realizată așa cum s-a descris mai înainte [ 10 , 34 ]. Pe scurt, s-au preparat secțiuni de creier coronat grosime de 12 um înghețate într-un criostat la -20 ° C, dezghețate și montate pe diapozitive acoperite cu gelatină / crom de aluminiu. Nucleul paraventricular (PVN), nucleul arcuat (ARC) și zona hipotalamică laterală (LHA) au fost identificate conform atlasului Paxinos și Watson [ 35 ] și confirmate prin microscopie. Hibridizarea a fost realizată sub o acoperitoare Nescofilm (Bando Chemical IMD, Osaka, Japonia). [35S] marcat 3′-end-deoxyoligonucleotides complementare transcrieri care codifică NPY (5'-GGAGTAGTATCTGGCCATGTCCTCTGCTGGCGCGTC-3'), proteina agouti-asociată (AgRP; 5'-CGACGCGGAGAACGAGACTCGCGGTTCTGTGGATCTAGCACCTCTGCC-3'), proopiomelanocortin (POMC; 5'-CTTCTTGCCCAGCGGCTTGCCCCAGCAGAAGTGCTCCATGGACTAGGA-3'), cocaină și-amfetamina reglementate transcript (CART; 5'-TGGGGACTTGGCCGTACTTCTTCTCATAGATCGGAATGC-3'), orexin (5'-TTCGTAGAGACGGCAGGAACACGTCTTCTGGCGACA-3'), de eliberare a corticotropinei hormonului (CRH; 5'-CAGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGCTGAGCTAACTGCTCTGCCCTGGC-3'), hormonul de eliberare a tirotropinei (TRH; 5'-GTCTTTTTCCTCCTCCTCCCTTTTGCCTGGATGCTGCGCTTTTGTGAT-3' ) și hormonul de concentrare a melaninei ( MCH ; 5'-CCAACAGGGTCGGTAGACTCGTCCCAGCAT-3' ) au fost utilizați ca probe specifice genei.
Au fost utilizate numerele totale de 6×105 cpm / diapozitiv pentru NPY, AgPR, POMC, CART, MCH, TRH și CRH și 4×105 cpm / diapozitiv pentru orexină. Secțiunile hibridizate care conțin regiunile ARC, LHA și PVN au fost expuse filmului autoradiografic (Hyperfilm; Amersham, Buckinghamshire, UK) timp de 4 zile pentru orexină și 7 zile pentru NYP, AgRP, POMC, CART, MCH și CRH. Imaginile autoradiografice au fost capturate la 40x mărire și cuantificate folosind un analizor MCID imagistic (Imaging Research, St. Catherines, ON, Canada). Absorbanța medie a fost măsurată și comparată cu eșantioanele microscale de 14 C expuse simultan (Amersham). Curba standard a fost adaptată în funcție de absorbția microscalelor de 14 C pe același film.
Evaluarea semnalizării ghrelinelor utilizând sistemul CellKey
Măsurarea semnalizării ghrelinelor de către sistemul CellKey (MDS Sciex, Ontario, Canada) a fost efectuată utilizând metodele descrise anterior [ 36 ]. Pe scurt, o placă CellKey cu 96 de godeuri a fost spălată cu apă sterilă timp de 1 oră după acoperirea suprafeței cu poli- d- lizină. Celulele HEK293A care exprimă GHS-R au fost însămânțate la o densitate de 25.000 celule / godeu și incubate sub o atmosferă de 5% C02 la 37 ° C. Celulele au fost tratate cu vehicul sau ghrelin la 28 ° C. Ghrelin a fost preparat la o concentrație finală de 10x ( 10-10 , 3×10-10 și 10-9 M) diluată cu soluție salină echilibrată Hank (1,3 mM CaCI2 2H2O, 0,81 mM MgS04, 5,4 mM KCI, 0,44 mM KH2P04, 4,2 mM NaHC03, 136,9 mM NaCI, 0,34 mM Na2HP04 și 5,6 mM d- glucoză) conținând 20 mM acid 4- (2-hidroxietil) -1-piperazetansulfonic (HEPES). Plăcile celulare s-au spălat de trei ori cu pH 7,4. Soluția salină echilibrată Hank conținând 20 mM HEPES (HHBS) și 135 pL HHBS s-a adăugat la fiecare godeu. Plăcile au fost lăsate să se echilibreze la 28 ° C timp de 30 de minute. O linie de bază a fost stabilită timp de 5 minute, s-a adăugat 15 ui de soluție de ghrelin sau vehicul (HHBS), iar impedanța dintre electrozii a fost măsurată la fiecare 10 s timp de 15 minute pentru a măsura semnalizarea ghrelinică. Pentru a evalua efectele RKT asupra activării semnalizării ghrelinice, s-au adăugat 135 pl soluție RKT (10 pg / ml) la plăci după spălarea finală și s-au lăsat să se echilibreze la 28 ° C timp de 1 oră în dispozitivul CellKey. Impedanța a fost apoi măsurată după adăugarea soluției de ghrelin sau a vehiculului.
Efectele hrănirii pe termen lung a unei diete care conține RKT asupra anorexiei în modelul CC
Șobolanii au fost împărțiți în trei grupe: un grup care nu poartă tumori (control + CE-2), un grup de control al grupului tumoral (85As2 + CE-2) și un grup de tratament (85As2 + RKT-1%). Șobolanii au fost implantați sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 106 celule / sit) în ziua 0 ca șobolani care poartă tumoare. Șobolanii inoculați cu soluție salină servesc ca grup de control care nu poartă tumori. Grupul de tratament a fost alimentat cu o dietă RKT-1% (dieta CE-2 conținând 1% RKT) cu acces ad libitum în timpul experimentului (din ziua -7 până în ziua 28). Grupul de control al tumorii și cel care nu poartă tumori a fost alimentat cu CE-2 în aceeași perioadă. Volumul tumoral, consumul mediu zilnic de hrană și greutatea corporală au fost măsurate săptămânal în această perioadă.
analize statistice
Toate datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând testele teste ale lui Aspin-Welch, t- testele pereche, analiza unică a varianței (ANOVA), urmate de testele comparative multiple ale lui Dunnett, ANOVA cu o singură cale, urmate de testele comparative multiple ale lui Bonferroni post- hoc sau două – în repetate rânduri, ANOVA, urmată de teste Bonferroni post-hoc. Nivelul de semnificație α a fost stabilit la 0,05, iar diferențele cu o valoare pbidirecțională de mai puțin de 0,05 au fost considerate semnificative. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând GraphPad Prism versiunea 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA).
Rezultate
Caracterizarea modelului de șobolan CC indus de 85As2 comparativ cu șobolanii hrăniți cu perechi
Greutatea corporală și consumul de alimente și apă au fost examinate la șobolani până la 14 zile după tratamentul cu 85As2 (sau vehicul) sau la începutul hrănirii cu perechi. Implantarea subcutanată a celulelor 85As2 a determinat creșterea progresivă a tumorii la șobolani; volumele tumorale și greutățile la 14 zile după implantarea celulelor 85As2 sunt prezentate în Tabelul 1 . Greutățile corporale ale șobolanilor care nu suferă de tumori au continuat să crească în timpul experimentului, în timp ce greutățile corporale ale șobolanilor din grupurile 85As2 și cele alimentate cu perechi nu au fost. Măsurile repetate în două direcții ANOVA ale greutăților corporale în toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale timpului (F) (F (14, 210) = 34.98, p <0.0001) și interacțiunea de tratament (grup) 22,59, p <0,0001], dar nu și tratamentul [F (2, 210) = 2,789, nu semnificativ (ns)]. Greutățile corporale ale șobolanilor din grupul 85As2 în ziua 10 au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul martor, iar după aceea, diferențele au crescut treptat (măsurători repetate ANOVA, urmate de teste Bonferroni post-hoc, ziua 10: p <0,05 , ziua 11: p <0,01, zilele 12-14: p <0,001; Pe de altă parte, șobolanii hrăniți cu perechi au prezentat modificări ale greutății corporale în timp, similare cu cele din șobolanii CC induși de 85As2, iar greutatea corporală a acestora a fost semnificativ mai mică decât cea din grupul de control (măsurători repetate ANOVA, hoc teste Bonferroni, ziua 10: p <0,05; zilele 11-12: p <0,01; zilele 13-14: p <0,001; Fig. 1A ). Reducerea consumului alimentar a fost observată în grupul 85As2 în comparație cu grupul martor; prin urmare, aportul alimentar în grupul alimentat cu perechi a fost redus similar cu cel din grupul 85As2. Măsurile repetate în două direcții ANOVA privind aportul alimentar la toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului [F (2, 210) = 35,05, p <0,0001], timpul [F (14, 210) = 31,50, p <0,0001] × timp de interacțiune [F (28, 210) = 7,26, p <0,0001]. Reducerea consumului alimentar în grupul 85As2 în comparație cu animalele de control a fost observată la 6 zile după implantare, iar diferența a devenit mai mare cu 8 zile mai târziu. Ulterior, reducerea a fost stabilă și persistată (măsurători repetate în două direcții ANOVA urmate de teste post-hoc Bonferroni, zilele 6-7: p <0,01, zilele 8-14: p <0,001; Similar cu observarea la șobolanii CC indus de 85As2, aportul alimentar la șobolanii hrăniți cu perechi a fost semnificativ redus (măsurători repetate în două sensuri ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni, zilele 6, 8 și 14: p <0,01; și 9-13: p <0,001; Fig. 1B ). În plus, mușchii (mai mare pectoral, gastrocnemius și tibialis anterior), țesutul adipos (grăsime epididimală și mesenterială), greutatea ficatului, splinei și a rinichilor au fost substanțial reduse atât la șobolanii CC hrăniți cu perechi cât și 85As2, comparativ cu șobolanii de control Tabelul 1 ). Nivelurile de glucoză din plasmă au fost, de asemenea, semnificativ mai scăzute atât la șobolanii hrăniți cu perechi, cât și la șobolanii CC decât la șobolanii control. Greutatea corporală, după scăderea greutății tumorii, a fost mai scăzută în cazul cachectic decât în cazul șobolanilor hrăniți cu perechi. În plus, greutatea mai mare a mușchilor pectorali în grupul 85As2 a fost semnificativ mai mică decât cea din grupul hrănit cu perechi. Aportul de apă a fost redus în grupul 85As2 comparativ cu cel din grupul martor și a fost ușor redus în grupul hrănit cu perechi. Măsurile repetate în două direcții ANOVA privind aportul de apă în toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului [F (2, 210) = 8,744, p <0,01], timpul [F (14, 210) = 26,17, p <0,0001] × timp de interacțiune [F (28, 210) = 4.318, p <0.0001]. Reducerea șobolanilor CC a fost semnificativă, stabilă și persistentă (măsurători repetate în două direcții ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni, zile 7-8: p <0,01, zile 9-14: p<0,001; Cu toate acestea, spre deosebire de șobolanii CC, aportul de apă la șobolanii hrăniți cu perechi a prezentat o reducere semnificativă numai în ziua 14.
tabelul 1
| Control | 85As2 | -Pair hrănite | ||
|---|---|---|---|---|
| Greutatea tumorii (TW) | 0,00 ± 0,00 | 2,46 ± 0,42 | 0,00 ± 0,00 | |
| Volumul tumorii | 0,00 ± 0,00 | 7,71 ± 1,51 | 0,00 ± 0,00 | |
| Greutatea corporală (BW) | 229,53 ± 4,47 | 195,13 ± 5,83 ** | 196,36 ± 2,99 *** | |
| BW-TW | 229,53 ± 4,47 | 192,67 ± 6,02 *** | 196,36 ± 2,99 *** | |
| BW (pre-inoculare) | 191,70 ± 5,47 | 191,63 ± 4,67 | 191,32 ± 5,56 | |
| % Schimbare (post / pre) | 119,93 ± 1,84 | 100,62 ± 2,87 *** | 101,93 ± 1,89 *** | |
| Greutăți musculare | ||||
| Mai mare pectoral | 2,22 ± 0,13 | 1,80 ± 0,03 * | 1,93 ± 0,04 # | |
| gastrocnemian | 1,24 ± 0,03 | 1,06 ± 0,03 ** | 1,08 ± 0,02 *** | |
| Tibialis anterior | 0,46 ± 0,01 | 0,39 ± 0,02 ** | 0,40 ± 0,01 ** | |
| solear | 0,07 ± 0,01 | 0,07 ± 0,00 | 0,07 ± 0,00 | |
| Total mușchi | 5,76 ± 0,19 | 4,84 ± 0,12 ** | 5,03 ± 0,09 * | |
| Greutăți de grăsime | ||||
| epididim | 2,31 ± 0,19 | 1,70 ± 0,08 * | 1,80 ± 0,11 * | |
| perirenal | 1,63 ± 0,25 | 0,98 ± 0,10 | 1,05 ± 0,19 | |
| mezenterului | 1,52 ± 0,16 | 0,76 ± 0,03 ** | 0,88 ± 0,15 * | |
| Grăsime totală | 5,46 ± 0,56 | 3,45 ± 0,20 * | 3,73 ± 0,44 * | |
| Greutăți de organe | ||||
| Ficat | 10,15 ± 0,23 | 7,73 ± 0,30 *** | 7,72 ± 0,15 *** | |
| Splină | 0,57 ± 0,02 | 0,46 ± 0,03 * | 0,48 ± 0,02 * | |
| Rinichi | 2,25 ± 0,12 | 1,91 ± 0,07 * | 1,92 ± 0,03 * | |
| Plasma glucoză | 142,67 ± 2,40 | 131,50 ± 1,93 *** | 130,83 ± 3,56 ** |
Șobolanii au fost inoculate cu celule sc A 85As2 (1 x 10 7 celule / sau site – ul) , injectat cu soluție salină în ambele flancuri. Datele sunt exprimate ca media ± SEM a șase șobolani. Toate datele privind greutatea sunt exprimate în grame. Datele privind glucoza din plasmă sunt exprimate în mg / dl. Volumul tumorii a fost estimată utilizând următoarea ecuație: volumul tumorii (cm 3) = axa principală (cm) × axa minoră (cm) × axa minoră (cm) × 1/2. Tumoarea și volumul tumoral sunt exprimate ca total pentru ambele situsuri. Greutățile corporale și țesuturile au fost măsurate în ziua 14 (85As2 și grupurile de control) sau 15 (grup de hrană cu perechi). % Schimbare = greutate corporală fără tumori (BW-TW) în ziua 14 sau 15 / greutate corporală pre-inoculare cu celule 85As2 sau soluție salină în ziua 0 x 100. Valorile pentru țesuturile musculare bilaterale reprezintă media celor pentru cele două țesuturi unilaterale. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate folosind Aspin-Welch t – test.
* p <0,05,
** p <0,01,
*** p <0,001 față de grupul de control,
# p <0,05 față de grupul 85As2.
Schimbări în greutatea corporală (A), (B) consumul de alimente și (C) consumul de apă. Șobolanii au fost inoculați subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / locului) in ziua 0. Șobolani inoculați cu solutie salina a servit ca un grup de control non-tumorale purtătoare. Șobolanii hrăniți cu perechi au primit o cantitate de alimente care a fost aceeași cu cea consumată de șobolanii CC indusă de 85As2 pentru ziua precedentă (zilele 1-15). Fiecare punct de date reprezintă media ± SEM a șase șobolani. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând măsurători repetate ANOVA, urmate de teste Bonferroni post-hoc; * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 comparativ cu grupul de control corespunzător.
nivelele mRNA ale peptidei hrănite hipotalamice hrănite au fost evaluate la 14 zile după implantarea celulelor 85As2. One-way ANOVA a expresiei POMC și MCH mRNA în toate grupurile a relevat efecte semnificative [ POMC , F (2, 15) = 23,98, p <0,0001; MCH , F (2, 15) = 12,42, p <0,001]. Nivelurile mRNA ale POMC în ARC și MCH în LHA au fost semnificativ mai mici la șobolanii CC indusă de 85As2 decât la șobolanii de control (ANOVA cu o singură cale urmată de testele de comparație multiplă Bonferroni post-hoc, p <0,001, respectiv p <0,01 ; figura 2 ). One-way ANOVA a NPY, Expresia AgRP , CART , ORX , CRH și TRH mRNA în toate grupurile nu a evidențiat efecte semnificative [ NPY , F (2, 15) = 2.611, n . s .; AgRP , F (2, 15) = 2,349, n . s .; CART , F (2, 15) = 3,385, n . s .; ORX , F (2, 15) = 0,7201, n . s .; CRH , F (2, 15) = 0,1887, n . s .; TRH , F (2, 15) = 0,9264,n . s .]. nivelele mRNA ale NPY , AgRP și CART în ARC, ORX în LHA și CRH și TRH în PVN nu au fost diferite de cele ale șobolanilor de control. Pe de altă parte, la șobolanii hrăniți-pereche, nivelurile de expresie ale tuturor peptidelor expuse variații similare celor la șobolanii CC ( POMC , p <0,001; MCH , p <0,001, NPY , n . S ;. AgRP , n . S . ; COȘUL , n. s .; ORX , n . s .; CRH , n . s .; TRH , n . s ., cu o singură cale ANOVA, urmată de testele comparative multiple ale lui Bonferroni post-hoc; Fig. 2 ).
Șobolanii au fost inoculați subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / locului) in ziua 0. Șobolani inoculați cu solutie salina a servit ca un grup de control non-tumorale purtătoare. Șobolanii hrăniți cu perechi au primit o cantitate de alimente care a fost aceeași cu cea consumată de șobolanii CC indus de 85As2 în ziua precedentă (zilele 1-15). Hibridizarea in situ a fost efectuată la 2 săptămâni după implantare (șobolani hrăniți cu perechi: ziua 15). Autoradiografii reprezentative ale secțiunilor hibridizate cu secvențe 35Sondă de oligodeoxinucleotidă marcată cu S complementară la ARNm relevant. Intensitatea semnalului a variat de la mare (negru) la joasă (alb). Bara neagră = 1 mm. Fiecare coloană reprezintă media ± SEM a șase șobolani. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând ANOVA cu o singură cale urmată de teste Bonferroni post-hoc; ** p <0,01, *** p <0,001 comparativ cu grupul de control corespunzător.
Atenuarea efectelor orexigene induse de ghrelin la șobolanii CC indus de 85As2
Reacțiile orexigene induse de ghrelin au fost examinate la șobolani timp de 2 săptămâni (ziua 14) după tratamentul cu 85As2 sau vehicul. Creștere a tumorii (4,32 ± 0,45 cm 3 ) și cașexie simptome, cum ar fi pierderea de greutate corporală și anorexie, au fost induse la sobolani implantat cu celule 85As2 (greutate corporală: grup de control, 238.90 ± 2,85 g, grupa 85As2, 188.68 ± 3,39 g, p <0,001; alimentar aportul zilnic: lotul martor, 22,79 ± 0,42 g, grupa 85As2, 15,31 ± 1,32 g, p <0,001; aportul zilnic de apă: grup de control, 27,99 ± 0,84 ml, grupa 85As2, 18,70 ± 0,48 ml, p <0,001 , măsurători repetate în două direcții ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni), care este în concordanță cu cele precedente [ 10 ] și prezente ( Fig. 1). La șobolanii care nu sufereau de tumori, injecția ip a ghrelinului a indus o creștere semnificativă a consumului de alimente timp de 1 oră în comparație cu injectarea în vehicul (salină) (testul t- pair, p <0,05). Cu toate acestea, la șobolanii CC care poartă 85As2, injectarea ip a ghrelinului nu a modificat consumul de alimente timp de 1 oră în comparație cu injecția vehiculului ( Fig. 3A ). În contrast, nu au existat diferențe în aportul de apă de 1 oră după injectarea ip a ghrelinului între grupuri ( Fig. 3B ). Pe de altă parte, măsurătorile repetate în ambele sensuri, ANOVA, pentru aportul alimentar de o oră nu au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului (grup) [F (1, 8) = 0,4732, n . s .], injectarea [F (1, 8) = 1,121, n . s.] și interacțiunea de tratament × injectare [F (1, 8) = 1.425, n . s .]. În plus, măsurătorile repetate în două direcții ANOVA de admisie de apă de o oră nu au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului (grup) [F (1, 8) = 4.468, n . s .], injectare [F (1, 8) = 1,518, n . s .] și interacțiunea de tratament x injectare [F (1, 8) = 0,05166, n . s .].
(A) consumul de alimente și (B) aportul de apă după injectarea ip a ghrelinului sau vehiculului. Șobolanii au fost inoculați subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / locului) in ziua 0. Șobolani inoculați cu solutie salina a servit ca un grup de control non-tumorale purtătoare. Șobolanii s-au injectat ip cu 10 nmol ghrelin și s-au măsurat consumul de alimente și apa de 1 h în ziua 14. Fiecare coloană reprezintă media ± SEM a cinci șobolani. Diferențele dintre vehicul și ghrelin în fiecare grup au fost evaluate folosind t-teste asociate .
Îmbunătățirea semnalizării ghrelinelor prin RKT în celulele HEK293A care exprimă GHS-R
Stimularea ghrelină în celulele HEK293A care exprimă GHS-R a determinat modificări ale impedanței specifice proteinei Gq într-o manieră dependentă de concentrație ( fig.4A și 4B ). Schimbările de impedanță induse de ghrelin de 3 x 10-10 M au fost îmbunătățite prin pretratarea cu 10 ug / ml RKT ( Fig. 4C ); RKT a îmbunătățit răspunsul de semnalizare ghrelin până la 160% ± 11,9% ( Fig. 4D ). Măsurile repetate în două direcții ANOVA ale răspunsului la semnalizarea ghrelinului au evidențiat efecte semnificative ale medicamentului (cu sau fără RKT) [F (1, 10) = 13,06, p <0,01], tratamentul (cu sau fără ghrelină) [F ) = 235,1, p <0,0001] și interacțiunea cu medicamentul x [F (1, 10) = 16,57, p<0,01]. Amplificarea răspunsului de semnalizare ghrelin prin RKT a fost semnificativă (măsurători repetate în două direcții ANOVA urmate de teste post-hoc Bonferroni, p <0,01; Fig. 4D ).
(A) schimbările dependente de timp impedanta induse prin stimularea cu ghrelin la diferite concentrații (10 -10, 3 x 10 -10 , sau 10 -9 M) în celulele care exprimă HEK293A GHS-R. (B) Răspuns la 3×10-10 M ghrelin la 10 min după injectare. (C) Modificări dependente de timp în răspuns la 3 x 10 -10 M ghrelin la 60 min după pre-tratament cu 10 ug / ml RKT. (D) Răspunsuri la 3 x 10 -10 M ghrelin la 10 min după injectare. Fiecare coloană reprezintă media ± SEM a șase determinări. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând măsurători repetate ANOVA, urmate de teste post-hip Bonferroni. RKT: rikkunshito; GHS-R: receptor de secreție de hormon de creștere.
Ameliorarea rezistenței ghrelin la șobolanii CC indusă de 85As2 de către RKT
La șobolanii implantați cu 85As2, simptomele de cașexie, cum ar fi pierderea în greutate corporală și anorexia, s-au dezvoltat clar în ziua 14 după implantare (greutatea corporală: grupul Control + DW, 227,7 ± 5,1 g, grupul 85As2 + DW, 186,7 ± 6,7 g, 85As2 + RKT, 189,6 ± 7,8 g, p <0,001, p <0,01 față de Control + DW și, respectiv, consumul zilnic de alimente: grupul Control + DW, 22,12 ± 0,58 g, grupul 85As2 + DW 14,91 ± 1,36 g, 85As2 + RKT grup, 14,24 ± 1,04 g; p <0,001, p <0,001 versus control + DW, respectiv) , în concordanță cu alte descoperirile noastre (Figurile (Figs11 și and3).3). Ulterior, șobolanilor li s-a administrat RKT sau DW timp de 7 zile. La șobolanii care nu poartă tumori (Control + DW), injectarea ip a ghrelinului a determinat o creștere semnificativă a consumului de alimente timp de o oră în comparație cu injectarea vehiculului (teste t-perete, p <0,05, figura 5A ). Dimpotrivă, la șobolanii cu CC 85As2 (85As2 + DW), injecția ip a ghrelinului a crescut cu mult aportul alimentar de 1 h comparativ cu injectarea vehiculului. Măsurile repetate în două direcții ANOVA pentru aportul alimentar de o oră în toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale injectării ip [F (1, 14) = 5.502, p <0.05] și tratament (grup) [F (2, 14) = 4.606, p<0,05], dar nu injectarea ip × interacțiunea tratamentului [F (2, 14) = 1,953, ns]. Diferența dintre grupul ghrelin Control + DW + și ghrelinul 85As2 + DW + a fost semnificativă (măsurători repetate în două direcții ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni, p <0,01; Fig. 5A ). RKT a blocat, parțial, dar nu în mod semnificativ, scăderea aportului alimentar de 1 h indusă de ghrelin la șobolanii CC care poartă 85As2 ( Fig. 5A ). Nu au existat diferențe semnificative între grupul 85As2 + RKT și șobolanii care nu poartă tumori (Control + DW). Ulterior, aportul de alimente după injectarea ghrelinului a fost măsurat până la 22 ore. Spre deosebire de aportul alimentar de o oră, nu au existat diferențe între vehicul și ghrelin în toate grupurile (pereche t(teste, ns), care arată că efectele injectării ghrelinului au dispărut rapid (în 1-2 ore de la rezultatele preliminare). Măsurile repetate în două direcții ANOVA privind aportul alimentar cumulativ de 22 ore la toate grupurile au evidențiat un efect semnificativ al tratamentului (grup) [F (2, 14) = 7,280, p<0,01], dar nu și injecția ip [F (1, 14) = 0,1694, ns] și ip injectare x interacțiune de tratament [F (2, 14) = 0,00446, ns]. La șobolani CC 85As2 (85As2 + DW), aportul alimentar de 22 ore după injectarea ip atât a vehiculului, cât și a ghrelinului a fost semnificativ mai scăzut comparativ cu cel al șobolanilor care nu sufereau de tumori (admisie de 22 de ore după injectarea vehiculului: Control + DW, 21,28 ± 1,13 g, 85,32 ± DW, 14,33 ± 1,19 g, consum de alimente timp de 22 de ore după injectarea de ghrelin: Control + DW, 21,61 ± 0,82 g, 85As2 + DW, 14,78 ± 1,25 g, prin teste post-hoc Bonferroni, p <0,01, p <0,05, respectiv; Fig. 5B). RKT a redus, parțial, dar nu semnificativ, scăderea aportului alimentar de 22 de ore la șobolanii cu CC 85As2 (85As2 + RKT, 17,45 ± 1,10 g, 17,69 ± 2,44 g, vehicul și ghrelin, respectiv, Fig.5B).
(A) Efectele RKT asupra efectelor orexigene induse de ghrelin atenuat (creșterea aportului alimentar de o oră) la șobolanii CC indus de 85As2. (B) consumul cumulativ de hrană (22 ore) după injectarea vehiculului sau ghrelină în toate grupurile. Șobolanii au fost implantate sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7celule / sit). La două săptămâni după implantare, RKT (1 g / kg / zi) sau DW a fost administrat pe cale orală de două ori pe zi timp de 7 zile. Șobolanii inoculați cu soluție salină au servit ca grup de control care nu poartă tumori și au fost administrați DW. Șobolanii au fost injectați ip cu ghrelin (10 nmoli) după administrarea RKT sau DW timp de 7 zile, și s-au măsurat consumul de alimente timp de 1 oră și adaosul alimentar cumulativ de 22 ore. A doua zi, toți șobolanii au fost injectați ip cu vehicul (soluție salină) ca martor, și s-au măsurat aportul de alimente 1 h și 22 ore. Fiecare coloană de date reprezintă media ± SEM a 5-6 șobolani. Diferențele dintre tratamentele cu vehicul și ghrelin în fiecare grup au fost evaluate utilizând t- teste asociate . Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând măsurători repetate ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni; * p <0,05, **p <0,01 față de grupul tratat cu Control + DW. RKT: rikkunshito; DW: apă distilată.
Efectele RKT asupra simptomelor de anorexie-cașexie, a nivelurilor de ghrelină plasmatică și a expresiei genei GHS-R și NPY hipotalamice la șobolanii indusă de 85As2
CC clar dezvoltat în ziua 14, adică la 2 săptămâni după implantarea celulelor 85As2 ( S1 Fig ); după acest timp, șobolanilor li s-a administrat RKT sau DW timp de 7 zile. În grupul implantat cu 85As2, în timpul experimentului sa observat o creștere progresivă a tumorii, iar RKT nu a afectat volumul tumorii ( Fig. 6A). Măsurile repetate în două direcții ANOVA ale volumului tumorii au relevat efecte semnificative ale timpului [F (3, 81) = 149,8, p <0,001], dar nu tratamentul [F (1, 81) = 0,001769, ns] F (3, 81) = 0,1338, ns]. Greutățile corporale ale șobolanilor din grupul Control + DW au continuat să crească în comparație cu cele din ambele grupuri 85As2 + DW și 85As2 + RKT în timpul experimentului ( Fig. 6B). Măsurile repetate în două direcții ANOVA a greutăților corporale în toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului (grup) [F (2, 294) = 25,97, p <0,001], timp [F (14, 294) = 15.96, p < și interacțiunea de tratament × timp [F (14, 294) = 21,24, p <0,0001]. Greutățile corporale ale șobolanilor din grupul Control + DW au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul 85As2 + DW (măsurători repetate ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni, zilele 16-21: p <0,001; Fig. 6B ); ajungând la 105,6% ± 0,5% în ziua 21 și au fost semnificativ crescute în comparație cu cele de dinainte de administrare [perechi t -tests, Pre (ziua 14) , comparativ cu post (ziua 21): p <0,001;Fig. 6C )]. În contrast, greutățile corporale ale șobolanilor din grupul 85As2 + DWscăzut treptat, ajungând la 97,8% ± 0,7% în ziua 21,arată scăderi semnificative comparativ cu cele înainteadministrare (pereche t -tests, Pre versus Post: p <0.01 ,Figura 6C ). Dimpotrivă, greutățile corporale ale șobolanilor din grupul 85As2 + RKT nu au fost modificate comparativ cu cele înainte de administrare, măsurând 99,6% ± 0,8% în ziua 21 (figurile6B și 6C). Astfel, administrarea RKT ameliorează pierderea în greutate corporală.
Schimbări în volumul tumorii (A) în timp și (B) greutatea corporală după administrarea RKT sau DW. Compararea câștigului de greutate corporală (C) și a creșterii (D) a aportului mediu zilnic de hrană înainte și după administrarea RKT sau DW la șobolani individuali. Șobolanii s- au implantat subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / locului) în ziua 0. RKT (1 g / kg / zi) sau DW a fost administrat oral de două ori pe zi , timp de 7 zile de la ziua 14. Rats inoculați cu salina a servit ca un grup de control care nu poartă tumori și au fost administrate DW. Fiecare punct de date reprezintă media ± SEM de 14-16 șobolani. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând măsurători repetate ANOVA, urmate de teste Bonferroni post-hoc; *** p<0,001 față de grupul tratat cu 85As2 + DW (B). Diferențele înainte de (pre) și după (post) administrarea RKT sau DW au fost evaluate folosind t- teste pereche ; ## p <0.01, ### p <0,001 comparativ cu grupul corespunzător înainte de administrare (fiecare sistem de referință a fost stabilită ca 0) (C, D). Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând ANOVA într-o singură direcție, urmată de testele de comparație multiple Dunnett post-hoc; ** p <0,01 față de grupul tratat cu 85As2 + DW (D). RKT: rikkunshito; DW: apă distilată; ns: nu este semnificativ.
Atât în grupul 85As2 + DW, cât și în grupul 85As2 + RKT, consumul zilnic de alimente înainte de administrare a scăzut semnificativ la 2 săptămâni după implantare comparativ cu cel din grupul Control + DW ( S1 Fig ). Ulterior, în grupul 85As2 + RKT, consumul mediu zilnic de alimente după administrarea din ziua 16 până la 21 a crescut semnificativ comparativ cu cel anterior administrării ( t- teste perechi , p<0,001; Fig. 6D ), în timp ce cele ale grupului Control + DW și grupe 85As2 + DW au prezentat doar creșteri foarte ușoare (zilnic câștig aportul alimentar: control + grup DW, 0,20 ± 0,34 g; 85As2 + grup DW, 0,22 ± 0,52 g; 85As2 + grupa RKT, 2,38 ± 0,55 g; Fig 6D). One-way ANOVA a câștigului mediu zilnic de aport alimentar în toate grupurile a evidențiat efecte semnificative [F (2, 42) = 6,839, p <0,01]. Diferențele dintre grupurile 85As2 + DW și 85As2 + RKT au fost semnificative (ANOVA cu o singură cale, urmată de testele de comparație Dunnett post-hoc multiple, p <0,01; Fig. 6D ).
In 85As2 + DW grup, mușchi (mai mare pectoral, gastrocnemian, solear si tibial anterior), țesutul adipos (epididimului, perirenal și grăsime mezenterului), ficatului și splinei greutăți a scăzut substanțial în comparație cu cei din grupul de control + DW ( Tabelul 2 ). Aceste scăderi cauzate de cașexie păreau mai mari decât cele din grupul 85As2 din Tabelul 1, deoarece creșterea tumorii și cachexia au progresat mult mai mult în decurs de 21 de zile de la 14 zile. Tratamentul cu RKT a crescut semnificativ masele musculare pectorale și greutățile totale ale mușchilor în comparație cu cele din grupul 85As2 + DW ( test t -Aspin-Welch , p <0,05, Tabelul 2 ).
masa 2
| Control + DW | 85As2 + DW | 85As2 + RKT | ||
|---|---|---|---|---|
| Greutatea tumorii (TW) | 0,00 ± 0,00 | 7,74 ± 0,47 | 7,76 ± 0,72 | |
| Volumul tumorii | 0,00 ± 0,00 | 11,03 ± 1,03 | 12,35 ± 1,37 | |
| Greutatea corporală (BW) | 252,90 ± 4,00 | 194,71 ± 3,40 *** | 198,48 ± 3,19 *** | |
| BW-TW | 252,90 ± 4,00 | 186,97 ± 3,36 *** | 190,72 ± 2,97 *** | |
| BW (pre-inoculare) | 190,78 ± 3,11 | 190,81 ± 2,78 | 189,99 ± 2,94 | |
| % Schimbare (post / pre) | 132,62 ± 1,07 | 98,02 ± 1,32 *** | 100,44 ± 1,15 *** | |
| Greutăți musculare | ||||
| Mai mare pectoral | 2,31 ± 0,07 | 1,60 ± 0,06 *** | 1,84 ± 0,08 *** , # | |
| gastrocnemian | 1,33 ± 0,02 | 1,05 ± 0,02 *** | 1,08 ± 0,02 *** | |
| Tibialis anterior | 0,50 ± 0,01 | 0,40 ± 0,01 *** | 0,42 ± 0,01 *** | |
| solear | 0,08 ± 0,00 | 0,07 ± 0,00 *** | 0,07 ± 0,00 *** | |
| Total mușchi | 6,14 ± 0,09 | 4,62 ± 0,12 *** | 5,00 ± 0,11 *** , # | |
| Greutăți de grăsime | ||||
| epididim | 3,36 ± 0,17 | 1,50 ± 0,08 *** | 1,50 ± 0,06 *** | |
| perirenal | 2,73 ± 0,16 | 0,58 ± 0,08 *** | 0,72 ± 0,06 *** | |
| mezenterului | 2,16 ± 0,10 | 0,51 ± 0,08 *** | 0,68 ± 0,07 *** | |
| Grăsime totală | 8,25 ± 0,40 | 2,58 ± 0,24 *** | 2,90 ± 0,18 *** | |
| Greutăți de organe | ||||
| Ficat | 10,27 ± 0,29 | 6,98 ± 0,22 *** | 7,43 ± 0,18 *** | |
| Splină | 0,56 ± 0,02 | 0,47 ± 0,02 *** | 0,46 ± 0,01 *** |
Șobolanii au fost implantate sc fie cu celule 85As2 (1 x 10 7 celule / locului) sau ser fiziologic , în ambele flancuri. Datele sunt exprimate ca media ± SEM de 10-12 șobolani. Toate datele privind greutatea sunt exprimate în grame. Volumul tumorii a fost estimată utilizând următoarea ecuație: volumul tumorii (cm 3 ) = axa majoră (cm) x axa minoră (cm) x axa minoră (cm) x 1/2. Tumoarea și volumul tumoral sunt exprimate ca total pentru ambele situsuri. Greutatea corporală și a țesuturilor au fost măsurate în ziua 21. Modificarea (post / pre) a fost exprimată după cum urmează:% schimbare = greutate corporală fără tumori (BW-TW) / greutate corporală preinoculare cu celule 85As2 sau salină în ziua 0 × 100. Valorile pentru țesuturile bilaterale musculare reprezintă media celor pentru cele două țesuturi unilaterale. Diferențele între grupuri au fost evaluate folosind metoda Aspin-Welch t -Test.
* p <0,05,
** p <0,01,
*** p <0,001 față de grupul Control + DW,
# p <0,05 față de grupul 85As2 + DW.
Nivelele de ghrelină plasmatică au fost semnificativ crescute la șobolanii cu CC care suferă de 85As2 comparativ cu cei din șobolanii care nu sufereau de tumori (ANOVA, F (2, 28) într-o singură direcție = 4,167, p <0,05, teste Dunnett post- p <0,05; Fig. 7A ). Spre deosebire de aceasta, administrarea RKT timp de 7 zile nu a afectat nivelele crescute de ghrelină plasmatică la șobolanii CC care poartă 85As2. Nivelurile de exprimare a genotipului GH -R ale hipotalamice nu s-au schimbat la șobolanii care poartă 85As2 comparativ cu cei din șobolanii care nu poartă tumori ( Fig. 7B ). În plus, tratamentul cu RKT nu a reușit, de asemenea, să modifice expresia acestei gene în șobolanii care purtau tumori 85As2. Hypothalamic NPYexpresia genelor nu s-a schimbat la șobolanii care sufereau de tumori 85As2 comparativ cu cei din șobolanii care nu sufereau de tumori. Cu toate acestea, tratamentul RKT a crescut semnificativ hipotalamic NPY expresia genelor la șobolani purtători de tumori 85As2 (one – way ANOVA, F (2, 30) = 3.784, p<0,05, teste multiple comparație post hoc Dunnett, p <0,01; Fig 7C ) . Într-un studiu preliminar, nivelele de mRNA ale peptidelor hipotalamice de hrănire a hranei au fost evaluate prin hibridizare in situ. În comparație cu șobolanii 85As2 CC, RKT a redus semnificativ expresia TRH în PVN și a crescut expresia NPY în ARC; totuși, această ultimă diferență nu a fost semnificativă ( S2 Fig ).
(A) nivelele de ghrelină plasmatică și (B) mRNA GHS-R și (C) NPY în hipotalamus la șobolanii de control și șobolani CC indus de 85As2 cu sau fără administrare RKT la 3 săptămâni după implantare. Șobolanii s- au implantat subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / site). La două săptămâni după implantare, RKT (1 g / kg / zi) sau DW a fost administrat pe cale orală de două ori pe zi timp de 7 zile. Șobolanii inoculați cu soluție salină au servit ca grup de control care nu poartă tumori și au fost administrați DW. Probele de plasmă sau de hipotalam au fost colectate după administrarea RKT timp de 7 zile. Fiecare coloană reprezintă media ± SEM de 10-12 șobolani. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând ANOVA cu o singură cale, urmată de testele comparative Dunnett multiple. * p <0,05, **p <0,01 față de grupul tratat cu 85As2 + DW. RKT: rikkunshito; DW: apă distilată; GHS-R: receptor de secreție de hormon de creștere.
Efectele preventive ale hrănirii pe termen lung a dietei RKT asupra anorexiei în modelul CC indus de 85As2
Pentru evaluarea efectelor pe termen lung ale RKT am folosit un model în care CC a evoluat treptat. Adică, șobolanii au fost implantați cu o zecime din numărul de celule 85As2 (1 x 10 6 celule / site) utilizat în modelul CC convențional. Tumorile au crescut lent, iar simptomele de cașexie, cum ar fi pierderea în greutate corporală și anorexia, nu au fost observate la 14 zile după implantarea tumorii, spre deosebire de șobolanii inoculați cu 1 x 107 celule / sit ( Fig.8A-8C ). Măsurile repetate în două rânduri ANOVA privind greutatea corporală în toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului (grupul) [F (2.140) = 5.001, p <0.05], timp [F (5, 140) = 706.7, p < × interacțiunea timpului [F (10, 140) = 31,73, p<0,0001]. Mai mult, măsurătorile repetate cu două sensuri ANOVA ale aportului alimentar la toate grupurile au evidențiat efecte semnificative ale tratamentului [F (2140) = 3.714, p <0.05], timpul [F (5, 140) = 17.02, p <0.0001] timp de interacțiune [F (10, 140) = 5,146, p <0,0001]. În grupul de control al tumorii (85As2 + CE2), greutatea corporală și consumul alimentar zilnic au scăzut semnificativ după 21 de zile (măsurători repetate ANOVA, urmate de teste post-hoc Bonferroni, p <0,001) comparativ cu cele din care nu prezintă tumori (control + CE-2) și aceste diferențe păreau mai mari la 28 de zile (teste Bonferroni, p <0,001; fig.8B și 8C). În contrast, hrănirea a RKT-1% dieta care începe înainte de implantarea tumorii ameliorata semnificativ aportul redus de alimente în ziua 28 la șobolanii CC 85As2 induse (testele post-hoc Bonferroni, p <0,01; Fig 8C ), în timp ce tratamentul nu a afectat creșterea tumorală sau pierderea în greutate corporală la șobolanii CC ( fig.8A și 8B ).
Schimbări în volumul tumorii (A), (B) greutatea corporală și (C) consumul mediu zilnic de alimente în timpul experimentului. Șobolanii s- au implantat subcutanat cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 6 celule / fiecare loc) în ziua 0. RKT (CE-2 dietă conținând 1% RKT) sau CE-2 a fost alimentat timp de 35 de zile de la ziua -7. Șobolanii inoculați cu soluție salină servesc ca un grup de control care nu poartă tumori și au fost hrăniți în mod similar timp de 35 de zile. Fiecare punct de date reprezintă media ± SEM de 9-11 șobolani. Diferențele dintre grupuri în timpul de greutate corporală și consumul de alimente au fost evaluate utilizând măsuri repetate în două direcții ANOVA urmate de testul Bonferroni post-hoc; *** p <0,001 comparativ cu grupul Control + CE-2 corespunzător, ## p <0,01 față de grupul corespunzător 85As2 + CE-2. RKT: rikkunshito.
Discuţie
În studiul prezent, am constatat că modelul de șobolan anorexie-cachexie a cancerului, indus de celulele 85As2 derivate din cancerul gastric uman, a dezvoltat rezistența la ghrelin. Această constatare a sugerat că rezistența ghrelinului poate fi implicată în dezvoltarea anorexiei în modelul nostru CC în prezența ghrelinului plasmatic crescut. RKT, care îmbunătățește semnalizarea ghrelinelor prin GHS-R, a atenuat parțial rezistența la ghrelin și simptomele de cașexie ameliorată, cum ar fi anorexia și pierderea în greutate corporală, fără a afecta ghrelinul plasmatic crescut în model. Aceste rezultate au sugerat că mecanismele prin care RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cachexiei cancerului în acest model pot implica atenuarea rezistenței ghrelinelor, posibil prin amplificarea semnalizării ghrelinelor.
Am arătat că șobolanii implantați cu 85As2 au prezentat în mod clar simptome de cașexie reproductibilă, incluzând anorexia, pierderea în greutate corporală și țesuturile musculare și adipoase reduse, până la 14 zile după implantare. Greutățile corporale ale șobolanilor hrăniți cu perechi au fost reduse la niveluri similare cu cele ale șobolanilor de cașexie indusă de 85As2, în conformitate cu consumul scăzut de alimente. Cu toate acestea, când greutatea tumorii a fost scăzută, greutățile corporale ale șobolanilor de cașexie indusă de 85As2 au fost mai mici decât cei ai șobolanilor hrăniți cu perechi, susținută de scăderi mai mari ale țesuturilor musculare și adipoase la șobolanii CC indusă de 85As2. Diferențele în pierderile de greutate corporală dintre șobolanii hrăniți prin pereche și CC au fost probabil cauzate de alți factori decât consumul scăzut de alimente. Am demonstrat anterior că o creștere a consumului de energie a fost crescută la șobolanii CC indusă de 85As2, comparativ cu cei din șobolanii de control [10 ]. Prin urmare, creșterea consumului de energie la șobolanii cu CC indusa de 85As2 poate avea o exacerbare a pierderii în greutate corporală, inclusiv scăderea țesuturilor adipoase și musculare. Pe de altă parte, în ceea ce privește peptidele orexigene ( mRNA NPY și AgRP în mRNA ARC, ORX și MCH în LHA) sau peptide anorexigene ( ARN, PTHC și CART în ARC, CRH și TRHmRNA în PVN) în hipotalamus, nivelele ARNm au prezentat în cea mai mare parte variații similare la șobolanii CC indus de 85As2 și șobolanii hrăniți cu perechi. Prin urmare, modificările în aceste mARN peptidice hipotalamice la șobolanii CC indus de 85As2 păreau a fi implicați în reducerea consumului alimentar. Cu toate acestea, în ciuda consumului similar de alimente, aportul zilnic de apă a fost semnificativ redus la șobolanii 85As2-cachectici, în timp ce reducerea șobolanilor hrăniți cu perechi a fost minoră. Această constatare a sugerat că disfuncția în sistemul nervos central care controlează corpul lichid, cum ar fi aportul de apă atunci când percepe starea de deshidratare, poate apărea la șobolanii cachectici; cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare.
Interesant, șobolanii cu CC indusă de 85As2 la 2 săptămâni după implantare au prezentat o sensibilitate slabă la ghrelinul exogen/extern, sugerând că rezistența ghrelină sa dezvoltat în aceste condiții patologice. Ghrelinul indus de stimularea apetitului a apărut în principal prin activarea neuronilor NPY / AgRP în ARC a hipotalamusului, un situs important pentru reglarea apetitului în sistemul nervos central. Ghrelinul circulant, secretat de stomac, este transportat peste bariera hematoencefalică și se leagă de GHS-R localizat în neuronii NPY / AgRP, ducând la transmiterea semnalului către hipotalamus. Activarea GHS-R în neuronii NPY / AgRP ai hipotalamului stimulează apetitul. În plus, ghrelinul periferic se leagă de GHS-R localizat în nervul gastric aferent vagului și transmite un semnal de ghrelin către neuronii NPY / AgRP în hipotalamus [37 ]. Astfel, activarea GHS-R de către ghrelin în neuronii NPY / AgRP ai hipotalamusului prin aceste căi periferice stimulează pofta de mâncare. La șobolanii cu CC indusa de 85As2, nivelele de ghrelină din plasmă au fost semnificativ ridicate. Această constatare a fost raportată, de asemenea, la pacienții cu CC [ 20 , 21 ], care susțin rezultatele noastre. Deoarece postul și un echilibru energetic negativ cresc ghrelinul plasmatic [ 38], nivelurile ridicate de ghrelin din modelul nostru de șobolan CC ar putea fi un efect compensator ca răspuns la balanța energetică negativă. Cu toate acestea, consumul de alimente a fost în continuă scădere la șobolanii cachectici, sugerând că stimularea endogenă a ghrelinului indusă de apetitul nu a fost produsă fiziologic. Ulterior, pentru a elucida mecanismele prin care administrarea ghrelinului exogen la șobolanii cachectici nu a favorizat aportul suficient de alimente, am evaluat exprimarea genelor GHS-R în hipotalamus la șobolanii cachectici indusă de 85As2 și am constatat că GHS-Rexpresia la șobolani cachectici a fost comparabilă cu cea din șobolanii care nu poartă tumori. Prin urmare, este puțin probabil ca dezvoltarea rezistenței ghrelin la șobolanii cachectici să fie cauzată de răspunsul atenuat la ghrelin prin scăderea expresiei GHS-R.
Am constatat anterior că celulele 85As2 cultivate produc LIF, care este o citokină inflamatorie și factorul cachectic [ 7 ]. Receptorul LIF este localizat în neuronii anorexigenici POMC / CART [ 39 ]. În concordanță cu rezultatele din culturile celulare 85As2, concentrațiile plasmatice ale LIF au crescut la șobolanii care purtau 85As2 cu evoluția simptomelor de cașexie și îndepărtarea chirurgicală a tumorii nu numai că au eliminat simptomele de cașexie, dar și că au scăzut nivelurile LIF plasmatice sub limita de detecție, LIF contribuie la simptomele de cașexie în modelul CC indus de 85As2 [ 10 ]. Astfel, LIF poate contribui la rezistența ghrelină observată în CC indus de 85As2; totuși, sunt necesare studii suplimentare pentru a clarifica asocierea.
RKT este utilizat pe scară largă pentru tratamentul simptomelor disfuncției motorii gastrointestinale [ 40 ]. Sa dovedit că RKT ameliorează anorexia prin creșterea secreției de ghrelină. Takeda și colab. a raportat că RKT crește secreția de ghrelin prin antagonismul receptorului serotoninei 2b / 2c și ameliorează anorexia indusă de cisplatina medicamentului anticancer [ 25 ]. În plus, Matsumura și colab. a raportat că RKT crește concentrațiile plasmatice de ghrelină la șoareci și la oameni [ 26 ] și Arai et al. a raportat că RKT ameliorează simptomele gastrointestinale superioare la pacienții cu dispepsie funcțională însoțită de creșterea ghrelinului plasmatic [ 28 ]. Mai recent, sa demonstrat că RKT potențează semnalizarea ghrelin prin intensificarea activității GHS-R [ 29, 30 ]. În studiul de față, am investigat dacă RKT ar putea amplifica direct semnalizarea ghrelinelor utilizând sistemul CellKey, care este adaptat în mod special la detectarea receptorului cuplat cu proteine G și produce profiluri de răspuns care sunt consecvente într-o gamă largă de condiții de testare, cu capacitatea de distingând semnalele dintre subtipurile Gs, Gi / o și Gq ale proteinei Gα [ 41 , 42 ]. În plus, acest sistem permite teste nemarcate, cu celule întregi, în timp real și de mare viteză și poate fi utilizat pentru măsurarea răspunsului integrat al celulelor întregi la activarea receptorului prin măsurarea impedanței în celule [ 41]. Adică modificările impedanței în celule sunt dependente de tipul de proteină G, cuplată cu un receptor specific. GHS-R este un receptor cuplat la proteina Gq; prin urmare, stimularea ghrelină în celulele HEK293A care exprimă GHS-R a indus schimbări de impedanță specifice Gq într-o manieră dependentă de concentrație. RKT a îmbunătățit în continuare modificările impedanței induse de ghrelin, sugerând că RKT a amplificat direct semnalizarea ghrelină după legarea ghrelinului de GH-R. Acest rezultat a fost în concordanță cu rapoartele anterioare utilizând celulele care exprimă GHS-R [ 29 , 30 ].
În studiul prezent, am constatat că rezistența ghrelină sa dezvoltat la șobolani CC indusă de 85As2 la 2 săptămâni după implantare; prin urmare, am examinat dacă RKT, care îmbunătățește semnalizarea ghrelinelor, atenuează rezistența ghrelinelor. Interesant, la șobolanii cu 85As2 (DW), la 3 săptămâni după implantare, injectarea ip a ghrelin nu a crescut semnificativ consumul de alimente timp de 1 h, sugerând că dezvoltarea rezistenței ghrelinului a accelerat între 2 și 3 săptămâni după implantare. Administrarea RKT timp de 7 zile a ameliorat parțial sensibilitatea slabă la ghrelinul exogen la șobolanii cachectic la 3 săptămâni după implantare, sugerând că RKT atenuează rezistența la ghrelină. RKT a atenuat scăderea indusă de cașexie în consumul alimentar atât la o oră după injectarea de ghrelină, cât și la 22 de ore după administrarea de ghrelin sau injecție cu vehicul. Prin urmare,RKT este susceptibilă de a spori sensibilitatea la ghrelin endogen prin potențarea semnalizării ghrelinice și creșterea dozei de hrană de 22 ore, deoarece creșterea indusă de injectarea ghrelinului a avut o durată de 1-2 ore. Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,10 ].
Pe lângă efectele tratamentului cu RKT asupra cașexiei emergente, am constatat că tratamentul prealabil cu RKT începând înainte de implantarea tumorii a împiedicat anorexia în Administrarea RKT timp de 7 zile a ameliorat parțial sensibilitatea slabă la ghrelinul exogen la șobolanii cachectic la 3 săptămâni după implantare, sugerând că RKT atenuează rezistența la ghrelină. RKT a atenuat scăderea indusă de cașexie în consumul alimentar atât la o oră după injectarea de ghrelină, cât și la 22 de ore după administrarea de ghrelin sau injecție cu vehicul. Prin urmare,RKT este susceptibilă de a spori sensibilitatea la ghrelin endogen prin potențarea semnalizării ghrelinice și creșterea dozei de hrană de 22 ore, deoarece creșterea indusă de injectarea ghrelinului a avut o durată de 1-2 ore. Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,Această speculație a fost susținută de rezultatele care demonstrează că aportul mediu zilnic de hrană la șobolanii individuali a fost semnificativ crescut prin administrarea RKT. Mai mult, pierderile atât în greutatea corporală cât și în masa musculară au fost, de asemenea, atenuate după administrarea RKT, demonstrând că RKT a ameliorat simptomele anorexiei-cașexiei în modelul CC induced de 85As2,10 ]. modelul CC indus de 85As2. Cu toate acestea, ameliorarea CC prin RKT nu sa datorat creșterii secreției de ghrelină deoarece RKT nu a afectat nivelele plasmatice de ghrelină la șobolanii CC. În plus, RKT nu a afectat creșterea tumorală. De asemenea, RKT nu a modificat nivelurile plasmatice ale LIF, după cum sa raportat anterior [ 10 ]. Aceste rezultate au arătat că efectele anticachetice ale RKT nu au fost legate de regresia tumorii sau de nivelurile LIF.
Ulterior, am constatat că RKT nu a afectat expresia genică GHS-R hipotalamică la șobolanii CC indus de 85As2, sugerând că ameliorarea rezistenței ghrelin prin RKT nu se datorează creșterii expresiei GHS-R . Yakabi și colab. raportat anterior că RKT a inversat în mod semnificativ reducerea expresiei genei GHS-Rindusă de cisplatină, în timp ce RKT nu a afectat expresia GHS-R la șobolanii normali [ 43 ]. Acest rezultat a sugerat că scăderea acută a consumului de alimente indusă de cisplatină a fost implicată în reducerea GHS-Rexpresia genelor. În contrast, în studiul prezent, sa demonstrat că rezistența la ghrelin la șobolanii cachectici este implicată în răspunsul atenuat ca urmare a legării ghrelinului de GHS-R, deoarece expresia genei GHS-R la șobolanii cachectici a fost comparabilă cu cea din non-tumorale șobolani. Prin urmare, constatările noastre sugerează că ameliorarea rezistenței la ghrelin și ameliorarea anorexiei la șobolanii cachectici tratați cu RKT are loc prin amplificarea semnalizării ghrelin după legarea GHS-R mai degrabă decât prin creșterea expresiei GHS-R. Îmbunătățirea apetitului de către ghrelin este implicată în reglarea peptidei orexigene NPY. Prin urmare, am investigat efectele amplificării dependente de RKT a semnalizării ghrelin la expresia NPY hipotalamică . Am constatat că RKT a crescutExpresia NPY în hipotalamusul șobolanilor cachectici indusă de 85As2. Într-un studiu in vitro , RKT a intensificat, de asemenea, creșterea indusă de ghrelin a Ca2 + intracelulare în neuronii NPY, care exprimă GHS-R, izolat de ARC [ 29 ]. Aceste constatări sugerează că activarea neuronilor NPY prin amplificarea semnalizării ghrelin prin RKT poate contribui la ameliorarea rezistenței la ghrelin și ameliorarea anorexiei la șobolanii cachectici.
Ulterior, am examinat efectele RKT asupra peptidelor hipotalamice orexigene / anorexigenice la șobolani cachectici indusă de 85As2. Expresia mRNA NPY în ARC a fost mai mare la șobolanii cachectici tratați cu RKT decât la cei care nu au fost tratați cu RKT, deși diferența nu a fost semnificativă. Studiul nostru anterior a demonstrat că RKT a ameliorat anorexia indusă de cisplatină la șobolani și a inversat scăderea indusă de cisplatină în exprimarea genei NPY hipotalamice în ARC [ 34 ]. În studiul preliminar prezent, cu toate acestea, nu am observat aceste efecte ale RKT. În hipotalamus, atât ARC cât și PVN s-au dovedit a juca roluri importante în sporirea aportului alimentar prin administrarea de ghrelin [ 44]. Studiul preliminar a demonstrat de asemenea că RKT a scăzut semnificativ expresia genei TRH în PVN comparativ cu cea a șobolanilor CC indusă de 85As2. TRH este o peptidă anorexigenică, iar injecția centrală a TRH reduce aportul alimentar la șobolani [ 45 ]. In plus, neuronii TRH in PVN sunt dens inervate de la terminalele axon care conțin NPY ARC [ 46 – 48 ]. Mai mult, administrarea intracerebroventriculară a NPY scade expresia genei TRH în PVN [ 49 ]. Luate împreună, această reducere a TRHexpresia genelor în PVN la șobolani cachectici prin RKT poate fi parțial implicată în ameliorarea anorexiei-cașexiei prin RKT. Cu toate acestea, aceste mecanisme nu sunt încă elucidate complet și sunt necesare studii suplimentare pentru a clarifica asocierea efectelor anticachetice ale RKT și variațiile peptidelor orexigene / anorexigenice modificate de RKT în regiunea hipotalamică, inclusiv ARC, PVN și LHA. În contrast, RKT afectează direct stomacul și se cunoaște că facilitează golirea gastrică, relaxarea adaptivă gastrică și motilitatea gastrointestinală superioară [ 50 – 52 ]. Aceste efecte pot ameliora în mod sinergic casexia-anorexia.
În concluzie, am demonstrat că modelul nostru de șobolan anorexie-cachexia de cancer, indus de celulele 85As2 derivate din cancerul gastric uman, a prezentat rezistență la ghrelin, contribuind eventual la anorexie și pierderea în greutate corporală. Mecanismul prin care RKT a ameliorat simptomele cancerului anorexie-cașexie poate implica ameliorarea rezistenței ghrelinului prin îmbunătățirea semnalizării ghrelinelor. Aceste constatări sugerează că RKT poate fi un agent promițător pentru tratamentul pacienților cu CC care prezintă niveluri ridicate de ghrelin circulant.
Informatii justificative
S1 Fig
Modificări în (a) greutatea corporală și (b) consumul de alimente înainte de administrarea RKT în modelul de cașexie cauzat de 85As2.
Șobolanii au fost implantate sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / locului) in ziua 0. Șobolani inoculați cu solutie salina a servit ca un grup de control non-tumorale purtătoare. Fiecare punct sau coloană de date reprezintă media ± SEM de 14-16 șobolani. Diferențele dintre grupele de greutate corporală și consumul de alimente în timp au fost evaluate utilizând măsurători repetate ANOVA, urmate de teste Bonferroni post-hoc. ** p <0,01, *** p <0,001 față de grupul Control + DW corespunzător. RKT: rikkunshito; DW: apă distilată.
(TIFF)
S2 Fig
Efectele RKT asupra peptidelor hipotalamice orexigenice / anorexigenice la șobolanii CC indusă de 85As2.
(a) Exprimarea ARNm-urilor care codifică neuropeptida Y ( NPY ), proteina asociată cu agouti ( AgRP ), proopiomelanocortin ( POMC ) și transcripția reglementată cu cocaină și amfetamină ( CART ) în nucleul arcuat (ARC); hormonul de eliberare a corticotropinei ( CRH ) și hormonul eliberator al tireotropinei ( TRH ) în nucleul paraventricular (PVN); și orexina ( ORX ) și hormonul de concentrare a melaninei ( MCH ) în zona hipotalamică laterală (LHA) au fost măsurate prin hibridizare in situ . (b) GHS-R și (c) NPYmRNA în hipotalamus în martori și șobolani CC indus de 85As2 cu sau fără administrare RKT la 3 săptămâni după implantare. Șobolanii au fost implantate sc cu celule 85As2 în ambele flancuri (1 x 10 7 celule / site). La două săptămâni după implantare, RKT (1 g / kg / zi) sau DW a fost administrat pe cale orală de două ori pe zi timp de 7 zile. Șobolanii inoculați cu soluție salină au servit ca grup de control care nu poartă tumori și au fost administrați DW. Probele de hipotalam au fost colectate după administrarea RKT timp de 7 zile. Analizele mRNA hipotalamice care codifică peptide orexigene / anorexigenice în fiecare regiune a creierului (ARC, PVN sau LHA) au fost măsurate prin hibridizare in situ . Fiecare coloană reprezintă media ± SEM a șase șobolani. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate utilizând ANOVA cu o singură cale urmată de teste Bonferroni post-hoc; # p<0,05 față de grupul 85As2 + DW. RKT: rikkunshito; DW: apă distilată.
(TIFF)
Recunoasteri
Mulțumim colegilor din laboratorul nostru pentru asistența tehnică și comentarii utile. Am dori să mulțumim Editage ( www.editage.jp ) pentru editarea limbii engleze.
Declarație de finanțare
Sprijinul acordat de KT a fost acordat KT prin: 1. Granturi-ajutor pentru cercetare științifică (C) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei, Japonia [ http://www.jsps.go.jp/j -grantsinaid / index.html ] Grant nr. 22590510. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 2. Fundația pentru promovarea cercetării în domeniul cancerului în Japonia [ http://www.ncc.go.jp/jp/ ]. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Acordarea de sprijin a fost acordată lui Y. Uezono prin: 1. Strategia cuprinzătoare pe 10 ani pentru controlul cancerului de la Ministerul Sănătății, Muncii și Protecției Sociale, Japonia; [ http://www.mhlw.go.jp/] Grant nr. H22-General-035. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 2. Granturi-ajutor pentru cercetare științifică (C) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei, Japonia; [ http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html ] Grant nr. 24590740. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 3. Granturi din cadrul Proiectului de cercetare pentru îmbunătățirea calității în domeniul sănătății și colectarea dovezilor științifice privind medicina integrată [ http://www.amed.go.jp/] Grant nr. 15lk0310003h0001, 16lk0310020h0001. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 4. Cercetarea practică pentru controlul inovator al cancerului de la Agenția Japoneză pentru Cercetare și Dezvoltare Medicală, AMED; [ http://www.amed.go.jp/ ] Grant nr. 15ck0106059h0002, 16nk0101311h0002. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 5. Fondul Național de Cercetare și Dezvoltare al Centrului Național de Cancer [ http://www.ncc.go.jp/jp/] Grant nr. 23-A-2, 23-A-29 și 23-A-38. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. 6. Un grant de la Tsumura & Co. (Ibaraki, Japonia) [ https://www.tsumura.co.jp/ ]. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
Toate datele relevante se găsesc în fișă și în fișierele cu informații de asistență.
Referințe
Articolele de la PLoS ONE sunt oferite aici prin amabilitatea Bibliotecii Publice a Științei
(CLICK AICI)
TRATAMENTE CANCER EFICIENTE, NON - toxice 